人牙周膜成纤维细胞的培养及牵张应变诱导凋亡研究

目的:探讨人牙周膜成纤维细胞的分离、培养及在牵张应变作用下发生早期凋亡的情况。方法:刮取健康人前磨牙牙周膜,进行牙周膜成纤维细胞的分离、培养及生长曲线描绘。经3～4代传代培养后,对细胞加载1%～20%的牵张应变,加载时间分别为30min,1h、6h、12h然后通过流式细胞仪检测Annexin V-FITC(异硫氰酸荧光素)及激光扫描共聚焦显微镜进行细胞的早期凋亡鉴定。结果:人牙周膜成纤维细胞传代到12代以后,细胞逐渐呈衰老生状,胞体变大,细胞生长缓慢。人牙周膜成纤维细胞的凋亡率在30min组低于对照组,但两者间无统计学差异。在6h内,人牙周膜成纤维细胞的凋亡情况随加载时间和加载应力的增加而增加(P<0.05)。在12h时所有组的细胞凋亡均减少。结论:人牙周膜成纤维细胞的使用最好在12代以内,尤其是3～4代细胞的活力、增殖能力较好。牵张应变可以诱导细胞发生早期凋亡。     

人牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞生物学活性的研究

目的:体外原代培养人牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞,并对其生物学活性作初步探讨.方法:采用组织块法原代培养牙周膜细胞和牙龈成纤维细胞,绘制生长曲线,测定二者碱性磷酸酶活性;流式细胞术和免疫组化染色法测定Ⅰ、Ⅲ型胶原、骨形成蛋白的表达情况,观察对比两种细胞的生物学特性的异同.结果:牙龈成纤维细胞原代培养成功率及细胞增殖活性明显高于牙周膜细胞.在牙周膜细胞中,Ⅰ、Ⅲ型胶原均为阳性表达,棕黄色颗粒克满整个胞浆内.在牙龈成纤维细胞中Ⅰ型胶原为弱阳性表达,Ⅲ型胶原阳性表达更弱.牙周膜细胞的ALP水平明显高于牙龈成纤维细胞.牙周膜细胞BMP2表达为强阳性,而牙龈成纤维细胞表达弱阳性.结论:牙周膜细胞具有较强的成骨能力,是理想的牙周组织工程的种子细胞.牙龈成纤维细胞易于培养成活,增殖力强,具有牙周膜细胞的一些特点,组织取材方便,也可作为牙周组织工程的种子细胞.     

体外培养人牙周牙髓相关细胞中釉原蛋白的表达

目的:观察釉原蛋白(amelogenin,Am)基因在体外培养的人牙龈上皮细胞及口腔外胚间充质来源细胞(人牙龈成纤维细胞、人牙周膜成纤维细胞和人牙髓细胞)中的表达.方法:采用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术,检测培养细胞中釉原蛋白mRNA的表达.采用蛋白质免疫印迹技术检测培养细胞中釉原蛋白的表达.结果:培养的人牙周膜成纤维细胞、牙髓细胞、牙龈成纤维细胞和牙龈上皮细胞中均未检测到釉原蛋白及其mRNA的表达.结论:体外培养的人牙周膜成纤维细胞、牙髓细胞、牙龈成纤维细胞和牙龈上皮细胞不表达釉原蛋白基因.     

NF-κB在人牙周膜成纤维细胞凋亡中的作用

目的:探讨人牙周膜成纤维细胞在无血清培养液中的凋亡及NF-κB在细胞凋亡中的作用.方法:用倒置显微镜和Hochest 33258染色法,观察人牙周膜成纤维细胞在更换无血清培养液后6,12,24,36,48h的生长和凋亡变化;采用流式细胞仪检测无血清培养条件下不同时间对细胞凋亡的影响;利用RT-PCR半定量技术分析NF-...     

尼古丁诱导人牙周膜成纤维细胞凋亡的实验研究

目的：了解在体外培养环境中,尼古丁对人牙周膜成纤维细胞凋亡的影响。方法：将尼古丁作用于培养至第6代的人牙周膜成纤维细胞后,通过四唑盐比色法、流式细胞仪研究尼古丁能否诱导人牙周膜成纤维细胞凋亡。结果：四唑盐比色法证实当尼古丁浓度在0.05～4mg/L之间时,对牙周膜成纤维细胞的抑制呈浓度依赖性,流式细胞仪分析提示,当尼古丁浓度在0.5～4mg/L之间时,对牙周膜成纤维细胞的凋亡率呈浓度依赖性。结论：尼古丁对人牙周膜成纤维细胞有一定的毒性作用,通过抑制牙周膜成纤维细胞增殖和诱导凋亡加重对周膜的破坏。     

