疏水蛋白HFBI及胶原共修饰的PLGA对神经干细胞贴附和生长的影响

目的:探讨神经干细胞(NSCs)在经疏水蛋白HFBI和Ⅰ型胶原联合修饰的聚乳酸-乙醇酸(PLGA)膜上贴附和生长的可行性.方法:将神经干细胞分离、纯化及扩增后,在无血清和有血清的条件下,分别接种到PLGA膜和经疏水蛋白HFBI和Ⅰ型胶原联合修饰的PLCA膜上,观察神经干细胞的贴附、生长情况.结果:经过培养,无血清组中,在PLGA膜上没有观察到神经干细胞;在疏水蛋白HFBI与胶原联合修饰的PLGA膜上,观察到有少量的神经干细胞呈圆形状贴附,生长.血清组中,在PLGA膜以及疏水蛋白HFBI和胶原联合修饰的PLGA膜上,均观察到存在大量细胞生长,并且在疏水蛋白HFBI和胶原联合修饰的PLGA膜上,观察到更多含有突起的细胞.结论:疏水蛋白HFBI和Ⅰ型胶原联合修饰PLGA膜有利于促进神经干细胞贴壁,在血清的条件下明显促进神经干细胞生长和分化.     

纤维粘连蛋白修饰的多孔PLGA对大鼠骨髓间充质干细胞粘附和增殖的影响

目的探讨经纤维粘连蛋白(Fn)修饰的聚乙醇酸乳酸共聚物(PLGA)对骨髓间充质干细胞(MSCs)粘附和增殖的影响。方法用密度梯度离心法和贴壁培养法相结合获得SD大鼠的骨髓间充质干细胞,培养后以不同的浓度分别接种于PLGA上。其中,预先包被纤维粘连蛋白的PLGA作为实验组,未经纤维粘连蛋白修饰的作为对照组。分别于3、6、9h和7、14、21d收获细胞,通过细胞记数法测定细胞数,反映细胞的粘附和增殖情况。并通过电镜观察细胞在材料上的形态和贴附情况。结果纤维粘连蛋白能明显促进MSCs在PLGA上的粘附和增殖:在6、9h和7、14、21d时间点上实验组与对照组相比细胞数差异均有显著意义(P<0.05和P<0.01)。电镜证实实验组细胞贴附良好,为多角或梭形;对照组细胞数少,细胞铺展差,多为圆形。结论纤维粘连蛋白能促进MSCs在高分子材料上的粘附和增殖。     

神经营养素对培养的新生大鼠神经干细胞分化的影响

为了了解不同神经营养因子对体外培养不同时间的大鼠脑神经干细胞(NSCs，Neural stem cells)分化的影响，采用BDNF、GDNF、CNTF、NGF和PDGF，以及腺苷酸环化酶激动剂forskolin等对新生大鼠脑神经干细胞进行诱导。研究发现，BNDF、GDNF、CNTF对体外培养3个月内的NSCs分化为神经元均有不同程度的作用，其     

兔口腔黏膜上皮干细胞分化为角膜上皮样细胞的体外研究

目的以羊膜做载体将兔口腔黏膜上皮干细胞诱导为角膜上皮样细胞,探讨口腔黏膜上皮细胞作为种子细胞体外培养构建组织工程角膜的技术方法,为眼表重建提供材料。方法用Ⅳ型胶原黏附法分离纯化口腔黏膜上皮干细胞,对体外培养的口腔黏膜干细胞进行免疫表型鉴定。将筛选后获得的口腔黏膜上皮干细胞种植在去上皮羊膜表面体外培养,待细胞融合成单层后置入插入式培养皿中进行气液界面培养,促进细胞分化形成复层。培养数日后进行苏木素-伊红(HE)染色和免疫组织化学、光镜及透射电镜检测,观察羊膜-复层上皮组织结构,免疫荧光检测干细胞特异性标志物P63以及角膜上皮细胞标志物角蛋白3(K3)并与角膜上皮组织比较。结果体外诱导培养数天后,羊膜载体的口腔黏膜上皮细胞形成复层,在组织形态及生物学特性上与角膜上皮相似。并且组织细胞P63、K3表达明显,角膜特异性生物学标志物免疫组织化学染色呈阳性。结论在本实验的培养条件下,获得的口腔黏膜上皮干细胞可在体外培养扩增,呈克隆性生长,具有很强的增殖能力。口腔黏膜上皮干细胞体外培养可构建类角膜上皮。     

