鼠疫耶尔森氏菌荚膜抗原（F1）的几种提取方法评价

鼠疫菌荚膜Ｆ１抗原的传统提取方法费时且成本较高，本文参考不同微生物表面蛋白的制备程序，观察了６种不同实验条件下该抗原的提取效果。结果表明，鼠疫菌湿菌用ＫＣＮＳ作为解离剂提取Ｆ１抗原，和传统方法的提取效果基本一致。由于省去了丙酮制备菌粉这一烦锁步骤，从而撮程序大为减化。     

鼠疫耶尔森菌F1抗原免疫Balb/c小鼠方法的研究

目的 观察鼠疫耶尔森菌F1抗原(F1Ag)单克隆抗体制备过程中,F1Ag免疫Balb/c小鼠的免疫剂量和方法,探索操作性强、用时短和免疫效果好的方法.方法 7～9周龄Balb/c小鼠48只,按体质量随机分成6组:150、100、50、25μg组(第1次接种为皮下多点注射,F1Ag分别为150、100、50、25μg,第2、3次接种分别为皮下多点注射和腹腔注射,F1Ag量均为100 μg)、皮下接种组(3次F1Ag接种均采用皮下多点注射,每次100 μg)、腹腔接种组(3次F1Ag接种均采用腹腔注射,每次100 μg),每组8只.首次免疫接种F1Ag+等量弗氏完全佐剂(CFA)的乳化剂;3周后第2次接种F1Ag+等量弗氏不完全佐剂(IFA)的乳化剂;1周后第3次接种F1Ag(不加佐剂);1周后取小鼠尾血,用双抗原夹心酶联免疫吸附试验(DAgS-ELISA)和间接血球凝集试验(IHA)微量法检测F1抗体.结果 不同剂量(150、100、50、25μg)组小鼠血清F1抗体效价(DAgS--ELISA法:G=12 173.87、13 440.37、15 024.19、4466.72;IHA微量法:G=19 972.32、18 089.40、23 170.47、4871.08)比较,差异有统计学意义(DAgS-ELISA法:F=3.11,P<0.05;IHA微量法:F=4.11,P<0.05).150、100、50 μg组小鼠血清F1抗体效价明显高于25μg组(DAgS-ELISA法:t值分别为2.18、2.39、2.73,P<0.05;IHA法:t值分别为2.54、2.73、3.13,P<0.05).不同接种途径条件下,皮下注射组、腹腔接种组、100μg组小鼠血清F1抗体效价呈渐次增高趋势(DAgS-ELISA法:G=8933.44、9986.16、13 440.37:IHA微量法:G=13 777.25、16 384.00、18 089.40),但差异无统计学意义(F值分别为0.66、0.25,P>0.05).结论 F1Ag免疫小鼠首次皮下多点注射50μg,加强免疫(腹腔注射)100μg,可以缩短整个免疫周期,免疫效果良好,抗体水平较高.     

分泌抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单克隆抗体杂交瘤株的建立

目的应用杂交瘤技术,制备分泌抗鼠疫F1抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法用鼠疫菌F1抗原免疫雌性BALB/c小鼠,检测小鼠血清中的F1抗体,选抗体滴度最高的小鼠用于细胞融合,融合前3天F1抗原经腹腔注射加强免疫1次,然后取其脾脏细胞与处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞混合,50%的PEG作为细胞融合剂,HAT培养液选择培养融合后的细胞,间接ELISA法检测细胞培养上清中的F1抗体,阳性杂交瘤细胞用有限稀释法进行克隆及再克隆。结果获得共计100余株分泌F1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,3株进行了4次克隆化,经8个月保存后抗体分泌稳定。结论应用杂交瘤技术,在云南首次成功制备了3株能稳定分泌抗鼠疫杆菌F1抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株,建立了杂交瘤技术的实验程序。     

鼠疫耶尔森菌LcrV抗原B细胞表位的预测

目的预测鼠疫耶尔森菌LcrV抗原的B细胞表位,为抗LcrV单克隆抗体的制备提供理论依据,探索适合我国鼠疫耶尔森菌蛋白B细胞表位组研究的可行方案。方法采用EMBOSS网络平台以及DNAStar Protean软件分析LcrV蛋白的二级结构、可塑性、亲水性和抗原性指数等参数,进行B细胞表位的预测和分析。结果LcrV蛋白的B细胞表位可能位于第16～24、26～31、45～50、175～181、208～213和280～289位等氨基酸区域内或附近,其中16～24、26～31、175～181、208～213等4个短肽都与文献报道相吻合。结论预测得到的表位为后续抗LcrV抗原单克隆抗体的制备奠定了理论基础,为进一步表位分析和鉴定提供了参考依据;预测结果的准确性高,有助于利用表位预测法建立鼠疫菌蛋白B细胞表位研究的平台。     

