PPARγ基因转染对兔骨髓间充质干细胞向脂肪细胞早期分化的调控作用

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因转染对骨髓间充质干细胞(MSC)向脂肪细胞早期分化的调控作用.方法 原代培养新西兰大白兔MSC,应用脂质体转染法将pEGFP-N1-PPARγ表达载体转入MSC中,G418筛选,成脂诱导剂诱导向脂肪细胞分化,分成不诱导组(A组)、空转染诱导组(B组)及转染诱导组(C组),采用RT-PCR方法检测PPARγ、脂蛋白脂酶(LPL)mRNA表达,免疫细胞化学染色检测PPARγ、LPL蛋白表达,油红O染色法行脂肪细胞计数和定量.结果 A组细胞内没有脂滴出现,C组成脂率和脂肪含量明显高于B组(P<0.05);A组PPARγ、LPL mRNA及蛋白均不表达,C组PPARγ、LPL mRNA及蛋白表达水平显著高于B组(P<0.01).结论 PPARγ基因转染可增强MSC向脂肪细胞早期分化的能力,缩短分化进程,提高分化效率.     

骨髓间充质干细胞体外分化为心肌样细胞相关调控基因的时序表达

目的研究体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化过程中相关调控基因的时序表达,筛选MSCs定向分化为心肌细胞的重要调控基因。方法采用第8代的MSCs,以去甲基化药物5氮杂胞苷进行体外诱导,连续观察8周,相差显微镜下观察其形态变化,荧光免疫组化方法鉴定心肌特征性蛋白肌球蛋白重链(MHC)和连接蛋白Connexin43的表达,应用半定量RTPCR技术分析TGFβ、Nkx25、GATA4、MEF2C、TEF1和RARα等相关调控基因在分化过程中的动态时序表达。结果诱导前MSCs呈成纤维细胞样,诱导后细胞形态发生变化,1周呈棒状或球形,2周后细胞之间形成连接,排列方向渐趋一致,3周时开始出现肌管结构。MHC诱导前无表达,诱导后1周开始表达,2周起表达逐渐增强,8周时阳性细胞比例为30%;Connexin43在诱导前有弱表达,阳性率为5%,诱导后逐渐增强,8周时阳性细胞比例为40%。TGFβ、Nkx25、GATA4和MEF2C基因在诱导后1天表达开始增强,诱导后1周达高峰,以后维持在高水平;TEF1和RARα基因在诱导过程中表达无明显变化。结论TGFβ、Nkx25、GATA4和MEF2C可能是调控MSCs定向分化为心肌样细胞的重要调控基因。     

17β-雌二醇对大鼠骨髓基质细胞PPAR-γ2 mRNA表达的影响

目的　研究 17β 雌二醇 (E2 )对大鼠骨髓基质细胞过氧化物酶增殖物活化受体γ2 (PPAR γ2 )mRNA表达的影响 ,探讨雌二醇对成骨细胞生成的作用。方法　用 1,2 5 (OH) 2 D3 和地塞米松 (DEX)诱导大鼠骨髓基质细胞向成骨细胞分化 ,应用半定量RT PCR及Western印迹技术 ,观察不同浓度E2 对骨髓基质细胞分化过程中PPAR γ2 mRNA及蛋白表达的影响 ,这些细胞的碱性磷酸酶 (ALP)活性和Ⅰ型胶原含量也被测定。结果　E2 能显著促进骨髓基质细胞在分化介质中PPAR γ2 mRNA及蛋白的表达 ,且呈剂量依赖性。E2 浓度为 10 -6mol/L时 ,PPAR γ2 mRNA的表达从 (1.3± 0 .5 ) %增至 (17.7± 2 .5 ) % (P <0 .0 1) ;PPAR γ2 蛋白的表达从 (1.16± 0 .10 ) %增至 (4 .0 8± 0 .13 ) % (P <0 .0 1)。细胞ALP活性明显受E2 的抑制 ,在上述E2 浓度时ALP的活性从 (4 2 .6± 2 .5降至 3 .6± 0 .7)mU/mg蛋白 (P <0 .0 0 1)。Ⅰ型胶原含量均随E2 浓度增加而降低。结论　E2 促进体外培养的骨髓基质细胞向脂肪细胞分化而抑制其向成骨细胞分化。     

