黄芩素抑制胃癌MGC-803细胞增殖和迁移

目的:探讨黄芩素(BAI)对胃癌MGC-803细胞增殖和迁移的作用及机制。方法:MGC-803细胞用不同浓度BAI处理后,采用MTT法检测细胞的存活率;平板集落形成实验检测细胞的集落形成能力;划痕愈合实验和Transwell小室迁移实验检测细胞的迁移能力;ELISA检测12-羟基二十碳四烯酸(12-HETE)的浓度;Western blot实验检测血小板型12-脂氧合酶(p12-LOX)、血管内皮生长因子(VEGF)、p-ezrin和上皮-间充质转化(EMT)标志物蛋白的表达。结果:BAI可显著抑制MGC-803细胞的增殖、平板集落形成及迁移(P0.05或P0.01),显著下调p12-LOX代谢产物12-HETE的浓度(P0.05或P0.01),并显著下调p12-LOX、VEGF、p-ezrin、vimentin和Snail蛋白的表达水平(P0.05或P0.01),上调E-cadherin蛋白的表达水平(P0.01)。结论:BAI可有效抑制胃癌MGC-803细胞的增殖和迁移,其机制与BAI调控p12-LOX、VEGF、p-ezrin及EMT相关蛋白的表达变化有关。     

槲皮素抑制人胃癌MGC-803细胞增殖并诱导其凋亡的研究

目的:研究槲皮素抑制人胃癌MGC803细胞增殖和诱导凋亡的作用。方法:采用MTT比色法检测不同终浓度的槲皮素对MGC803细胞增殖的影响及其细胞毒活性。应用TUNEL(TdTmediateddUTPnickendlabeling)染色法检测槲皮素诱导MGC803细胞凋亡的作用。用免疫组化法测定P16、P53和Cmyc的表达率。结果:在40～100μmol/L范围内,槲皮素可显著抑制MGC803细胞增殖(P<0.01),且呈剂量、时间依赖性。TUNEL染色显示,槲皮素诱导48h后,MGC803细胞的凋亡率明显高于对照组(P<0.01)。免疫组化检测表明,用药组P53及Cmyc蛋白的表达下降,P16蛋白的表达率增强,与对照组相比较均有显著性差异(P<0.01)。结论:槲皮素可抑制人胃癌MGC803细胞增殖,并能诱导其凋亡,其作用机制可能与下调P53及Cmyc蛋白的表达、上调P16蛋白的表达有关。     

半乳糖凝集素3低表达对人胃癌MGC-803细胞增殖的影响

目的 探讨半乳糖凝集素3（galectin-3）表达抑制对人胃癌细胞系MGC-803细胞增殖产生的影响。 方法 将胃癌细胞系MGC-803细胞分为3组,siRNA干扰组（转染靶向galectin-3 的特异siRNA）,空白对照组（只加转染试剂）和阴性对照组（转染非特异性的siRNA）。用Western blotting法检测转染后细胞中galectin-3蛋白的抑制效率,应用MTT法、集落形成实验检测galectin-3基因低表达对MGC-803细胞增殖的影响;用Western blotting和免疫组织化学法检测细胞周期蛋白D1（cyclin D1）和增殖细胞核抗原（PCNA）的表达情况。 结果 siRNA干扰组细胞中galectin-3蛋白的表达与阴性对照组和空白对照组相比明显降低（P<0.05）;细胞集落形成实验和MTT显示,siRNA干扰组细胞的增殖能力与阴性对照和空白对照组细胞比较显著降低（P<0.05）;cyclin D1和PCNA蛋白表达均为siRNA 干扰组细胞表达显著低于两对照组（P<0.05）。 结论 Galectin-3低表达可抑制胃癌MGC-803细胞的增殖能力,这可能与抑制cyclin D1和PCNA的表达有关。     

慢病毒介导的Nestin基因沉默抑制人食管癌ECA109细胞增殖

目的通过体外实验探讨沉默巢蛋白(Nestin)基因对人食管癌ECA109细胞增殖能力的影响及可能机制。方法合成Lenti-Nestin慢病毒载体,实验设blank组、scrambled组和Lent-Nestin组,转染ECA109细胞,建立稳定沉默Nestin基因的细胞系Lenti-Nestin;用qRT-PCR和Western blot检测Nestin、c-myc和cyclin D1 mRNA和蛋白表达;CCK-8法检测细胞增殖能力;平板集落实验检测细胞的集落形成。结果稳定沉默Nestin的细胞系构建成功;与blank组和scrambled组相比,Lent-Nestin组中Nestin mRNA(P0.01)和蛋白(P0.05)水平明显降低;细胞增殖能力明显降低(P0.01),集落形成能力显著下降(P0.05);沉默Nestin表达后,c-myc、cyclin D1表达明显受到抑制(P0.05)。结论沉默Nestin基因表达可抑制人食管癌ECA109细胞的增殖能力,其可能通过调控c-myc、cyclin D1表达参与其中。     

