人骨髓间充质干细胞的分离培养及向成骨细胞定向分化的实验研究

目的:建立人骨髓间充质干细胞(hMSCS)体外分离、培养体系,并将其向成骨细胞定向诱导分化。方法: 采用梯度离心法从人骨髓血中提取骨髓MSC,经体外培养扩增,观察其生物学特性。结果:在体外培养条件下,骨 髓MSC具有较强的增殖能力,并能被诱导向成骨细胞分化。结论:建立了骨髓MSC体外分离、培养的体系,探讨 了骨髓MSC的生物学特性,为进一步研究MSC作为骨组织工程的种子细胞打下了基础。     

兔骨髓间质干细胞诱导分化的生物特性研究

目的：本研究的目的在于研究骨髓间质干细胞体外诱导、分化培养的特性，以期寻找BMSC体外培养扩增和诱导分化的适宜时机和方法。方法：采用兔来源的骨髓间质干细胞体外扩增培养；选用不同代数的BMSC进行诱导分化，并行生物学检测。结果：兔骨髓间质干细胞可在体外培养扩增，形态类似成纤维样细胞；骨髓间质干细胞在条件培养液的存在下，可以分化成有成骨能力的细胞类型；体外可合成分泌类骨质钙盐。BMSC随代数的增加其生物反应性逐渐降低，并呈一定规律性。结论：骨髓间质干细胞可在体外传代扩增培养，在一定条件下可向成骨类型细胞转化，并随传代次数的增加，其转化效率与生物学性质成规律性变化。一定传代数的BMSC适于作为骨组织工程的种子细胞。     

兔骨髓基质干细胞自体嚼肌内移植异位成骨实验研究

目的：观察骨髓基质干细胞成骨向分化诱导后植入嚼肌内异位成骨的过程。方法：从兔髂骨分离骨髓基质干细胞,经体外诱导分化,与磷酸三钙／羟基磷灰石（tricalcium phosphate／hydroxyapatite,TCP／HA）支架复合,植入兔自体嚼肌内,形态学、免疫细胞化学、组织学观察其成骨特征。结果：体外培养的兔骨髓基质干细胞性状稳定,经矿化诱导培养的骨髓基质干细胞表现为成骨细胞分化,表达Ⅰ型胶原蛋白,与支架材料复合植入自体嚼肌内可见成熟骨组织形成。结论：利用骨髓基质干细胞为种子细胞植入嚼肌内开展功能性组织工程化颌骨移植方法可行。     

犬骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导分化及细胞片层的制备

目的分离培养犬骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）并向成骨细胞诱导分化,制备骨髓基质干细胞的细胞片层。方法密度梯度离心法分离犬骨髓基质干细胞,接种于DMEM成骨诱导培养基,向成骨细胞诱导分化,利用温度反应性培养皿的温度感应性,制备细胞片层。观察犬BMSCs、成骨细胞诱导分化及细胞片层形态学特点与生物学特性。结果分离培养出犬BMSCs,成功地向成骨细胞实现诱导分化,并观察到钙结节。利用温度反应性培养皿的温度感应性,收获了完整的细胞片层。结论细胞片层技术与传统的骨组织工程方法相结合,将有望构建出含板层骨结构的大块组织工程骨。     

兔骨髓基质细胞的体外成骨定向诱导培养

目的:体外分离培养兔骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs),并向成骨定向诱导培养,为骨组织工程提供适宜的种子细胞。方法:抽取新西兰白兔的骨髓,体外分离纯化得到BMSCs,并利用条件培养液将其向成骨定向诱导培养、扩增。采用倒置相差显微镜观察细胞增殖分化情况;使用碱性磷酸酶(ALP)和VonKossa染色的方法,鉴定其成骨性能;用MTT法描绘标准细胞浓度-OD值曲线。结果:BMSCs在培养皿中贴壁生长、增殖;经ALP和VonKossa染色证实其有成骨潜能;标准BMSCs细胞浓度-OD值曲线显示细胞浓度和OD值呈线性正相关。结论:可以通过在体外分离纯化骨髓并诱导培养,获得足够数量、有成骨潜能的BMSCs作为骨组织工程的种子细胞。     

山羊骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导后成骨分化相关基因表达的变化

目的:研究山羊骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导后成骨分化相关基因ALP、OCN、COL I mRNA表达水平的变化.方法:采用全骨髓培养法培养骨髓基质干细胞,使用成骨条件培养液体外诱导成骨细胞,通过细胞形态学观察、免疫组化染色、钙结节等检测手段进行成骨细胞鉴定,采用RT-PCR和实时定量PCR检测诱导2周后骨髓基质干细胞ALP、OCN、COL Ⅰ的表达水平,未诱导的骨髓基质干细胞作为对照组.结果:通过成骨细胞鉴定,骨髓基质干细胞成功诱导分化为成骨细胞:OCN和COL Ⅰ基因存细胞诱导组表达上调,ALP基因表达在诱导组和未诱导组间无显著差异.结论:成功诱导山羊BMSCs向成骨细胞分化,成骨分化相关基因在诱导后为适应成骨细胞的功能发生变化.     