甘精胰岛素、地特胰岛素、人胰岛素对3T3-L1脂肪细胞PPARγ2mRNA表达的影响

目的 探讨人胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素对体外培养3T3-L1脂肪细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体-γ2(PPARγ2)基因表达的影响及可能机制.方法 体外培养3T3-L1前脂肪细胞,在分化培养液分别加入100 nmol/L、500 nmol/L、1 000 nmol/L人、甘精、地特胰岛素培养10 d,用RT-PCR检测脂肪细胞中PPARγ2 mRNA表达水平的变化.结果 在细胞分化的过程中,胰岛素浓度的增高促进PPARγ2的表达;相同浓度下,人胰岛素促进PPARγ2 mRNA表达最强,甘精胰岛素次之,地特胰岛素最弱.结论 胰岛素通过上调PPARγ2基因表达促进前脂肪细胞的分化,不同胰岛素促分化能力不同.     

原代培养的人网膜前脂肪细胞分化过程中基因表达和脂肪因子分泌的特征

采用胶原酶消化法分离原代培养人网膜基质前脂肪细胞进行诱导分化.在诱导分化早期,前脂肪细胞因子1表达迅速降低,而脂蛋白脂酶、PPARγ2表达迅速增加,CAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)在成熟阶段表达丰度最高.瘦素mRNA表达和分泌随分化逐渐增高,抵抗素mRNA仅在前脂肪细胞表达和分泌而脂联素mRNA仅在成熟脂肪细胞表达和分泌,胰岛素样生长因子I(IGF-I)在前脂肪细胞诱导分化前后均有分泌.     

脂肪细胞的分化调控

脂肪细胞分化受多种激素的诱导 ,通过各种信号转导途径 ,促发不同转录因子调控脂肪细胞特异基因的表达。其中 ,CCAAT/增强子结合蛋白 (C/EBP)和过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPAR)家族是脂肪细胞分化的主要转录调控因子。同时 ,脂肪细胞的分化也受各种活性因子的负向调控。     

microRNA-200c对3T3-L1前体脂肪细胞向脂肪细胞分化的调控作用

目的 探讨microRNA(miRNA)-200c对3T3-L1前体脂肪细胞分化的影响.方法 利用实时PCR检测miRNA-200c在小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)向脂肪细胞分化过程及向骨细胞分化过程中的表达.通过将miRNA-200c类似物、miRNA-200c抑制剂转染至3T3-L1前体脂肪细胞,从而在细胞中增强或抑制miRNA-200c的表达,油红O染色检测转染后3T3-L1前体脂肪细胞诱导成熟后的脂滴形成情况.实时PCR检测转染后脂肪细胞特异性转录因子过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)和表征基因aP2在成脂过程中的表达变化.结果 实时PCR结果显示,在小鼠骨髓MSCs诱导成脂后miRNA-200c表达升高(t=24.709,P＜0.01),而诱导成骨后,miRNA-200c表达下降(t=8.783,P＜0.01).转染miRNA-200c类似物后,3T3-L1前体脂肪细胞中脂滴明显增多,PPARγ和aP2表达显著升高(t=7.674、9.657,P均＜0.01);转染miRNA-200c抑制剂后,3T3-L1前体脂肪细胞中脂滴明显减少,PPARγ、aP2表达显著降低(t=9.483、6.419,P均＜0.01).结论 miRNA-200c能够促进3T3-L1前体脂肪细胞向脂肪细胞分化.     

