糖尿病大鼠视网膜色素上皮细胞超微结构

目的 :探讨糖尿病大鼠视网膜色素上皮细胞超微结构病变 ,为糖尿病视功能障碍提供有关的行态学依据。方法 :选择清洁级SD大鼠随机分成正常对照组、糖尿病 1月、3月和 6月。腹腔内注射链脲佐菌素 (STZ)诱导大鼠糖尿病 ,每组 1 2只 ,取视网膜制备超薄切片 ,透射电镜观察。处死前每月测体重、血糖 1次。结果 :糖网病大鼠视网膜色素上皮细胞的微绒毛和基底部的质膜内褶随血糖的增高病情加重而逐渐稀疏、低矮直至脱落、低平。胞质内细胞器以线粒体的脱嵴、水肿和内质网的扩张为主要损害 ,而相邻色素上皮细胞之间的连接复合体始终存在。结论 :糖网病大鼠视网膜色素上皮细胞的损害主要表现于微绒毛、质膜内褶及细胞器的损害 ,并无脉络膜与视网膜之间屏障功能的损害。本研究为糖网病的临床研究提供形态学依据     

骨髓干细胞成功转化成视网膜色素上皮细胞

美国科学家通过基因操控成功地使大鼠骨髓干细胞转化为视网膜色素上皮细胞，进而修复了大鼠受损的视网膜。该项实验的成功，不仅提供了医治常见原因造成老年人失明的潜在治疗方案，也意味着骨髓造血干细胞可以经重新编程后用来复原各类细胞和组织，包括那些与动脉粥样硬化、冠心病等心血管疾病相关的细胞和组织。该成果刊登在近期出版的《分子治疗》（Molecular Therapy）杂志上。     

白藜芦醇对视网膜色素上皮细胞增殖的影响

 目的:探讨白藜芦醇（resveratrol,Res）对视网膜色素上皮细胞增殖的影响,并初步探讨其作用机制。方法:用0、50、100、150、200和300 μmol/L Res作用于ARPE-19细胞24、48 和72 h后,CCK-8法检测Res对ARPE-19细胞增殖的影响,0、100、150和200 μmol/L Res作用ARPE-19细胞48 h,PI单染流式细胞术检测细胞周期,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,免疫荧光化学法检测PCNA蛋白表达,实时荧光定量PCR（real-time PCR）法检测PCNA、P21和P27的mRNA表达水平。结果:CCK-8 结果显示,Res抑制ARPE-19细胞增殖,呈时间和剂量依赖性;流式细胞术显示,Res使S期细胞百分比显著上升且各组凋亡率没有区别;免疫荧光显示, Res抑制PCNA蛋白表达,荧光减弱;real-time PCR显示, Res浓度依赖性地抑制PCNA的mRNA表达,而诱导表达P21和P27的mRNA。结论: Res能抑制ARPE-19细胞的增殖,使细胞阻滞在S期,其机制可能与白藜芦醇诱导P21与P27的mRNA表达、抑制PCNA的mRNA表达有关。     

视网膜色素变性的分子遗传学研究进展

视网膜色素变性（retinitis pigmentosa,RP)是眼科常见的遗传性致盲眼病之一。具有明显的遗传异质性，有不同的遗传方式与不同表型。病人常有夜盲和进行性视野缩小。随着分子遗传学的迅速发展，人们对于其分子病理有了一定的了解和认识，至少发现有24个疾病位点，其中已有12个致病基因被克隆。     

视网膜色素变性的分子遗传学研究进展

视网膜色素变性 (retinitis pigmentosa,RP)是眼科常见的遗传性致盲眼病之一。具有明显的遗传异质性 ,有不同的遗传方式与不同表型。病人常有夜盲和进行性视野缩小。随着分子遗传学的迅速发展 ,人们对于其分子病理有了一定的了解和认识 ,至少发现有 2 4个疾病位点 ,其中已有 12个致病基因被克隆     

视网膜色素上皮细胞对含甘露糖的HRP的吞噬作用

为探讨甘露糖受体在视网膜色素上皮细胞吞噬过程中的作用,用富含甘露糖的糖蛋白辣根过氧化酶(HRP)作为吞噬刺激物,D-甘露糖作为抑制剂,对48只Wistar大鼠眼球的视网膜色素上皮细胞在吞噬过程中其甘露糖受体的作用进行了研究,光密度计测定了视网膜色素上皮细胞内摄入HRP的含量,结果表明:HRP在一定浓度内,视网膜色素上皮细胞摄入HRP的含量与其浓度呈正相关;视网膜色素上皮细胞对一定浓度HRP的摄入在4小时内呈线性增加,在培养介质中加入10 mmol的D-甘露糖,视网膜色素上皮细胞对HRP的摄入量明显减少;1mmol的D-甘露糖对其抑制作用很小,100mmol的D-甘露糖对其抑制作用较大.以上结果提示,视网膜色素上皮细胞对HRP的摄入作用本要是山特异性甘露糖受体所介导.     