慢病毒介导的SHP-1过表达抑制模型小鼠动脉粥样硬化

目的:研究含SH2结构域的酪氨酸磷酸酶-1(SHP-1)慢病毒载体在动脉粥样硬化模型小鼠中的作用。方法:将45只8周龄雄性Apo E基因敲除小鼠随机分为3组,即对照组、绿色荧光蛋白(GFP)转染组、SHP-1转染组。3组小鼠右侧颈总动脉植入套环并高脂喂养8周,随后分别转染GFP空载体和SHP-1慢病毒(SHP-1-LV)。分别于转染第1、2、6周检测硬化斑块荧光强度、小鼠体重、血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平变化,并利用real-time PCR和Western blot检测右侧颈总动脉中SHP-1、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9等的表达,最后制作切片染色观察斑块病理变化。结果:荧光显微镜下观察到慢病毒转染第1、2、6周后斑块有明显荧光,且在第2周时荧光强度最高,SHP-1慢病毒转染对小鼠体重和血清TC、TG水平无显著影响,但可显著上调右侧颈总动脉中SHP-1的mRNA和蛋白的表达,同时抑制IL-6、TNF-α、MMP-2、MMP-9等的表达水平。SHP-1慢病毒转染也降低右侧颈总动脉斑块面积比及脂质含量。结论:过表达SHP-1可能促进小鼠动脉粥样硬化斑块消退,从而为预防和治疗动脉粥样硬化提供靶点。     

慢病毒介导的CCDC80基因敲除通过降低Aib1表达抑制卵巢癌细胞增殖

目的:探讨含卷曲螺旋结构域蛋白80(coiled-coil domain-conaining protein 80,CCDC80)基因敲除对人卵巢癌ES-2细胞增殖和凋亡的影响。方法:慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术敲除卵巢癌ES-2细胞中的CCDC80基因,基因组测序检测CCDC80的敲除效率;细胞增殖曲线、细胞划痕实验和软琼脂克隆形成实验检测CCDC80基因敲除对细胞增殖、迁移和克隆形成能力影响;Annexin V/PI染色和流式细胞术检测CCDC80基因敲除后细胞周期和凋亡的变化;Western blot法分析增殖相关蛋白表达量;裸鼠荷瘤模型体内实验研究CCDC80基因敲除对卵巢癌细胞增殖的影响。结果:DNA测序结果显示慢病毒介导的CRISPR/Cas9方法可以在卵巢癌ES-2细胞中敲除CCDC80基因。CCDC80基因敲除可以显著抑制细胞增殖、克隆形成和迁移能力(P0.01)。此外,CCDC80基因敲除可以减少G_1期细胞数目,增加S和G_2期细胞数,促进细胞凋亡(P0.01)。裸鼠体内研究显示,CCDC80基因敲除可以显著抑制ES-2细胞体内增殖(P0.01),免疫组化结果显示CCDC80基因敲除细胞形成的肿瘤组织DNA损伤蛋白p-H2AX表达增加,而增殖标志物BrdU表达量减少。Western blot结果显示CCDC80基因敲除细胞p-histone H3表达量减少,p-ERK1/2表达增加(P0.01)。qPCR结果显示CCDC80基因敲除细胞中Aib1 mRNA表达显著降低(P0.01)。结论:CCDC80基因敲除抑制了ES-2细胞增殖,促进细胞凋亡,其机制可能与影响Aib1蛋白表达及MAPK信号通路有关。     

慢病毒载体介导的E2F-1基因沉默对人胶质瘤U251细胞生物学特征的影响

目的探讨慢病毒载体介导的E2F-1基因沉默对人胶质瘤U251细胞生物学特征的影响。方法构建靶向E2F-1的shRNA重组慢病毒载体,将慢病毒载体转染U251细胞,real-time PCR与Western blot在m RNA与蛋白水平鉴定转染结果,MTT方法检测转染后U251细胞活力的变化,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡的变化,transwell实验检测细胞侵袭能力的变化。结果 real-time PCR方法与Western blot检测结果均表明成功建立了稳定沉默E2F-1基因的U251细胞株。与空白对照组及阴性对照组比较,转染E2F-1-shRNA的U251细胞活力显著降低,细胞周期被阻滞于G0/G1期,细胞凋亡率显著升高,侵袭能力显著降低(P0.01)。结论转染E2F-1-shRNA能够显著降低U251细胞增殖侵袭能力。     