体外培养人牙周膜成纤维细胞及其成骨表型特征检测

目的　探讨牙周膜成纤维细胞作为牙周组织工程种子细胞的可行性。方法　采用酶消化法体外培养人牙周膜成纤维细胞 ,以人胎儿皮肤成纤维细胞为对照检测细胞碱性磷酸酶表达及矿化能力。结果　体外培养人牙周膜成纤维细胞与人胎儿皮肤成纤维细胞相比表达更高水平的碱性磷酸酶 (P <0 .0 5 ) ,矿化诱导液连续培养 30d均可观察到矿化结节形成。结论　采用酶消化法可快速简便地获取原代人牙周膜成纤维细胞。体外培养牙周膜成纤维细胞具有成骨样细胞表型特征 ,与人胎儿皮肤成纤维细胞相比更具分化潜能 ,可作为牙周组织工程种子细胞来源     

尼古丁对人牙周膜成纤维细胞增殖能力的影响

目的：体外研究尼古丁对人牙周膜成纤维细胞增殖能力的影响。方法：用不同浓度的尼古丁与体外培养的人牙周膜成纤维细胞作用不同时间,用MTT比色法测定细胞的生长情况,流式细胞分析法测定尼古丁对细胞周期的影响。结果：各浓度的尼古丁组均能抑制人牙周膜成纤维细胞的生长,但不同浓度尼古丁对牙周膜细胞的抑制作用无明显差异;各浓度组尼古丁均能降低G1的比例,高浓度尼古丁（5×10^-1g/L）组G1期比例降至84.62%,G2/M期升高至12.83%。结论：尼古丁能抑制人牙周膜成纤维细胞的生长,并影响其细胞周期的进程。     

牙周膜成纤维细胞在三维静电纺丝纳米纤维支架上的培养

目的:研究人牙周膜成纤维细胞与静电纺丝聚乳酸/聚己内酯纳米纤维支架体外培养的生物相容性.方法:分离、培养人牙周膜成纤维细胞,接种在静电纺丝纳米纤维支架上,与常规培养条件下的细胞进行比较,观察生长形态、生长曲线、倍增时间及活性.结果:人牙周膜成纤维细胞生长情况与常规培养基本一致,2组间的倍增时间比较无统计学差异(P＞0.05),活细胞百分率与正常培养无明显统计学差异(P＞0.05).结论:人牙周膜成纤维细胞在三维静电纺丝纳米纤维上生长、增殖,该支架材料具有很好的生物相容性,可作为牙周膜组织工程候选支架材料.     

体外培养人牙周膜细胞成骨基因表达谱的检测

目的:探讨体外培养人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells,hPDL)成骨相关基因的表达谱,明确体外培养人牙周膜细胞的成骨潜能。方法:消化离心法收集体外培养人牙周膜细胞,提取总RNA,使用Super-array公司的点样数96点的人骨再生基因表达谱芯片检测人牙周膜细胞成骨相关基因的表达。结果:体外培养人牙周膜细胞有15种成骨相关基因无表达,81种基因有表达,其中表达较高的基因22种。结论:体外培养人牙周膜细胞具有部分成骨细胞基因表型特征,但成熟成骨细胞的特征基因表达量较低,提示人牙周膜细胞是具有成骨细胞分化潜能的成纤维细胞。     

丹参对人牙周膜成纤维细胞骨保护素表达的影响

目的:研究丹参对体外培养的人牙周膜成纤维细胞骨保护索(OPG)表达的影响.方法:原代培养人牙周膜成纤维细胞,传代至第5代,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及酶联免疫吸附试验(ELISA),分别检测不同浓度丹参对体外培养的人牙周膜成纤维细胞OPG mRNA表达及上清中OPG蛋白含量改变的影响,采用SPSS15.0软件包对数据进行统计学分析.结果:不同浓度丹参作用1h后,丹参处理组人牙周膜成纤维细胞OPG mRNA表达均较对照组增强(P<0.05);不同浓度丹参作用12h后,丹参处理组上清液中OPG蛋白质含量显著高于对照组(P<0.05).结论:丹参能够促进体外培养的人牙周膜成纤维细胞合成并分泌OPG.     