bFGF诱导人胚视网膜色素上皮细胞转分化的研究

目的 探讨bFGF体外诱导早期人胚视网膜色素上皮（RPE）细胞转分化现象及其分子机制,为视网膜发育的进一步基础研究和临床RPE细胞移植奠定基础.方法 取4～6代人胚（6 w～10 w）RPE细胞,bFGF（20 ng/ml）诱导培养（4 d～6 d）后观察RPE细胞形态学的改变,用免疫细胞化学作转分化RPE细胞鉴定.RT-PCR分析转分化RPE细胞小眼畸形基因（MITF）的表达.结果 bFGF诱导培养后的人胚RPE细胞呈现类神经样细胞表型,不仅表达自身上皮细胞标记物角蛋白（Keratin）,同时还表达多种神经视网膜上皮细胞标记物（MAP2、GS、GFAP、Peripherin、Opsin,但不表达NCAM）;用RT-PCR方法没有检测到转分化RPE细胞MITF-A mRNA表达.结论 早期人胚RPE细胞的发育具有一定的可塑性,bFGF可以诱导早期人胚RPE细胞表达多种神经视网膜上皮细胞标记物,可能是通过抑制MITF-A的分子信号通路.     

二十二碳六烯酸抑制氧化应激状态下人视网膜色素上皮细胞凋亡

 目的: 观察二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)对外源性H₂O₂诱导人视网膜色素上皮细胞凋亡的影响及分子机制。方法: 体外培养人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19,加入终浓度为12.5 mol/L的H₂O₂诱导氧化应激,随后用30~100μmol/L DHA作用细胞4~24 h;real-time PCR和Western blot分别检测血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1) mRNA和蛋白的表达;比色法分析HO-1酶活性;荧光探针检测活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的产生;免疫荧光检测转录因子NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)的核转位。最后通过HO-1 siRNA干扰后,流式细胞术观察其对ARPE-19细胞凋亡的影响。结果: DHA能以浓度依赖性方式诱导ARPE-19细胞表达HO-1 mRNA和蛋白,同时,HO-1的酶活性也随着DHA浓度的递增而增强;DHA处理也能诱导Nrf2核转位。此外,H₂O₂处理可促进ARPE-19细胞凋亡,并诱导其产生ROS。同时给予100μmol/L DHA处理后,细胞凋亡率和ROS生成显著降低。转染HO-1 siRNA或用HO-1抑制剂ZnPP处理后,可明显降低DHA对细胞凋亡率和ROS的抑制作用。结论: DHA可能通过Nrf2途径诱导视网膜色素上皮细胞表达HO-1,从而发挥对细胞的保护作用。     

地塞米松对视网膜色素上皮细胞IL—6表达的抑制作用

目的观察视网膜色素上皮(RPE)细胞中,IL-6的表达及地塞米松对IL-6表达的抑制作用.方法培养的人RPE经IL-1β(10μg/L)刺激及地塞米松作用后,采用ELASA、免疫组化和原位杂交等方法,检测培养的人RPEIL-6mRNA及其蛋白的表达.结果用IL-1β刺激后8h,RPE细胞表达的IL-6约为2000ng/L@106细胞;地塞米松可明显抑制IL-6蛋白的产生(200ng/L@106细胞),与对照组相比较差异显著(P＜0.01).免疫组化染色显示,表达的IL-6在RPE细胞胞浆中呈浓淡不一的棕黄色,地塞米松作用组染色较浅.原位杂交表明,IL-6mRNA在RPE细胞胞浆中的表达呈浓淡不一的紫蓝色,地塞米松作用组染色与对照组相同.图像分析显示,二者的吸光度(A)值无明显差别(P＞0.05).结论在IL-1β刺激下,人RPE细胞可表达IL-6的mRNA及其蛋白,地塞米松能有效地抑制RPE细胞中IL-6蛋白的表达.     