人双突变型低氧诱导因子α促进骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的实验研究

目的 探讨人双突变型低氧诱导因子1α(HIF-1α)基因(HIF-1α-402-564)对与心肌细胞共培养的骨髓间充质干细胞(MSC)向心肌细胞分化的影响.方法 实验分为4组:HIF-1α组(MSC+心肌细胞+Ad-HIF-1α)、LacZ组(MSC+心肌细胞+Ad-Lacz)、Sham组[MSC+心肌细胞+胎牛血清(PBS)]、MSC+HIF-1α组(MSC+Ad-HIF-1α),前三组中MSC与心肌细胞按1:2比例共同培养,各组细胞培养24 h后分别感染不同病毒(MOI=100)或加入PBS液.病毒感染后7 d,免疫细胞化学分析共培养的MSC表达心肌细胞特异性标志物心肌肌钙蛋白T(cTnT)的情况,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析各组细胞HIF-1α、转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad4、NKx2.5、GATA结合蛋白4(GATA-4)的mRNA表达量.结果 HIF-1α组MSc心肌细胞分化率为(32.68±6.52)%,显著高于LacZ组[(8.28±0.09)%]和Sham组[(10.25±2.20)%],P均<0.05,MSC±HIF-1α组仅为(0.32±0.05)%.LacZ组和Sham组间差异无统计学意义.MSC+HIF-1α组与Sham组比较,差异有统计学意义(P<0.05).HIF-1α组TGFβ1及Smad4 mRNA表达水平明显高于其余各组,P均<0.05.HIF-1α组NKx2.5和GATA-4 mRNA表达水平明显高于Sham组,P均<0.05.结论 HIF-1α能够促进与心肌细胞共培养的MSC向心肌细胞分化,TGF-β1/Smad4信号通路参与了该过程.     

Exendin-4对脂肪细胞分化及糖脂代谢相关基因mRNA表达的影响

目的探讨Exendin-4对3T3-L1前脂肪细胞的分化及糖脂代谢相关基因mRNA表达的影响。方法体外培养3T3-L1前脂肪细胞,在脂肪细胞分化成熟过程中的不同时期分别用Exendin-4等干预,采用油红O染色,观察脂肪细胞分化及脂质积聚情况;采用荧光定量PCR检测脂肪细胞糖脂代谢标志基因GLUT-4、PPARγ、HSLmRNA表达水平。酶法测定脂肪细胞的甘油三酯含量。结果分化成熟的脂肪细胞经油红O染色可见细胞质内大片脂滴呈亮红色,而未分化细胞不被油红O染色。在脂肪细胞分化第0天和第6天用Exendin-4干预,脂肪细胞内TG的含量较空白组增加（P〈0．01）,GLUT-4、HSL、PPARγ mRNA的表达上调（P〈0．01）;在脂肪细胞分化的第12天干预,Exendin-4对肪细胞分化及相关基因mRNA的表达与空白组无明显差异。结论Exendin-4促进脂肪细胞的分化并上调糖脂代谢相关基因GLUT-4、PPARγ、HSL mRNA表达,可能为Exendin-4抗糖尿病的部分作用机制。     

脂肪细胞的分化调控

脂肪细胞分化受多种激素的诱导,通过各种信号转导途径,促发不同转录因子调控脂肪细胞特异基因的表达,其中,CCAAT／增强子结合(C/EBP)手过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）家族是脂肪细胞分化的主要转录调控因子,同时,脂肪细胞的分化也受各种活性因子的负向调控。     