雌激素对牙周膜细胞生物学性质的影响

目的：明确雌激素对体外牙周膜成纤维细胞迁移、增殖和碱性磷酸酶的影响，以探讨雌激素对牙周组织改建的影响。方法：SD大鼠来源的牙周膜成纤维细胞经传代培养至第四代，建立体外创伤模型，分别在普通培养基和含雌激素的培养基中培养，观察测量细胞迁移情况，运用MTT、酶联检测仪测定细胞的增殖速度，对细胞的ALP进行提取和测定。结果：MTT结果硅示加入雌激素对该细胞的增殖无明显影响；在含雌激素的培养基中成纤维细胞的迁移速度加快；同时牙周膜成纤维细胞的ALP表达娃著提高。结论：雌激素能明显促进牙周膜成纤维细胞的迁移，促进其分化。     

脂联素对人牙周膜成纤维细胞的作用

目的:原代培养人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament cell,hPDLC),研究脂联素受体(adiponectinreceptor,Adipo R)在hPDLC中的表达情况,以及脂联素(adiponectin,ADP)对hPDLC增殖的作用。方法:收集因正畸需要而拔除的健康前磨牙10颗,玻片覆盖组织块法原代培养hPDLC,RT-PCR法检测分析AdipoR1和AdipoR2在hPDLC中的表达。使用不同浓度ADP(0,5,10,20ng/μL)刺激体外培养的hPDLC,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法,分别测定第1、4、7天的细胞增殖活性。采用SSPS16.0软件包对数据进行统计学分析。结果:免疫组化显示,培养的细胞波形丝蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,证明体外原代培养细胞及传代细胞均为中胚层组织来源的hPDLC,且无上皮来源细胞混杂。琼脂糖凝胶电泳检测显示,Adipo R2在人牙周膜成纤维细胞中表达阳性。MTT法检测的生长曲线显示,随着ADP浓度的增加,细胞增殖活性增加。培养24h后,C、D组与对照组相比差异显著(P相似文献   

Er：YAG 激光照射对人牙周膜成纤维细胞增殖的影响

目的：观察离体培养的人牙周膜成纤维细胞在 Er：YAG 激光照射后其增殖能力的变化。方法：离体培养的人牙周膜成纤维细胞,进行常规免疫组化染色,鉴定细胞来源。选用第5代人牙周膜成纤维细胞,随机分为5组,A 组为对照组,不接受激光照射。实验组分别接受频率为10 Hz 的不同能量 Er：YAG 激光照射,参数分别为 B 组：50 mJ,C 组：100 mJ,D 组：150 mJ,E 组：200 mJ。分别于1、3、5、7、9 d 使用 CCK-8法测定细胞生长情况,分析其增殖能力的变化。结果：培养第5天时 B～E 组细胞增殖率高于 A 组（P ＜0．05）。结论：低能量,短时间的 Er：YAG 激光照射能促进牙周膜成纤维细胞的增殖能力。     

Response of periodontal ligament fibroblasts and gingival fibroblasts to pulsating fluid flow: nitric oxide and prostaglandin E2 release and expression of tissue non-specific alkaline phosphatase activity

The capacity of the periodontal ligament to alter its structure and mass in response to mechanical loading has long been recognized. However, the mechanism by which periodontal cells can detect physical forces and respond to them is largely unknown. Besides transmission of forces via cell-matrix or cell-cell interactions, the strain-derived flow of interstitial fluid through the periodontal ligament may mechanically activate the periodontal cells, as well as ensure transport of cell signaling molecules, nutrients and waste products. Mechanosensory cells, such as endothelial and bone cells, are reported to respond to a flow of fluid with stimulated prostaglandin E2 (PGE2) and nitric oxide production. Therefore, we examined the PGE2 and nitric oxide response of human periodontal ligament and gingival fibroblasts to pulsating fluid flow and assessed the expression of tissue non-specific alkaline phosphatase activity. Periodontal ligament and gingival fibroblasts were subjected to a pulsating fluid flow (0.7 +/- 0.02 Pa, 5 Hz) for 60 min. PGE2 and nitric oxide concentrations were determined in the conditioned medium after 5, 10, 30 and 60 min of flowing. After fluid flow the cells were cultured for another 60 min without mechanical stress. Periodontal ligament fibroblasts, but not gingival fibroblasts, responded to fluid flow with significantly elevated release of nitric oxide and decreased expression of tissue non-specific alkaline phosphatase activity. In both periodontal ligament and gingival fibroblasts, PGE2 production was significantly increased after 60 min of flowing. Periodontal ligament fibroblasts, but not gingival fibroblasts, produced significantly higher levels of PGE2 during the postflow culture period. We conclude that human periodontal ligament fibroblasts are more responsive to pulsating fluid flow than gingival fibroblasts. The similarity of the early nitric oxide and PGE2 responses to fluid flow in periodontal fibroblasts with bone cells and endothelial cells suggests that these three cell types possess a similar sensor system for fluid shear stress.     