姜黄素纳米粒对人视网膜色素上皮细胞增殖的影响

背景:姜黄素具有抑制人视网膜色素上皮细胞增殖及抗新生血管的作用,在防治眼底新生血管性病变中可以发挥重要作用,但其水溶性较差、体内半衰期短,需要长期、多次注射用药,因此研制姜黄素的新剂型具有重要临床意义。目的:探讨脱氧胆酸基接枝的壳聚糖衍生物负载姜黄素纳米粒的合成方法,以及其对人视网膜色素上皮细胞增殖的影响。方法:首先制备壳聚糖-脱氧胆酸纳米粒,随后制备姜黄素/壳聚糖-脱氧胆酸纳米粒,检测姜黄素/壳聚糖-脱氧胆酸纳米粒的载药量、负载效率及体外释药性能。将人视网膜色素上皮细胞分别与姜黄素(5,10,20,40 mg/L)、壳聚糖-脱氧胆酸纳米粒(5,10,20,40 mg/L)、姜黄素/壳聚糖-脱氧胆酸纳米粒(5,10,20,40 mg/L)共培养,采用CCK-8法检测细胞增殖。结果与结论:(1)姜黄素/壳聚糖-脱氧胆酸纳米粒的载药量、负载效率分别为27.5%,55%,体外前10 h内,该纳米粒存在药物突释现象,此后缓慢释放,至96 h后达到平衡,累积释放药物量为31.6%;(2)培养24,48 h,不同质量浓度的壳聚糖-脱氧胆酸纳米粒对人视网膜色素上皮细胞的增殖无明显影响;(3)不同质量...     

洋葱总黄酮减轻过氧化氢诱导的视网膜色素上皮细胞氧化损伤

目的:探讨洋葱总黄酮(FO)对过氧化氢(H_2O_2)诱导的视网膜色素上皮细胞氧化损伤的影响。方法:将视网膜色素上皮ARPE-19细胞分成对照(control)组、H_2O_2组、低浓度FO(FO-L)+H_2O_2组、中浓度FO(FO-M)+H_2O_2组和高浓度FO(FO-H)+H_2O_2组。MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡。DCFH-DA荧光探针法检测细胞中活性氧簇(ROS)的水平,WST法检测超氧化物歧化酶(SOD)的活性,TBA法检测丙二醛(MDA)的含量,JC-1法检测细胞线粒体膜电位,Westernblot检测胞质中细胞色素C(Cyt-C)及细胞中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的蛋白水平。结果:H_2O_2降低ARPE-19细胞活力,升高细胞凋亡率和ROS水平,降低SOD活性,升高MDA含量,降低线粒体膜电位,升高胞质中Cyt C蛋白水平及细胞中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白水平(P0.05)。与H_2O_2组比较,FO-L+H_2O_2、FO-M+H_2O_2和FO-H+H_2O_2组的细胞活力逐渐升高,凋亡率逐渐降低,细胞中ROS水平逐渐降低,SOD活性逐渐升高,MDA含量逐渐降低,线粒体膜电位逐渐升高,胞质中Cyt C蛋白水平及细胞中cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白水平逐渐降低(P0.05)。结论:洋葱总黄酮减轻H_2O_2诱导的视网膜色素上皮细胞氧化损伤。     

微囊化牛视网膜色素上皮细胞移植治疗帕金森大鼠的研究

目的： 观察微囊化牛视网膜色素上皮细胞（RPE）移植治疗帕金森病（PD）大鼠的疗效。方法： 酶消化法原代培养牛RPE细胞，纯化、传代后用高压静电微胶囊成型装置制作海藻酸钠-多聚赖氨酸微囊化细胞，将其立体定向移植入6-OHDA大鼠PD模型的右侧纹状体，移植分为NS组、RPE组、空微囊组（APA组）和微囊化RPE组（RPE-APA组）。观察移植后：阿朴吗啡诱导的旋转行为变化、移植侧纹状体中多巴胺和高香草酸含量的变化、移植区HE染色及TH免疫组化染色。结果： RPE-APA组阿朴吗啡诱发的旋转次数在移植后第2周开始减少，减少幅度为39.29％（与APA组相比，P<0.05），至第4周减少更加明显，减少幅度为：56.89％（与第2周相比，P<0.05），改善现象一直持续到第14周。行为学出现改善的大鼠纹状体多巴胺和高香草酸含量的增加同其阿朴吗啡诱发的旋转次数的减少相符合。行为学有改善的大鼠囊内细胞TH染色呈弱阳性，微囊周边的纹状体可见TH阳性纤维密度较APA组高。结论： 微囊化牛RPE细胞对6-OHDA大鼠PD模型有治疗作用，是一种前景良好的新型供体。     