老年大鼠过氧化体增殖物激活型受体-γ的表达及其与胰岛素抵抗的关系

目的　观察衰老对过氧化体增殖物激活型受体 γ(PPARγ)组织表达的影响 ,在分子水平上探讨衰老过程中出现胰岛素抵抗 (IR )的可能机制。　方法　用Bergman创立的微小模型技术评价青年鼠 (10～ 12周龄 )和老年鼠 (2 4月龄 )的胰岛素敏感性 ,采用半定量RT PCR法检测大网膜脂肪组织PPARγ1 、PPARγ2 mRNA的表达水平 ,用Westernblot法检测PPARγ蛋白表达。　结果　与青年鼠组比较 ,老年鼠组存在明显的胰岛素抵抗 (IR :11 49± 6 92与 5 2 8± 1 94,胰岛素敏感指数(SI1 2 ) :-0 0 5± 0 0 2 7与 -0 0 2± 0 0 18,均为P <0 0 5) ;而老年鼠组的PPARγ1 、PPARγ2 mRNA(0 64± 0 0 7与 1 0 2± 0 0 9,0 60± 0 0 6与 1 0 6± 0 11,均为P <0 0 1)及PPARγ蛋白 (1 53± 0 10与 5 16± 0 65,P <0 0 1)表达明显减少。　结论　衰老降低脂肪组织PPARγ表达 ,可能是通过降低脂肪细胞分化能力 ,使得对胰岛素敏感的小脂肪细胞数目减少而参与胰岛素抵抗的形成     

体外诱导人脐血间充质干细胞未能向心肌细胞转分化

目的选择从人脐带血中分离出的间充质干细胞(UCB1-MSCs),通过5-氮胞苷(5-aza)进行诱导,对其体外向心肌细胞转分化的能力做初步探讨。方法培养第11代 hMSCs,加入6、9、12 μmol/L 的5-aza 分别作用24h 和48h,相差显微镜观察细胞形态直到3周后实验结束。以未经处理的细胞为对照组。采用 RT-PCR 检测心肌转录因子 MEF2C、GATA4、Nkx2.5和心肌特异性基因 MLC-2v、MLC-2a、Connexin 43及α-actinin 的表达;免疫荧光染色检测 Connexin 43和α-actinin 的表达,以共聚焦显微镜成像。结果经5-aza 诱导后观察3周未见细胞的自发搏动。诱导前后的 hMSC 均可不同程度的表达 MEF2C、Connexin 43及α-actinin。在12 μmol/L 水平诱导24h 和6、9、12 μmol/L 水平诱导48h 共4个组中可见 MLC-2a 的表达。GATA4、Nkx 2.5和 MLC-2v 在诱导前后均未见表达。免疫荧光染色显示诱导前后 hMSCs 的胞浆内存在散在排列无序的α-actinin 和 Connexin 43荧光,而始终未见肌小节结构。结论经5-aza 诱导 UCB 来源 hMSCs 在基因水平可以表达部分心肌特异性基因,但是在诱导后的一个月时间内未见相应的心肌特异性结构出现,此类细胞向心肌细胞转分化的能力需再证实。     

系统性红斑狼疮患者骨髓间充质干细胞多向分化能力异常

目的 探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者骨髓间充质干细胞(MSCs)多向分化能力是否存在异常. 方法 密度梯度离心法和贴壁筛选法分离培养MSCs,定向诱导骨髓MSCs向脂肪和成骨细胞分化,脂肪细胞经油红O染色鉴定并定量,成骨细胞经茜素红S染色鉴定.将骨髓MSCs与羟基磷灰石共孵育,将共孵育物植于裸鼠皮下,8周后常规苏木素-伊红(HE)染色.反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ-2(PPARγ-2)、脂蛋白酶(LPL)、Runx2/CBFA1、降钙素(osteocalcin) mRNA的表达水平.结果 SLE骨髓MSCs分化成脂肪细胞比例低于健康埘照组,油红O染色定量低于健康对照组[(35±7)%与(80±5)%],(0.14±0.04与0.27±0.04),LPL mRNA表达低于健康对照组(0.369±0.020与0.481±0.038),两组PPARγ-2 mRNA表达差异无统计学意义(0.421±0.052与0.441±0.012).SLE骨髓MSCs分化成骨细胞后形成钙结节低于健康对照组[(35±4)%与(45±4)%],Runx2/CBFA1、osteocalcin mRNA表达低于健康对照组(0.371±0.000与0.563±0.069),(0.819±0.023与0.962±0.049);羟基磷灰石与SLE患者骨髓MSCs共孵育后移植裸鼠皮下8周后,成骨细胞形成明显少于健康埘照组. 结论 SLE骨髓MSCs成脂和成骨分化能力存在异常,提示SLE患者骨髓MSCs存在缺陷.     