人NSPc1基因慢病毒过表达系统的建立与鉴定

 目的 建立并鉴定人NSPc1慢病毒过表达系统,以便应用过表达技术进一步研究NSPc1功能。方法 设计针对人NSPc1基因cDNA序列的带酶切位点引物,PCR扩增获得双链DNA后,与酶切后的pLenti6-TO-EGFP-TRIP载体片段进行连接、转化,酶切及DNA测序鉴定重组克隆。提取阳性克隆质粒, 转染293T细胞并用Western blot检测质粒过表达效果。用293T细胞制备慢病毒颗粒,感染293T细胞后收集细胞全蛋白用Western blot检测慢病毒系统过表达效果。 结果 证实人NSPc1基因正确插入慢病毒载体,人NSPc1慢病毒过表达质粒及相应病毒颗粒能有效过表达NSPc1基因。结论 人NSPc1慢病毒表达系统的成功建立,为应用过表达技术研究人NSPc1功能打下了基础。     

CADM1过表达对人胃癌MKN-45细胞增殖和侵袭的影响及其分子机制

 目的：研究细胞黏附分子1（cell adhesion molecule 1,CADM1）过表达对人胃癌MKN-45细胞增殖和侵袭的影响并探讨其可能的分子机制。方法：采用Western blotting检测3株胃癌细胞系中CADM1蛋白的表达。构建pcDNA-CADM1真核表达载体,并将其转染MKN-45细胞,采用G418筛选稳定表达CADM1的细胞株,利用Western blotting鉴定所筛选的稳定细胞株。采用CCK-8试剂和Boyden小室分析过表达CADM1对MKN-45细胞增殖和侵袭的影响。利用Western blotting检测细胞增殖和侵袭相关蛋白表达。结果：MKN-45细胞中CADM1蛋白的相对表达水平显著低于MKN-28和SGC-7901细胞（P<0.05）。此外,成功构建pcDNA-CADM1真核表达载体,并获得稳定过表达CADM1的MKN-45细胞株。CCK-8结果显示,与未处理组和pcDNA3.1组相比,pcDNA-CADM1组中MKN-45细胞的增殖明显受到抑制（P<0.05）。Boyden小室体外侵袭实验结果显示,与未处理组（101.53±6.89）和pcDNA3.1组（98.77±7.03）相比,pcDNA-CADM1组中MKN-45细胞穿膜的细胞数（52.35±3.89）显著减少（P<0.05）。Western blotting结果显示,与未处理组和pcDNA3.1组相比,pcDNA-CADM1组中p21蛋白表达显著上调,而MMP-2和MMP-9表达显著下调（P<0.05）。结论：CADM1过表达能明显抑制胃癌细胞的增殖和侵袭能力,因而CADM1有望成为胃癌治疗的新靶点。     

RNA干扰EMS1基因表达对人胃癌MGC803细胞增殖和迁移的影响

目的探讨RNA干扰EMS1基因表达对人胃癌MGC803细胞增殖和迁移的影响。方法为检测下调EMS1基因表达后MGC803细胞功能的变化,运用平皿集落形成实验检测其增殖能力;流式细胞仪分析细胞周期和凋亡;Transwell迁移和侵袭实验观察细胞迁移和侵袭能力的变化。结果下调MGC803细胞中EMS1基因表达后,MGC803细胞增殖、迁移和侵袭能力受到抑制,与对照组相比差异有显著性(P0.05),而对细胞周期和凋亡无明显影响。结论 RNA干扰EMS1基因可抑制胃癌MGC803细胞的增殖和迁移侵袭能力。     