核受体相关因子1基因转染对神经干细胞体外分化的影响

目的 研究核受体相关因子1(NuRR1)基因对神经干细胞体外分化的影响.方法 收集C17.2细胞和pAdeasy-NURR1+C17.2细胞,分别滴加至皿底铺满盖玻片的7 cm培养皿中,每组10个培养皿.含血清培养液培养4 h细胞贴壁后换无血清培养基继续培养3 d,固定.分别行巢蛋白(Nestin)、神经元特异烯醇化酶(NSE)免疫组织化学检测,计数阳性细胞比例.结果 C17.2细胞、pAdeasy-NURR1+C17.2细胞体外无血清培养细胞爬片,Nestin免疫组织化学检测阳性细胞率分别为(15.25±2.45)%、(16.27±1.77)%,差异无统计学意义(P＞0.05);NSE免疫组织化学检测阳性细胞率分别为(21.48±0.72)%、(70.28±2.14)%,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 NURR1基因转染能促进C17.2神经干细胞向神经元方向分化.     

不同材料包埋的PGA支架对软骨细胞体外培养的影响

目的 比较不同材料包埋的聚羟基乙酸（PGA）作为支架体外构建组织工程软骨的效果。方法 采用卵磷脂、多聚赖氨酸及纤维粘连蛋白分别包埋PGA支架,并与软骨细胞一起体外培养,观察其亲水性的变化、对细胞生物学行为及合成细胞外基质的影响。结果 以纤维粘连蛋白包埋的PGA支架具有良好的亲水性,改善细胞生物学行为,并显著增强细胞合成细胞外基质的能力。结论 以纤维粘连蛋白包埋的PGA作为软骨组织工程技术中的支架材料,具有较大的应用前景。     

左归丸对体外培养新生大鼠海马神经干细胞增殖分化的影响

左归丸具有滋阴补肾功效。笔者的在体实验表明左旋单钠谷氨酸模拟肾阴虚证大鼠神经干细胞(Nerve Stemceu，NSC)增殖分化和凋亡与正常组有明显差异。为探讨左归丸以及左旋单钠谷氨酸所致肾阴虚模型中有关NSC增殖分化的作用及机制，本实验从神经干细胞增殖分化方面作以下探讨。     

金雀异黄酮促进体外培养大鼠骨髓间充质干细胞成骨性分化的机制研究

目的 探讨金雀异黄酮促进体外培养原代大鼠骨髓间充质干细胞(rats bone marrow mesenchymal stem cell,rBMSC)成骨性分化的机制.方法 体外分离培养rBMSC传代3次后,采用碱性磷酸酶(ALP)活性筛选金雀异黄酮最佳浓度,采用终浓度为1×10-5 mol/L的金雀异黄酮对体外培养原代rBMSC进行干预;药物干预后48和72 h采用甲基噻唑基四唑(MTT)测定细胞增殖情况;在干预后3、6、9、12和15 d测定ALP活性、钙盐沉积量;干预后24、48和96 h检测OPG和RANKL mRNA表达水平.结果 金雀异黄酮组处理rBMSC 48和72 h后光密度值高于对照组(P＜0.05);干预rBMSC 12和15 d后金雀异黄酮组ALP活性高于对照组,干预6、9、12和15 d后钙盐沉积量高于对照组,干预24、48和72 h OPG mRNA水平高于对照组,干预72 h RANKL mRNA高于对照组,干预48 h OPG/RANKL高于对照组(P＜0.05,P＜0.01).结论 1×10-5 mol/L金雀异黄酮可促进体外培养rBMSC成骨性分化,其作用可能是通过OPG/RANKL途径实现的.     