兔骨髓干细胞和脂肪干细胞体外成骨能力的比较

目的:评价两种不同来源的间充质干细胞,即骨髓干细胞(BMSC)和脂肪干细胞(ADSC)的体外成骨能力,为其将来应用于细胞治疗和组织工程研究提供一定的理论依据。方法:分别取同一只兔的髂骨骨髓和腹股沟脂肪作为BMSC和ADSC的来源,分离培养后比较成骨、成脂分化潜能,细胞表面抗原标记物;成骨诱导后检测碱性磷酸酶(ALP)活性,RT-PCR分析其成骨相关基因的表达情况。结果:BMSC和ADSC都具有向成骨、成脂分化的潜能;在成骨诱导分化后,BMSC有较高的ALP活性和较多的钙结节形成。RT-PCR结果显示:BMSC表达较高的BMP-2、OCN和OPN等成骨基因。结论:BMSC和ADSC都具有向成骨、成脂分化的潜能,ADSC有较好的成脂分化能力,BMSC有较好的成骨分化能力;两者都可以作为组织工程的种子细胞。     

SD大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养鉴定及骨向诱导分化研究

目的：建立骨髓间充质干细胞（MSCs）体外分离培养体系,并进行骨向分化诱导以探讨大鼠MSCs的体外培养方法及向成骨细胞分化的条件。方法：采用全骨髓贴壁筛选培养法分离成年SD大鼠MSCs,经条件培养液诱导培养后,进行细胞形态学观察、绘制细胞生长曲线、免疫细胞化学检测及碱性磷酸酶活性、钙结节的形成测定。结果：SD大鼠MSCs在体外分离培养扩增形态呈长梭形,细胞生长曲线呈S形。诱导条件下,细胞碱性磷酸酶活性明显增高,并出现了矿化结节。结论：SD大鼠MSCs体外分离培养体系能够成功建立,培养出的细胞能向成骨细胞分化,可以作为骨组织工程的种子细胞。     

颌骨骨髓基质细胞与牙周膜细胞的生物学特性比较

目的:比较颌骨骨髓基质细胞与牙周膜细胞的基本生物学特性。方法:分离颌骨来源骨髓基质细胞和牙周膜细胞,进行改良体外原代培养。倒置显微镜观察细胞生长及克隆形成情况;CCK-8检测细胞生长曲线;免疫荧光染色检测STR0-1表达;成脂诱导后检测脂滴形成,矿化诱导后检测碱性磷酸酶的变化并用RT-PCR检测7、14 d成骨相关基因OCN的表达水平。结果:两种细胞体外培养均呈成纤维样细胞外形,能克隆生长,均具有活跃的增殖能力;两种细胞STR0-1表达阳性;成脂诱导后可见脂滴形成;矿化诱导后骨髓基质细胞的碱性磷酸酶活性较强,而且OCN基因表达较早且较强。结论:颌骨来源骨髓基质细胞具有较强的增殖及成骨分化能力,具有干细胞特性,可能是有较大临床应用潜力的组织工程种子细胞。     

兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养、鉴定及向成骨细胞分化诱导

目的:探讨体外分离培养、鉴定兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法,并观察其向成骨细胞分化的潜能。方法:采用贴壁分离法分离培养兔BMSCs,通过细胞形态学观察和细胞表面抗原检测对细胞进行鉴定,并向成骨细胞分化诱导培养,通过钙钻法检测碱性磷酸酶表达,茜素红染色观察钙结节形成能力。结果:分离培养3d,可见贴壁细胞呈三角形、成纤维形或多角形外观,培养10～12d细胞长满瓶底,传代后细胞增殖明显加快;使用条件培养基传代培养2周,细胞呈集落生长后开始形成钙结节,茜素红染色阳性。结论:全骨髓贴壁法是一种简单实用的分离培养方法,可获得纯度较高的兔BMSCs,经过诱导后可向成骨细胞分化。     