慢病毒载体CV072介导的Mfn2过表达抑制肝星状细胞活化

目的:构建携带线粒体融合蛋白2(Mfn2)基因的慢病毒载体,并探讨Mfn2过表达对大鼠肝星状细胞活化的抑制作用及其减少肝纤维化相关因子生成的机制。方法:构建含Mfn2的慢病毒过表达载体CV072-pCMV-Mfn2-EGFP,转染肝星状细胞;荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白的表达及转染效率;RT-qPCR和Western blot法检测转染后细胞中Mfn2的mRNA和蛋白表达水平;Western blot检测Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、α-SMA、TGF-β1、Smad2和Smad3的水平;ELISA检测Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原蛋白水平。结果:与各对照组相比,慢病毒过表达载体CV072-pCMV-Mfn2-EGFP转染后,细胞促凋亡蛋白表达增多,TGF-β1/Smad通路蛋白TGF-β1、p-Smad和p-Smad3的蛋白水平均降低,纤维化相关蛋白α-SMA、I型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白和IV型胶原蛋白的水平降低(P0.01)。结论:转染慢病毒过表达载体CV072-pCMV-Mfn2-EGFP在体外可有效抑制肝星状细胞活化,并可能通过抑制TGF-β1/Smad通路减少肝纤维化相关因子的生成。     

慢病毒载体抑制FOXM1对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响与分子机制

目的:研究靶向转录因子FOXM1 shRNA慢病毒载体抑制FOXM1表达对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响及其分子机制。方法:应用感染复数(MOI)为20的靶向FOXM1shRNA慢病毒颗粒感染人卵巢癌SKOV3细胞,MTT比色法检测感染后SKOV3细胞的生长曲线;流式细胞术分析感染72 h后细胞周期变化;实时荧光定量PCR及Western blot法分别检测感染72 h后FOXM1、Cyclin D1、PLK1等基因mRNA及蛋白表达变化。结果:MOI为20的靶向FOXM1 shRNA慢病毒颗粒能显著抑制SKOV3细胞生长,并将细胞阻滞在G0/G1期而S期细胞减少(P<0.01);显著下调FOXM1、CyclinD1、PLK1等基因mRNA及蛋白表达。结论:抑制FOXM1表达对人卵巢癌SKOV3细胞具有显著的增殖抑制作用。其作用与下调Cyclin D1、PLK1等蛋白的表达将细胞阻滞在G0/G1期有关。     

慢病毒介导的Isl1基因在人骨髓间充质干细胞中的表达

研究慢病毒介导的Isl1基因在人骨髓间充质干细胞(hMSC)中的表达情况,并检测其下游基因Nkx2.5和Flk-1的表达。方法 多位点Gateway载体构建技术构建2K7puro/EF 1α-Isl1慢病毒表达载体(由EF1α启动子启动Isl1基因表达)。包装细胞293FT细胞获得慢病毒,再转染至hMSC。利用嘌呤霉素抗性筛选出Isll阳性细胞。应用RT-PCR、Western blotting检测hMSC中Isl1基因在转染后1～6周的mRNA和1～4周的蛋白表达情况。结果　成功构建了慢病毒载体EF1α-Isl1,转染后hMSC中检测出Isl1基因mRNA和蛋白的表达,其mRNA表达随着培养时间延长而上调,第3周表达量(0.65±0.14)较1、2周增多(0.36±0.09,0.37±0.05,均P＜0.05),3周后表达趋于稳定。转染后在无任何诱导剂的情况下,检测到Isl1下游基因Nkx2.5的表达,但尚未见Flk-1的表达。结论通过慢病毒载体将Isl1基因转染hMSC后,可获得长期稳定的表达,并在无任何诱导剂的情况下,能促进下游基因Nkx2.5的表达。     

慢病毒载体介导下DJ-1过表达细胞模型的建立

目的构建人野生型DJ-1及其L166P突变体的慢病毒载体并探讨慢病毒载体在构建基因过表达细胞模型中的作用。方法分别构建野生型DJ-1与L166P突变型DJ-1慢病毒载体质粒。进行测序确定比对正确后,进行质粒的大量扩增与制备并转染包装细胞系HEK293T细胞,荧光法和Western blot检测野生型DJ-1与L166P突变型DJ-1在细胞系中的表达。在确定目的蛋白正确表达之后,大量转染HEK293T细胞进行包装并生产携带目的基因的慢病毒颗粒。测定病毒上清滴度后感染PC12细胞,荧光显微镜和Western blot观察GFP荧光强度以及目的蛋白的表达,确定病毒的感染效率。结果成功构建携带DJ-1野生型及其突变体的慢病毒载体。该病毒载体可以转染进入HEK293T细胞内且目的蛋白能够正确表达。LV-DJ-1与LV-DJ-1/L166P的病毒滴度分别为2×10~9TU/m L与2×10~8TU/m L。病毒上清可以高效感染PC12细胞,绝大多数细胞可表达目的蛋白。外源野生型DJ-1和L166P突变体的蛋白表达量分别是内源性含量的315%和285%。结论慢病毒感染细胞效率很高,是很好的制备基因过表达细胞的方法。通过慢病毒载体介导,本研究获得了DJ-1及其突变体的过表达细胞模型。该模型可以用于后续DJ-1功能研究。     