不同细胞因子组合对神经干细胞分化的影响

目的:探讨不同细胞因子组合对神经干细胞(NSCs)分化的影响。方法:采用不同组合的细胞因子(bFGF EGF; bFGF PDGF;bFGF BDNF;bFGF)分离培养大鼠海马神经干细胞,并用免疲细胞化学技术研究神经干细胞的分化情况。结果:在bFGF、bFGF EGF、bFGF BDNF及bFGF PDGF不同因子或因子组合中,均能诱导神经干细胞分化,分化后的神经元比例分别为(14.5±1.2)%、(14.7±1.8)%、(23.3±2.1)%、(35.5±2.4)%,神经干细胞的分化比例趋势为bFGF PDGF >bFGF BDNF>bFGF EGF>bFGF(P<0.05)。姑论:PDGF对bFGF促进神经干细胞向神经元定向分化有较好的协同作用。     

人胚胎神经干细胞体外培养及其增殖与分化的研究

目的 建立神经干细胞分离、培养及分化的鉴定技术，观察神经干细胞增殖、分化的特点。方法 从人胚胎海马区分离神经干细胞，采用无血清培养基，进行体外扩增培养、传代。采用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞和分化的神经细胞；利用流式细胞仪和细胞生长曲线检测神经干细胞的增殖能力。结果 从人胚胎脑海马区分离的细胞具有增殖和多向分化潜能，可进行传代培养，获得的细胞团中大部分为nestin表达阳性细胞。贴壁分化后可以出现NSE、GFAP表达阳性的细胞。结论 用上述方法分离培养的细胞能表达nestin蛋白，具有自我更新和增殖能力，并具有向神经元、星形胶质细胞分化的潜能，具备神经干细胞的特征，可用于细胞移植等相关研究。     

胚胎大鼠神经干细胞体外分化的激光共聚焦显微镜观察

目的:采用激光扫描共聚焦显微镜观察体外培养胎鼠大脑皮质神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化情况。方法:利用无血清培养方法,分离培养胚胎大鼠大脑NSCs,进行体外扩增培养、传代;采用溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)掺入、双重免疫荧光细胞化学标记方法和激光扫描共聚焦显微镜,用神经细胞的特异性抗体(神经元β-微管蛋白、胶质纤维酸性蛋白),鉴定NSCs向神经元与星形胶质细胞分化的情况。结果:从胎鼠大脑皮质及皮质下分离的组织,经原代和传代培养均可形成细胞克隆,并表达神经上皮干细胞蛋白(Nestin)抗原。在血清诱导下,分化后的细胞表达神经元、星形胶质细胞2种神经细胞的特异性抗原,NSCs分化为星形胶质细胞神经元的比例分别为(43.70±8.55)%和(23.00±3.69)%。结论:从胎鼠大脑皮质分离出的细胞可获得呈集落样生长的神经干细胞团,并能表达NSCs的特异性抗原;激光扫描共聚焦显微镜可清晰地观察到培养细胞具有分化为神经元和星形胶质细胞的潜能。     

大鼠神经干细胞和雪旺细胞体外共培养生长特性

目的：探讨雪旺细胞（SC）对神经干细胞（NSC）的生物作用，为临床移植神经细胞提供依据和方法。方法：将神经干细胞分别在有雪旺细胞骨架、分泌物及活雪旺细胞饲养层的不同环境中培养，同时设立各自对照组，观察神经干细胞迁徙、贴壁能力、分化、细胞代谢、轴突生长、免疫组化神经丝染色情况。结果：与雪旺细胞有关的实验组神经干细胞大量分化为具有细长突起的细胞，神经丝（NF）标记阳性细胞多，突起长（特别是经胎牛血清培养过的雪旺细胞实验组），细胞贴壁力强，细胞生长代谢旺盛，突起粗壮并且生长速度快。结论：雪旺细胞能促进神经干细胞分化，并促进其生长。     

胶质瘤细胞诱导神经干细胞迁移作用的实验研究

目的观察胶质瘤细胞在体外培养条件下对神经干细胞是否有诱导迁移的作用。方法①从新生1～2dSD大鼠脑皮层分离培养神经干细胞,进行神经干细胞及其增殖能力鉴定。②胶质瘤细胞与神经干细胞限定区域联合培养,观察神经干细胞的生长及其形态学变化。结果①所获得神经细胞球Nestin染色阳性,传代神经细胞球抗BrdU染色阳性。②可观察到神经干细胞球周围长出细胞突起,在靠近胶质瘤细胞的一侧,细胞突起的密度及长度均大于其他方向上的突起并且可见部分干细胞向胶质瘤细胞方向的移动。结论胶质瘤细胞在体外对神经干细胞有诱导迁移作用。     