中胚层分化蛋白2对视网膜色素上皮细胞吞噬功能的影响

目的:观察中胚层分化蛋白2对视网膜色素上皮细胞吞噬功能的影响。方法:采用人D407细胞和体外培养新生小鼠视网膜色素上皮细胞,加入不同剂量的纯化中胚层分化蛋白2,通过共聚焦显微镜及流式细胞术观察视网膜色素上皮细胞结合和内吞视杆细胞外节盘膜的情况。结果:中胚层分化蛋白2主要表达在视杆细胞外节盘膜层,与视杆细胞外节盘膜生物标志物视紫红质完全共定位,纯化的中胚层分化蛋白2可刺激人D407细胞及小鼠原代视网膜色素上皮细胞吞噬视杆细胞外节盘膜,吞噬体生物标志物Rab7与摄入的视杆细胞外节盘膜共定位,D407细胞吞噬视杆细胞外节盘膜与中胚层分化蛋白2的浓度呈剂量依赖性,但在达到饱和浓度后其吞噬能力下降,中胚层分化蛋白2可结合至视杆细胞外节盘膜及D407细胞表面。结论:中胚层分化蛋白2对视网膜色素上皮细胞吞噬功能有促进作用。     

早期人胚胎视网膜色素上皮细胞的体外培养及生物学特性

目的探索早期人胚视网膜色素上皮(RPE)细胞体外培养以获得高纯度的RPE细胞的方法,并进一步研究其生物学特性。方法取意外流产4h以内人胚(6～10周)眼球,通过混合酶消化法获取RPE细胞。用F12培养液体外培养并作细胞形态学、S-100和Keratin免疫组织化学鉴定;通过Trizol一步法提取总RNA,逆转录聚合酶反应(RT-PCR)分析体外培养RPE细胞酪氨酸酶基因的表达。结果用F12培养液可获得纯度高、活性好的人胚RPE细胞;体外培养的RPE细胞不表达酪氨酸酶基因。结论早期人胚RPE细胞具有在体RPE细胞的部分特征;体外培养的RPE细胞未检测到酪氨酸酶RNA表达,故随着细胞分裂增殖,色素颗粒逐渐减少,提示体内外RPE细胞在功能上存在某些差异。     

大鼠脂肪干细胞体外诱导为光感受器细胞和视网膜色素上皮细胞

目的 探讨大鼠的脂肪干细胞（ADSCs）体外诱导为光感受器细胞和视网膜色素上皮（RPE）细胞的方法。方法 经贴壁筛选法连续传代纯化细胞,流式细胞仪检测CD45、CD90、CD49d、CD106鉴定ADSCs。用EGF、激活素A、牛磺酸、视黄酸和视网膜细胞提取液单独诱导ADSCs;用EGF＋牛磺酸、EGF＋视黄酸、牛磺酸＋视黄酸、EGF＋牛磺酸＋视黄酸联合诱导,免疫荧光法和流式细胞仪检测细胞的视紫红质、CK和S-100的表达。结果 原代ADSCs,CD45阳性率是1.6%,CD90是71.3%,CD49d是7.8%,CD106是3.5%。从传1代至传5代,CD45阳性率是0.8%~9.3%,CD90是84.7%~94.8%,CD49d是16.8%~31.0%,CD106是3.5%。各代ADSCs中,CD49d的阳性率均高于CD106。ADSCs的视紫红质的诱导效应是17.5%～46.0%,CK的诱导效应是19.7%～79.3%,S-100的诱导效应是27.3%～50.7%。结论ADSCs具有向光感受器细胞和RPE细胞分化的潜能。     

Daxx分子特性与应激

Fas死亡结构域相关蛋白（Fas death domain-associated protein, Daxx）是一种高度保守核蛋白,具有4个不同结构域,在细胞凋亡和转录调控中发挥重要作用。Daxx存在两个与其生物学功能密切相关的核定位信号,为Daxx与多种蛋白相互作用所必需。Daxx与氧化应激、心肌缺血等病理生理过程密切相关,提示Daxx在心血管系统中的起重要作用。     