鼠疫耶尔森菌CAF-1基因的生物信息学分析及抗原表位预测北大核心CSCD

目的探讨鼠疫耶尔森菌CAF-1基因的组成结构及生物学功能。方法运用ProtScale,TMHMM Server,Signal P 3.0 Server,NetPhos3.0 Server,SOPMA,Swiss-mode和DNAStar等生物信息学软件分析鼠疫耶尔森菌CAF-1基因的氨基酸序列组成、理化性质、亲疏水性、信号肽、磷酸化位点、糖基化位点、二、三级结构和B、T细胞抗原表位等。结果 CAF-1是由170个氨基酸构成的富含苏氨酸的稳定亲水蛋白,相对分子质量为17.7×10~3,理论等电点为4.83,不含跨膜区且磷酸化程度较高。二级结构中β转角和无规则卷曲为主要结构原件,分别占41.18%和32.35%。同源建模显示,GMQE和QMEAN评估分值分别为0.90和0.76。抗原表位预测显示,该蛋白含有多个B细胞优势抗原表位和7个优势CTL表位。结论生物信息学预测CAF-1基因编码蛋白为稳定分泌蛋白和外膜蛋白,含有较多的B、T细胞抗原表位,具有较好的抗原性,可作为新型疫苗的潜在候选基因。     

土壤保存鼠疫菌F1抗原的试验研究

本文报告利用放射免疫沉淀试验的竞争抑制原理,成功地从实验室保存了五年鼠疫菌的土壤中,检出F1抗原。检出F1抗原量可达340ng/ml。结果表明,该项试验较反向血凝方法敏感。     

PCR检测鼠疫菌种中F1抗原基因

目的应用PCR检测试验用EV菌株是否存在caf1基因。方法应用含内部对照PCR技术,以鼠疫菌特异基因caf1合成一对引物,进行PCR实验。结果该试验用EV菌株经PCR扩增,呈现一条与caf1基因分子量相吻合的清晰目的扩增带。结论该试验用EV菌株未缺失产生F1抗原的基因,可以用于提取F1抗原等试验。     

从表达菌培养液中提取鼠疫菌重组F1抗原

目的从表达鼠疫耶尔森氏菌F1蛋白的诱导培养液中提取纯化重组F1并检测其免疫反应性。方法收集诱导培养后离心去除菌体的培养液,采用硫酸铵沉淀法和PEG浓缩法提取F1蛋白,产物经镍离子金属螯合亲和层析纯化,免疫印迹(Western blot)鉴定其免疫反应性。结果硫酸铵沉淀法和PEG浓缩法均能从培养液中提取到重组F1蛋白,产物经纯化后可与鼠疫疫苗株免疫兔血清和既往鼠疫患者血清发生特异性结合反应。结论该表达菌表达效能较高,在诱导培养液中存在大量具有免疫学活性的重组F1蛋白。     

鼠疫耶尔森氏菌快速检测研究进展

目的论述一套对鼠疫耶尔森氏菌特异性强、快速、灵敏度高的快速检测方法,对鼠疫做到早发现、早预防、早诊断、早治疗,预防和控制鼠疫的发生和流行。方法查阅和收集国内外相关鼠疫耶尔森氏菌快速检测的文献和资料。结果鼠疫耶尔森氏菌检测技术向着快速、敏感、特异的标准化和国际化方向发展,其检测技术更加先进、齐全、完备。结论鼠疫耶尔森氏菌的检测技术从细菌学、血清学及分子生物学等正向更快速、更先进的方向发展,这对鼠疫防治将发挥重要作用。     

鼠疫菌F1抗原与假结核菌和钩端螺旋体抗原的交叉性研究

鼠疫菌F_1抗原作为特异性抗原已广泛应用于鼠疫诊断中,WHO推荐的F_1抗原IHA和RIP试验,已作为常规诊断方法,从1973年我们用IHA方法在雷州半岛历史鼠疫区反复从鼠类血清中检出阳性,RIP方法检出2份低滴度阳性血清,但始终没检出鼠疫菌,为了排除F_1抗原与其它细菌有无相关抗原与相应抗体存在交叉反应,我们从1984年～1992年用IHA、RIP、MAT做了多次研究,现将结果报告如下。     

胶体金免疫层析法快速检测鼠疫耶尔森菌F1抗体

目的建立检测鼠疫耶尔森菌F1抗体的胶体金标记免疫层析方法。方法胶体金标记纯化鼠疫F1抗原,双抗原夹心法原理制成免疫层析检测试纸条,并对兔、羊、人和黄鼠血清进行检测评价。结果用80份不同动物种属的阴性血清进行检测,未出现非特异性反应,对5份恢复期病人血清、13份免疫兔血清和2份免疫羊血清检测也取得阳性结果,对于8份I HA临界阳性(滴度1∶20)的达乌尔黄鼠血清检出阳性6份。结论建立了可以用于现场快速检测鼠疫F1抗体的胶体金免疫层析方法。     