大鼠骨髓基质干细胞体外培养及成骨作用的实验研究

目的研究大鼠骨髓基质干细胞在体外条件培养下的成骨能力，为骨组织工程选择理想的种子细胞来源。方法取大鼠骨髓基质干细胞进行体外培养，用倒置相差显微镜、钙染色、扫描电镜和X线能谱等手段观察细胞的生长情况和矿化能力。结果细胞呈贴壁型生长，形态为梭形或多角形，在条件培养液中这些细胞间不发生接触抑制，而是相互重叠成多层，形成钙化结节，与成骨细胞的特点相符合。碱性磷酸酶染色呈强阳性，结节钙染色阳性，X线能谱分析显示结节的主要组成元素为钙和磷。结论体外培养的大鼠骨髓基质干细胞具有与成骨细胞相似的形态特征，并能在体外形成钙化的新骨结节。     

静电纺聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜诱导骨髓间充质细胞成骨分化的研究

目的：观察静电纺聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜对骨髓间充质细胞（BMSCs）粘附、增殖和成骨分化的影响。方法：通过静电纺丝技术制备聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜,将第4代BMSCs接种于纤维膜,扫描电镜、碱性磷酸酶（ALP）和茜素红染色、MTT检测BMSCs粘附、分化及增殖能力。结果：在静电纺丝技术制备的聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜表面,BMSCs的黏附和增殖增强,呈现明显升高的ALP活性,并形成矿化结节,提示具有向成骨细胞方向分化的倾向。结论：静电纺聚己内酯/壳聚糖纳米纤维膜对BMSCs的细胞相容性较好,适合BMSCs的黏附生长,具有诱导其向成骨细胞分化的潜能,有望成为一种新型牙周组织工程支架材料。     

Construction of tissue-engineered bone with differentiated osteoblasts from adipose-derived stem cell and coral scaffolds at an ectopic site

Cell sheets from bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC) have been widely used in the field of bone tissue engineering, although their source remains a challenging issue. In this study, adipose-derived stem cells (ADSC) were induced to differentiate into osteoblasts, and the incorporation of coral scaffolds with ADSC sheets for bone formation at an ectopic site was also investigated. First, ADSC isolated from inguinal adipose tissue of New Zealand rabbits were cultured for two weeks without passaging under osteogenic induction, and the microstructures of cell sheets were analysed by histological and scanning electron microscope (EM) observation. In addition, the activity of alkaline phosphatase (ALP) and alizarin red staining was also measured to detect their osteogenic ability. Subsequently, ADSC were proved to be able to proliferate well when seeded on the coral scaffolds. Next, coral scaffolds were wrapped in cell sheets to prepare sheet-coral complexes, which were implanted into subcutaneous pockets in nude mice. At eight weeks after implantation, gross examination, microcomputed tomography (MicroCT), and histological analysis were investigated to assess new bone formation. MicroCT scanning and histological analysis showed that there was more highly dense tissue formed in the complex group than control group (p=0.0004). These results indicated that osteoblastic ADSC sheets could be used to construct engineered bone and the incorporation of coral scaffolds with ADSC sheets significantly improved bone formation, providing a newly approach for bone tissue engineering.     

骨髓间充质干细胞与支架材料nHA/PA66复合培养的生物活性研究

目的：研究骨髓间充质干细胞与支架材料-纳米羟基磷灰石/聚酰胺66（nHA/PA66）复合培养时生物学特性。方法：体外培养兔骨髓间充质干细胞（MSCs）,并分为A、B、C、D四组。A组为对照;B组和D组进行骨向诱导;同时,C组和D组细胞与nHA/PA66复合培养。应用MTT实验、碱性磷酸酶（ALP）染色和生物化学分析、扫描电镜,分别对各组细胞的增殖速度、ALP活性及细胞在支架上的黏附情况进行检测。结果：MTT结果显示,A组细胞增殖曲线与C组相似,而B组和D组相似;A组和C组细胞增殖略高于B组和D组。结果表明,骨向诱导可使细胞增殖轻微下降,而与支架材料复合培养对MSCs增殖无影响。ALP染色及ALP活性生化分析进一步表明,MSCs与支架材料复合培养对其骨向分化能力无影响。SEM观察则表明,C组细胞和D组细胞与支架材料均粘附良好。结论：nHA/PA66适于MSCs的黏附、增殖及骨向分化,是一种极具价值的骨组织工程支架材料。     