视网膜色素上皮细胞脱离体外培养条件后细胞保存液的研究

目的 研究人视网膜色素上皮细胞(hRPE细胞)离体或脱离体外培养条件后,维持细胞活性、且延长细胞存活时间最适宜的液体.方法 将5代以上hRPE细胞(本实验室保存)按常规冷冻、复苏培养于DMEM/F12培养基添加10%胎牛血清, EGF 20μg/L 和 bFGF 20μg/L条件下,至80%以上汇合,经胰蛋白酶消化,收集细胞、计数,置于6种不同保存液中(平衡盐液、Quinn's advantage medium、生理盐水、18氨基酸液、5%葡萄糖液和人工脑脊液),用Annexin V/FITC Kit染色,利用流式细胞术(FACS)检测细胞死亡或凋亡.采用2h至8h之间3个时间点,检测hRPE细胞在6种不同细胞保存液中的细胞状态.结果 室温状态下,hRPE细胞30min内均发生坏死.4℃状态下,2h平衡盐液组凋亡率最低(0.9%);各组分别与平衡盐液组相比,显示人工脑脊液组与平衡盐液组之间存在显著差异;4h至8h,hRPE细胞凋亡率从26.74%上升至41.36%.各组总死亡率与凋亡率基本一致.结论 4℃状态下,6种溶液中,平衡盐液是维持hRPE细胞脱离培养条件后保持细胞活性,且延长细胞存活时间最适宜的溶液.     

姜黄素类化合物提高线虫的抗氧化应激能力

 目的：研究姜黄素类化合物姜黄素（Cur）、去甲氧基姜黄素（DMC）和双去氧基姜黄素（BDMC）在秀丽隐杆线虫体内的抗氧化应激作用并探讨其作用机制。方法：应用胡桃醌诱导,观察姜黄素类化合物对线虫在氧化应激状态下生存率的影响;用分子探针2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H 2DCF-DA）观察姜黄素类化合物对线虫氧化应激状态下体内活性氧（ROS）的影响;应用荧光显微镜及图像软件分析姜黄素类化合物对线虫氧化应激相关蛋白谷胱甘肽S-转移酶4(GST-4)表达的影响。结果：经姜黄素类化合物预处理后,氧化应激条件下线虫的生存率明显提高;姜黄素类化合物显著抑制了氧化应激状态下线虫体内的ROS水平;在氧化应激条件下,Cur处理组及DMC处理组线虫的GST-4表达量均显著增高（P<0.05）。结论：姜黄素类化合物可能通过降低线虫体内的ROS水平、上调特定应激蛋白GST-4的表达而增强其抗氧化应激能力。     

拉曼光谱技术检测川芎嗪对视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤的保护作用

目的:年龄相关性黄斑变性（AMD）是致盲的主要原因之一。氧化应激所引起的视网膜色素上皮（RPE）细胞变性在AMD的发病机制中发挥了关键作用。本文利用无创、无需标签、高灵敏度的拉曼光谱探究川芎嗪对氧化损伤的人RPE细胞的保护机制。方法:进行拉曼光谱采集之前,将除对照组外的其余两组RPE细胞（ARPE-19）用200 μmol/mL H2O2预孵育,24 h后在保护组细胞中加入200 μmol/mL川芎嗪。所有干预结束后,用MultiskanGO （Thermo, USA）微板法测定细胞内活性氧自由基的含量,用InVia微拉曼系统对3组细胞进行拉曼光谱分析。结果:活性氧检测显示川芎嗪对H2O2诱导的RPE细胞氧化应激损伤有较好的抑制作用。拉曼光谱结果显示细胞氧化应激损伤主要体现在氨基酸类分子上,而川芎嗪的加入不仅逆转了归属于脂质的谱带810 cm-1和840 cm-1峰强度比值的变化趋势,还使H2O2干预后显著提高的归属于各氨基酸谱带的峰强度值有所下降。与之前激光光镊拉曼光谱结果不同,活性氧自由基没有触发酰胺的脱酰胺反应,反而是川芎嗪的干预使得归属于酰胺的拉曼光谱强度发生改变。结论:通过对人RPE细胞拉曼光谱变化的分析,揭示过氧化氢和抗氧化剂川芎嗪潜在的作用靶点,为更好地探究RPE细胞氧化应激的损伤机制奠定了基础。     

抗氧化应激转录因子-Nrf2的研究进展

细胞毒物、致癌物以及亲电子试剂在外界环境中无处不在,这些物质及其代谢产物直接或间接干扰DNA、蛋白质和脂质等生物大分子的生理功能,参与各种疾病包括肿瘤、老化、哮喘、急性肺损伤、动脉粥样硬化、神经退行性疾病和自身免疫病等疾病的病理生理过程,时刻威胁人类健康。为了对抗各种外来物质的攻击,细胞在进化过程中逐渐获得了对抗这些毒性物质的防御能力。其中一个对抗氧化应激最重要的细胞防御机制是由核因子E2相关因子2(nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2)所介导的,Nrf2通过与胞浆蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1,Keap1)以及抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)相互作用,启动下游编码抗氧化蛋白和II相解毒酶的基因表达,发挥细胞保护作用。