双向电泳分析叶酸对神经干细胞蛋白表达的影响

目的:探讨叶酸缺乏对胚胎大鼠神经干细胞(NSCs)蛋白质表达的影响。方法:采用无血清体外细胞培养方法,培养胚胎大鼠NSCs并进行鉴定,采用叶酸缺乏培养基培养NSCs,根据叶酸添加终浓度将细胞分为对照(Con?trol)组、叶酸缺乏(Folate-D)组、叶酸补充(Folate-L)组,各组叶酸终浓度分别为4、0.6、8mg/L。应用双向电泳(2-DE)技术分析各组蛋白质表达的差异。结果:建立了稳定可重复的NSCs2-DE图谱,与Control组相比,Folate-D组2个蛋白点表达量降低,4个蛋白点表达量升高;Folate-L组2个蛋白点表达量降低,1个蛋白点表达量升高。结论:叶酸缺乏或补充叶酸影响NSCs蛋白表达,差异蛋白分离为进一步研究叶酸对NSCs增殖分化调控机制奠定了基础。     

同型半胱氨酸对体外大鼠神经干细胞增殖及Notch信号通路相关基因表达的影响

【摘要】目的 研究同型半胱氨酸（Hcy）对体外大鼠神经干细胞(NSCs)增殖及Notch信号通路相关基因Notch1和Hes1mRNA表达的影响。方法 采用无血清培养原代培养新生大鼠NSCs,细胞分为对照组(Hcy-C)、Hcy低剂量组（Hcy-L）、Hcy中剂量组（Hcy-M）、Hcy高剂量组（Hcy-H）。采用免疫组化法检测Nestin、β-tubulin Ⅲ及GFAP的表达对NSCs进行鉴定,MTT法检测细胞增殖情况,Real-time PCR检测Notch1、Hes1基因mRNA表达。结果 无血清培养条件下,所培养细胞形成大量呈Nestin抗原阳性细胞组成的神经球;诱导分化6d后,形成β-tubulin Ⅲ表达呈阳性的神经元和GFAP表达呈阳性的星形胶质细胞;Hcy干预组细胞活力低于对照组,且有剂量依赖性(P<0.05)。Hcy干预组Hes1mRNA表达低于对照组(P<0.05)。Hcy-H组Notch1mRNA表达低于其他3组(P<0.05);Hcy-M组Notch1mRNA表达低于对照组和低剂量组(P<0.05)。结论 Hcy能抑制大鼠新生鼠NSCs的增殖,可能与下调Notch信号通路中Notch1和Hes1mRNA表达有关     

SRC-1基因在小鼠神经干细胞分化过程中的变化

目的观察类固醇受体辅助活化因子-1(SRC-1)基因在小鼠神经干细胞(NSCs)体外培养分化过程中表达的变化。方法用机械分离和酶消化法从1~3 d小鼠大脑皮质获取NSCs原代细胞,体外培养获神经球,传代并消化,经血清诱导神经球细胞分化。形态学、细胞免疫荧光实验观察神经球形态、Nestin表达鉴定NSCs;抗体分别标记神经元、星形胶质细胞,检测细胞分化d 3、9的细胞类型。RT-qPCR和免疫印迹法检测细胞分化d 0、3、9 SRC-1基因mRNA和蛋白的表达。结果新生小鼠大脑皮质获取的细胞,体外培养能扩增形成神经球,Nestin阳性表达。NSCs分化d 3主要为神经元,d 9主要为星形胶质细胞。与NSCs分化d 0相比,SRC-1表达在分化d 3明显升高,在分化d 9明显降低。 结论 成功分离并获取新生小鼠皮质NSCs。在NSCs分化中,SRC-1表达量有明显变化,分布依次为神经元>NSCs>星形胶质细胞。     