人参皂甙Rb1促进3T3-L1脂肪细胞分化并抑制脂解

目的 观察人参皂甙Rb1（Rb1）对3T3-L1脂肪细胞分化和脂肪分解的作用，并探讨人参抗糖尿病的作用机制。方法 在3T3-L1脂肪细胞诱导分化过程中，分别加入不同浓度的Rb1作用6d，各组脂肪细胞分别进行油红O染色，甘油三酯（TG）含量、^3H-葡萄糖转运率检测，并用实时定量PCR和免疫印迹对脂肪细胞PPARγ2、CCAAT增强子结合蛋白（C／EBPα）、脂肪酸结合蛋白（ap2）和葡萄糖转运体（Glut）1、Glut4的mRNA和蛋白水平进行测定；运用表面等离子体共振技术（SPR）测定Rb1与PPARγ结合亲和力；在分化成熟的脂肪细胞加入Rb1孵育后，测定释放到上清液的甘油含量。结果Rb1能促进3T3-L1脂肪细胞的分化程度，并呈剂量依赖关系，10μmol／L浓度使细胞内TG含量增加约56％，同时PPARγ2和C／EBPα的mRNA和蛋白水平均显著升高，其下游基因ap2的mRNA水平也明显增加。分化过程中加入Rb1的脂肪细胞基础和胰岛素介导的葡萄糖转运率增加。Glut4的mRNA和蛋白水平均上升，而Glut1则未见显著变化；SPR检测结果显示Rb1具有PPARγ结合活性，提示Rb1是PPARγ的配体；在诱导分化成熟的脂肪细胞中，Rb1抑制基础脂肪分解，10μmol／L浓度使上清甘油含量下降约50％，但对异丙肾上腺素介导的脂解没有影响。结论 Rb1作为PPARγ的配体，通过上调PPARγ2,2C／EBPα的表达促进脂肪细胞的脂肪形成；增加基础和胰岛素刺激的葡萄糖利用；同时抑制基础脂解。以上结果表明人参和人参皂甙抗糖尿病的作用可能与促进脂肪细胞分化，增加胰岛素敏感性和抑制基础脂解有关。     

转录因子与心脏发育

细胞核转录因子是信号联级调节基因转录的最后环节。许多核转录因子与心脏发育有关。Sp ,GATA ,MEF 2和Nkx2 .5转录因子在胚胎早期心脏的形成及心肌分化的多个环节进行调节 ,MEF 2还与心脏的病理生理有关。     

过氧化物酶体增殖物激活受体2及其磷酸化形式在脂肪干细胞脂向分化过程中的表达

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)2及其磷酸化形式在脂肪干细胞脂向分化过程中的表达。方法采用组织块贴壁法培养脂肪干细胞,对第3代细胞进行脂向分化诱导,应用Western印迹检测诱导不同时间的PPARγ2非磷酸化及其磷酸化形式表达,RT-PCR检测诱导不同时间的PPARγ2 mRNA表达。结果随着脂向分化诱导时间的增长,PPARγ2的非磷酸化与磷酸化形式的相对表达量明显增加,PPARγ2mRNA相对表达量呈逐渐递增的趋势(P<0.05),其中第7、9天达到峰值差异比较无统计学意义(P>0.05)。结论 PPARγ2在脂肪干细胞脂向分化过程中起着重要作用,作用机制可能是通过自身的磷酸化来促进脂向分化。     