鼠疫F1McAb酶免疫染色法快速检验鼠疫菌

为缩短检验鼠疫菌的时间 ,建立了酶免疫染色法检验鼠疫菌的方法 ,被检涂片标本用含过氧化物酶底物的固定液 ,固定标本同时 ,内源性过氧化物酶被消耗 ,辣根过氧化物酶标记鼠疫 F1单克隆抗体和鼠疫菌菌体表面的特异性 F1抗原结合 ,底物被酶催化生成有色沉淀物使鼠疫菌着色 ,用普通光学显微镜观察结果 ,常温 1h出结果 ,Kaplow法鼠疫菌被蓝色晶体覆盖 ,DAB法鼠疫菌呈棕黄色 ,不含 F1抗原的 8株细菌均为阴性 ,酶免疫染色法具有特异、快速、简便的特点 ,可用于鼠疫菌的快速检验     

酶标鼠疫F1McAb在酶免疫染色法快速鉴定鼠疫菌中的应用

目的观察酶标鼠疫F1McAb在酶免疫染色法快速鉴定鼠疫菌中的应用效果.方法实验感染鼠疫强毒菌的病死小鼠和处死健康小鼠尸体,20℃以上室温放置,用鼠疫F1McAb酶免疫染色法检测,同时用细菌学检验方法分离鼠疫菌和反向血凝试验(RIHA)检测鼠疫F1抗原.结果直接培养仅从5d内的鼠尸分离检出鼠疫菌,阳性率为53.3%;动物实验检出鼠疫菌的最长时间为8d,阳性率为71.6%.存放13d内,酶免疫染色阳性率为99.1%,RIHA阳性率98.2%,用酶免疫染色法和RIHA检测健康动物腐败脏器全部阴性.以上方法检查鼠疫疫区自毙动物标本12份,酶免疫染色法阳性7份,RIHA阳性6份,动物实验阳性5份,直接培养未获得阳性结果.结论酶免疫染色法检查动物腐败脏器中的鼠疫菌具有较高的敏感性和特异性.     

无血清培养液在分泌鼠疫F1McAb杂交瘤细胞中的初步应用

目的应用ADCF无血清细胞培养液对分泌鼠疫F1McAb的杂交瘤细胞进行静止培养,初步了解该瘤株在ADCF中的生长情况,为今后采用无血清培养液体外培养法生产单克隆抗体提供依据。方法通过将杂交瘤细胞直接转入ADCF培养液培养、驯化培养和优化条件后培养,观察细胞在各种培养条件下的生长情况,进行活细胞计数和抗体效价检测。结果用ADCF培养鼠疫F1杂交瘤细胞,细胞直接转入不能较好的生长;通过驯化、在放过含血清培养液的原瓶中能较好的贴壁生长,在新瓶中不能稳定地贴壁生长和增殖;在经含血清的培养液优化后的培养瓶中,细胞能贴壁生长和增殖。结论ADCF培养液可用于分泌鼠疫F1McAb的杂交瘤细胞的培养。     

鼠疫F1抗原胶体金检测试剂的应用评价

目的 探讨鼠疫F1抗原胶体金检测试剂(简称金标试剂)的应用价值.方法 制备金标试剂,实验室检测其灵敏度、特异性和稳定性.并在全国17个鼠疫监测点检测动物脏器标本1798份,以细菌培养和反向血凝法作为平行对照,比较金标试剂的符合率和阳性率.结果 金标试剂灵敏度为0.0010g/L F1抗原,室温和4℃放置12个月检测效果稳定,检测假结核和小肠结肠炎菌悬液均呈阴性反应.现场检测标本,金标试剂与反向血凝法比较,符合率为97.11%(1746/1798),与细菌培养法比较,符合率为96.83%(1741/1798);而金标试剂阳性率为9.23%(166/1798),高于反向血凝法[6.79%(122/1798)]和细菌培养法[6.28%(113/1798)].结论 金标试剂灵敏度高、特异性强,是可以用于鼠疫现场监测和病例判定的快速诊断方法.     

胶体金免疫层析法快速诊断鼠疫的实验研究

目的建立一种快速、简易的检测鼠疫F1抗原的胶体金免疫层析法(GICA).方法采用直径为20nm胶体金颗粒,标记F1单克隆抗体,并将标记物以6μL/cm喷于玻璃纤维;将另1株F1单克隆抗体与羊抗鼠IgG以1μL/cm喷线固定于硝酸纤维素膜上,装配后以4mm/条切割制成免疫层析检测试条.分别用粗制F1抗原和EV菌对该试纸条的敏感性进行测定,同时用44株鼠疫近缘菌及昆明小鼠、黄胸鼠、褐家鼠、大足鼠的正常血清等标本进行特异性检测.结果本试纸条可在15min之内完成实验,检测粗制F1抗原的浓度可达0.5ng/mL,最小检出EV菌菌量为10万个;本方法的特异性为100%.结论 GICA检测鼠疫F1抗原特异性强、灵敏度高、简便快速,无需特殊仪器设备,有广泛应用价值.