慢病毒介导的SEMA3G过表达对人胰腺癌细胞系PANC-1的作用

目的通过体外实验探讨过表达SEMA3G对人胰腺癌细胞PANC-1细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法将携带SEMA3G的慢病毒载体转染人胰腺癌PANC-1细胞系,利用real-time PCR和Western blot分别检测mRNA和蛋白质水平。CCK-8法检测细胞增殖,transwell实验检测细胞侵袭和细胞划痕试验检测细胞的迁移。结果成功建立稳定转染SEMA3G胰腺癌PANC-1细胞系。SEMA3G病毒感染组与空白对照组和阴性对照组相比细胞的增殖能力显著降低(P0.05),SEMA3G病毒感染组的细胞侵袭和迁移能力明显低于两组对照组(P0.05)。结论 SEMA3G慢病毒载体能有效过表达人胰腺癌PANC-1细胞中内源性SEMA3G蛋白,进而抑制细胞增殖、侵袭和迁移。     

ALEX1基因过表达慢病毒载体的构建和鉴定

目的:探讨构建Arm重复蛋白1(ALEX1)基因过表达慢病毒表达载体,感染乳腺癌细胞系SK-BR3后观察ALEX1的表达,为研究ALEX1在乳腺癌中的作用及机制奠定基础。方法:利用DNA重组技术将ALEX1基因插入到慢病毒穿梭质粒LV5中,获得重组慢病毒质粒V-ALEX1,经酶切鉴定及DNA测序鉴定后,用Lipofectamine 2000将重组质粒和慢病毒包装质粒系统(p Gag/Pol、pRev、p VSV-G)转染293T细胞中包装成重组慢病毒颗粒,经流式细胞术测定重组慢病毒滴度。将成功包装的ALEX1过表达慢病毒载体(LV5-ALEX1)和阴性对照载体(LV5-NC),感染SK-BR3细胞(MOI为10)48~72 h,Realtime PCR和Western blot法分析ALEX1表达情况。结果:酶切鉴定结果显示:产生约1 500 bp的片段,片段大小与ALEX1基因cDNA大小一致。DNA测序比对说明测序结果与预期ALEX1基因序列完全一致,证实ALEX1基因正确插入载体中,成功构建ALEX1基因过表达载体。经293T细胞包装后,成功获得病毒滴度为4.25×10~8TU/ml的重组慢病毒LV5-ALEX1。Realtime PCR和western blot结果显示:与感染LV5-NC的SK-BR3细胞相比,LV5-ALEX1感染可明显增加ALEX1 mRNA及蛋白的表达水平。结论:成功构建ALEX1基因过表达慢病毒载体,ALEX1基因过表达慢病毒能够感染乳腺癌SK-BR3细胞,可使外源基因获得稳定过表达。     

Hedgehog信号通路通过调控缝隙连接蛋白43表达影响胃癌MGC-803细胞增殖和凋亡

探讨Hedgehog信号通路对胃癌MGC-803细胞增殖和凋亡的作用及对缝隙连接蛋白43(Cx43)表达的影响,探索其在胃癌细胞增殖和凋亡作用中的可能作用机制。用不同浓度的Hedgehog信号通路抑制剂cyclopamine(5、10、20、30、40、50μmol/L)处理MGC-803细胞24、48、72 h,同时设立空白对照组(0μmol/L),MTT法检测各组细胞增殖抑制率。以0、30、40μmol/L cyclopamine处理MGC-803细胞48 h,TUNEL原位检测细胞凋亡,qRT-PCR检测Cx43 mRNA的表达,免疫印迹检测Cx43蛋白表达。与空白对照组相比,各浓度cyclopamine组MGC-803细胞增殖抑制率明显增高,且随着cyclopamine浓度增加及作用时间延长,其增殖抑制作用增强;30、40μmol/L cyclopamine处理48 h,MGC-803细胞凋亡率明显升高,qRT-PCR检测显示Cx43 mRNA表达显著升高,免疫印迹检测显示Cx43蛋白表达明显升高。Hedgehog信号通路可影响胃癌MGC-803细胞增殖和凋亡,机制可能与调控Cx43 mRNA及蛋白表达有关。