过氧化物酶体增殖物活化受体γ在肝星状细胞活化过程中的动态演变

目的 探讨过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPAR γ)在肝星状细胞(HSC)活化过程中的作用。方法 采用形态学、RT-PCR方法观察从正常Wistar大鼠分离的HSC在体外培养自发活化过程中以及以二甲墓亚硝胺诱导肝纤维化形成过程中HSC在体活化时PPAR γ的动态演变。结果 HSC在体外培养自发活化过程中,新鲜分离的HSC PPAR γ mRNA表达水平最高(0.71±0.01),培养第3天时即开始减低(0.48±0.03,t=19.8372,P<0.01),培养第7天后PPAR γ的表达减低70％以上,传2代时几乎检测不到。以二甲基亚硝胺诱导肝纤维化形成过程中,对照组大鼠新鲜分离的HSC表达PPAR γ(0.76±0.01),第3次注射二甲基亚硝胺后PPAR γ的表达水平显著减低(0.46±0.02,t=29.5318,P<0.01),一周末时PPAR γ表达较正常大鼠下降66％,第2周、第3周时PPAR γ几乎检测不出。结论 PPAR γ的表达参与HSC静止表型的维持,且PPAR γ表达降低是HSC由静止向活化表型转化过程的早期事件。     

微小RNA-152正向调控过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路参与脂肪细胞分化

目的检测微小RNA(mi R)-152表达改变,探讨其在脂肪细胞分化和肥胖发病中的作用及其分子机制。方法培养3T3-L1前脂肪细胞并诱导其分化,观察mi R-152表达改变,检测过氧物酶体增殖物激活受体(PPAR)α、γ和a P2基因表达的变化。结果 3T3-L1前脂肪细胞分化过程0 d、3 d、6 d和9 d,mi R-152表达量6 d达到峰值;PPARα、PPARγ和a P2均呈现持续增加趋势,分析6 d内均与mi R-152的表达呈正相关(r=0.958,0.667,0.697,P0.05);6～9 d前体脂肪细胞分化完成。结论 mi R-152正向调节PPAR信号系统参与3T3-L1前脂肪细胞分化,是肥胖的发病机制之一。     

右归丸对骨髓间充质干细胞成脂分化相关基因甲基化的影响

目的探讨右归丸含药血清对骨髓间充质干细胞成脂分化相关基因表达及其甲基化影响。方法制备右归丸含药血清备用。无菌条件下,取SD大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁法培养,传代。第二代贴壁细胞分组:(1)对照组:用含10%盐水的DMEM培养;(2)成脂诱导组:用成脂诱导条件培养基培养;(3)右归丸组:10%右归丸含药血清加成脂诱导条件培养基;分别干预3 d后用RT-PCR及甲基化特异性PCR法检测PPARγ和C/EBPα基因表达和甲基化状态。结果右归丸组PPARγ和C/EBPα的表达明显低于其他各组(P0.05)。右归丸组PPARγ和C/EBPα甲基化上调,组间比较差异显著(P0.05)。结论右归丸含药血清可通过去甲基化的表观遗传调控机制抑制骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化。     

Islet-1促MSCs心肌特化过程中Nkx2.5启动子区域DNA甲基化水平变化

目的:研究Islet-1诱导C3H10T1/2细胞定向分化为心肌样细胞过程中表达增加的心肌早期发育相关基因Nkx2.5启动子区域DNA甲基化水平的变化情况。方法:高表达Islet-1基因的慢病毒载体转染间充质干细胞C3H10T1/2,免疫荧光检测Islet-1表达情况,在Nkx2.5表达达高峰的时间点,通过甲基化特异性PCR技术检测其启动子区域DNA甲基化水平,比较C3H10组(空白对照组)、阴性对照组(转染慢病毒空载体)和实验组(转染高表达Islet-1基因的慢病毒载体)上述基因启动子区域的DNA甲基化水平。结果:实验组Nkx2.5基因启动子区域DNA甲基化水平低于其他两组(均P0.05)。结论:高表达Islet-1促C3H10T1/2细胞特异性向心肌细胞方向分化过程中,心肌早期发育相关基因启动子区域DNA甲基化水平降低,促进其表达增加。