Effects of Triclosan on Neural Stem Cell Viability and Survival

Triclosan is an antimicrobial or sanitizing agent used in personal care and household products such as toothpaste, soaps, mouthwashes and kitchen utensils. There are increasing evidence of the potentially harmful effects of triclosan in many systemic and cellular processes of the body. In this study, we investigated the effects of triclosan in the survivability of cultured rat neural stem cells (NSCs). Cortical cells from embryonic day 14 rat embryos were isolated and cultured in vitro. After stabilizing the culture, triclosan was introduced to the cells with concentrations ranging from 1 μM to 50 μM and in varied time periods. Thereafter, cell viability parameters were measured using MTT assay and PI staining. TCS decreased the cell viability of treated NSC in a concentration-dependent manner along with increased expressions of apoptotic markers, cleaved caspase-3 and Bax, while reduced expression of Bcl2. To explore the mechanisms underlying the effects of TCS in NSC, we measured the activation of MAPKs and intracellular ROS. TCS at 50 μM induced the activations of both p38 and JNK, which may adversely affect cell survival. In contrast, the activities of ERK, Akt and PI3K, which are positively correlated with cell survival, were inhibited. Moreover, TCS at this concentration augmented the ROS generation in treated NSC and depleted the glutathione activity. Taken together, these results suggest that TCS can induce neurodegenerative effects in developing rat brains through mechanisms involving ROS activation and apoptosis initiation.     

黄芩苷下调p-STAT3诱导神经干细胞向神经元分化*

目的观察黄芩苷促进神经干细胞（NSCs）体外向神经元分化过程中信号传导子与转录激活子(STAT)的磷酸化蛋白表达水平。方法从孕14～15 d的SD大鼠胚胎大脑皮质中分离NSCs,体外培养传代,实验用第3代NSCs。随机分为对照组,低、中、高黄芩苷组（分别含黄芩苷7.5、15、30μmol/L）,白血病抑制因子（LIF）+碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）组和黄芩苷+LIF+bFGF组。培养6 d后,细胞免疫荧光化学染色法观察各组中微管相关蛋白2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达水平。培养2 h与6 d后,用Western blot方法观察各组中STAT3蛋白磷酸化水平。结果黄芩苷可使NSCs中MAP-2表达增加,GFAP表达减弱;LIF+bFGF可促进NSCs中GFAP表达增加;黄芩苷可抑制LIF+bFGF引起的NSCs中GFAP的表达增加。黄芩苷可下调NSCs中STAT3蛋白磷酸化水平;LIF+bFGF可上调NSCs中STAT3蛋白磷酸化水平;黄芩苷可抑制LIF+bFGF引起的NSCs中STAT3蛋白磷酸化水平的上调（P＜0.05）。结论黄芩苷可诱导NSCs向神经元分化并抑制其向星形胶质细胞分化,该作用可能经下调NSCs中STAT3的磷酸化水平来实现。     

间充质干细胞治疗中枢神经系统疾病的研究进展

中枢神经系统疾病如脑卒中、创伤性脑损伤（TBI）、脑白质疾病（WMD）等,主要牵涉神经细胞凋亡导致的功能丧失,缺乏有效治疗手段。间充质干细胞（MSC）是一种异质性干细胞群,具有较强的组织修复和免疫调节潜能,来源多并被认为免疫原性较低。通过移植MSC治疗上述中枢神经系统疾病的临床前研究,大多取得了较好的安全性和有效性结果,且基于MSC移植的临床试验也接连展开,而MSC的鉴别、最佳移植路径、治疗的长期疗效和安全性,以及免疫原性等问题依然存在争论。主要从有效性和安全性两方面探讨MSC在治疗脑卒中、TBI、WMD方面的研究进展。     

黄芪甲苷和齐墩果酸对体外神经干细胞增殖和Jagged1 mRNA表达的影响

目的 观察黄芪甲苷和齐墩果酸对体外神经干细胞增殖和相关基因Jagged1表达的影响。方法 采用机械吹打法从胎鼠脑内获得神经干细胞,随机分组,分别给予不同浓度(10^-6,5×10^-7,10^-7,5×10^-8,10^-8,5×10^-9,10^-9 mol·L^-1)的黄芪甲苷、齐墩果酸进行干预,72 h后用WST法检测细胞的增殖情况,PCR检测Jagged1表达水平。结果 黄芪甲苷对体外神经干细胞增殖影响不显著,高剂量尚存在细胞毒性。齐墩果酸能促进神经干细胞增殖,且呈一定的剂量效应关系,与对照组和黄芪甲苷组比较均有显著差异(P<0.05)。细胞未分化状态下Jagged1基因存在一定的表达,增殖率越高Jagged1表达水平越高;与同浓度黄芪甲苷组比较,齐墩果酸显著上调Jagged1表达(P<0.05)。结论 不同浓度的黄芪甲苷和齐墩果酸对体外培养神经干细胞增殖和Jagged1表达的影响不同;齐墩果酸作用优于黄芪甲苷。