人髁突骨髓间充质干细胞体内成骨的实验研究

目的 探讨人髁突来源骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSC)体内分化成骨的能力,为构建组织工程髁突提供种子细胞.方法取切除的人髁突冲洗收集骨髓细胞,采用密度梯度离心和贴壁培养法进行培养和纯化BMSC,取第3或4代BMSC进行成骨细胞和成软骨细胞诱导分化后接种于珊瑚骨支架表面,扫描电镜观察细胞在支架表面的黏附和增殖状况.将成骨或成软骨细胞-珊瑚骨支架植入裸鼠背部皮下,6和9周后观察体内成骨和成软骨情况.结果 培养3～7d后扫描电镜显示细胞黏附于珊瑚骨支架表面,呈多层生长,并跨越微孔连成网状或片状;植入裸鼠体内9周,髁突形珊瑚骨支架均基本维持最初的形态,可见散在或片状的新生骨形成,新生软骨呈岛状分布.结论从人髁突骨髓中分离出的BMSC具有体内形成新骨和软骨组织的能力,可作为构建组织工程髁突的种子细胞.     

载辛伐他汀PLGA/CPC复合骨髓基质干细胞构建组织工程骨的实验研究

目的：探讨载辛伐他汀PLGA/CPC复合骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells)构建组织工程骨的可行性,并筛选辛伐他汀的有效载药量。方法：采用溶剂浇铸—粒子沥滤技术结合相分离法,制备不同浓度(辛伐他汀质量分别为0.1、0.5、1 mg)的载辛伐他汀PLGA/CPC复合支架材料,扫描电镜观察孔隙率,绘制药物释放曲线;茜素红染色、I型胶原染色观察成骨诱导液和辛伐他汀对骨髓基质干细胞向成骨分化的作用;将第3代BMSCs经dil染色后,接种于不同浓度的复合支架材料上,扫描电镜、激光共聚焦显微镜观察细胞在支架上的黏附情况,CCK-8和碱性磷酸酶(ALP)检测对其增殖和分化作用;采用SPSS 18.0软件包对数据进行统计学分析。结果：支架材料孔隙率达90%以上,孔径平均200~300 μm,载药组药物持续缓慢释放,未见药物突释现象;经辛伐他汀和成骨诱导组I型胶原表达阳性,茜素红染色可见明显钙结节;4组支架材料与细胞黏附性较好,0.5 mg组细胞生长状态最佳。CCK-8和ALP检测0.5 mg组能够明显促进细胞的增殖和分化。结论：辛伐他汀和成骨诱导液联合利用,能够更有效地促进BMSCs向成骨分化;载辛伐他汀PLGA/CPC复合支架材料是理想的组织工程支架材料;载0.5 mg辛伐他汀PLGA/CPC支架材料能够有效促进BMSCs的增殖和分化。     

Isolation and characterization of multipotent human periodontal ligament stem cells

BACKGROUND: Periodontal ligament (PDL) repair is thought to involve mesenchymal progenitor cells capable of forming fibroblasts, osteoblasts and cementoblasts. However, full characterization of PDL stem cell (SC) populations has not been achieved. OBJECTIVE: To isolate and characterize PDLSC and assess their capability to differentiate into bone, cartilage and adipose tissue. METHODS: Human PDL cells were stained for STRO-1, FACS sorted and expanded in culture. Human bone marrow SC (BMSC) served as a positive control. PDLSC and BMSC were cultured using standard conditions conducive for osteogenic, chondrogenic and adipogenic differentiation. Osteogenic induction was assayed using alizarine red S staining and expression of alkaline phosphatase (ALP) and bone sialoprotein (BSP). Adipogenic induction was assayed using Oil Red O staining and the expression of PPAR gamma 2 (early) and LPL (late) adipogenic markers. Chondrogenic induction was assayed by collagen type II expression and toluidine blue staining. RESULTS: Human PDL tissue contains about 27% STRO-1 positive cells with 3% strongly positive. In osteogenic cultures ALP was observed by day-7 in BMSC and day-14 in PDLSC. BSP expression was detectable by day-7; with more intense staining in PDLSC cultures. In adipogenic cultures both cell populations showed positive Oil Red O staining by day-25 with PPAR gamma 2 and LPL expression. By day-21, both BMSC and PDLSC chondrogenic induced cultures expressed collagen type II and glycosaminoglycans. CONCLUSIONS: The PDL contains SC that have the potential to differentiate into osteoblasts, chondrocytes and adipocytes, comparable with previously characterized BMSC. This adult PDLSC population can be utilized for potential therapeutic procedures related to PDL regeneration.