碱性成纤维细胞生长因子对成骨细胞和牙周膜成纤维细胞迁移、增殖的影响

目的　明确碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对体外成骨细胞和牙周膜成纤维细胞迁移、增殖的影响,以 探讨在牙种植体组织界面局部应用bFGF诱导类牙周膜形成的可行性。方法　同一只SD大鼠来源的成骨细胞和 牙周膜成纤维细胞经传代培养至第4代,建立体外创伤模型,分别在普通培养基和含bFGF的培养基中培养,观察 细胞迁移情况,四唑盐比色实验(MTT)测定细胞的增殖速度。结果　普通培养基中,成骨细胞迁移速度快于成纤维 细胞。加bFGF培养基中牙周膜成纤维细胞迁移速度明显快于其他各组,同时MTT结果显示加入bFGF能明显促进 两种细胞的增殖。结论　bFGF能明显促进牙周膜成纤维细胞的增殖、移行。     

热休克蛋白70对人牙周膜细胞高温损伤影响的研究

目的 观察谷氨酰胺（glutamine,Gln）诱导的热休克蛋白70(heat shock protein,HSP)对人牙周膜细胞高温损伤的影响。 方法 将体外培养的人牙周膜细胞随机分为正常对照组(C组)：常规培养的人牙周膜细胞;谷氨酰胺预处理组(Gln组)：常规培养的人牙周膜细胞加入Gln 15 mmol/L培养;高温损伤组(SH组)：常规培养的人牙周膜细胞置46 ℃培养1 h后恢复常规培养;预处理+高温损伤组(Gln+SH组)：常规培养的人牙周膜细胞加入Gln 15 mmol/L培养1 h后,置于46 ℃培养1 h后恢复常规培养。以Western Blot检测细胞内HSP70的表达变化;以四唑盐（MTT）比色法、细胞形态学观察评价细胞存活能力。 结果 Western Blot显示： Gln组、Gln+SH组较C组HSP70表达上调（P<0.05）;MTT比色法、细胞形态学观察均显示Gln+SH组较SH组的细胞存活能力强（P<0.05）。 结论 Gln可诱导人牙周膜细胞中的HSP70表达上调,减轻高温对人牙周膜细胞的损伤。     

The effect of local delivery of PDGF-BB on attachment of human periodontal ligament fibroblasts to periodontitis-affected root surfaces--in vitro

BACKGROUND/AIMS: The purpose of this study was to determine at what concentration does platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) provide for optimal stimulation of human periodontal ligament fibroblasts (PDL) to adhere to periodontitis affected root surfaces. METHOD: 80 root dentine specimens were prepared from extracted periodontally diseased teeth obtained from patients ranging in age between 35 to 60 years. The root dentine specimens were associated with the subgingival area opposing the periodontal pocket for each extracted tooth. 10 healthy root dentine specimens were obtained from teeth extracted for orthodontic reasons and served as controls. The specimens were distributed into 9 groups (10 specimens in each). In group 1, PDL fibroblasts were cultured on the specimen surface of a diseased treated control. In group 2, PDL fibroblasts were cultured on the specimen surface of a healthy control. In groups 3 to 9, PDL fibroblasts were cultured on a pre-treated specimen surface with concentrations ranging from 5, 10, 20, 50, 100, 200 and 300 ng/ml PDGF-BB, respectively. After 24 h incubation, the media were removed, specimens were fixed, processed for SEM viewing and photographed at 750x. Fibroblast adherence was measured by counting number of cells within a standard test area and cell morphology was scored. RESULTS: Findings suggest dentine specimens pretreated with 5, 10 and 20 ng/ml PDGF-BB were not significantly different in number of adherent cells from the diseased treated control. However, at concentrations of 50, 100, 200 and 300 ng/ml, a highly significant increase in number of adherent fibroblasts was detected when compared to the diseased treated control. At these concentrations, the cell morphology was comparable to that of the healthy control. CONCLUSIONS: PDGF-BB in concentrations equal to or greater than 50 ng/ml demonstrates a significant stimulation of PDL cells adherence to periodontal diseased root surfaces. Since the higher concentrations resulted in similar effects as obtained by 50 ng/ml, it may therefore be considered that this concentration provides for optimal stimulation of human periodontal ligament fibroblasts (PDL) to adhere to periodontitis-affected root surfaces.     

血管内皮细胞对牙周组织细胞增殖的影响

目的：通过血管内皮细胞与牙周组织细胞复合培养模拟牙周组织再生环境,观察血管内皮细胞对牙周组织细胞增殖的作用规律,探讨血管内皮细胞对牙周组织修复再生的影响。方法：应用原代培养的血管内皮细胞,在Transwell嵌套中实现与人牙周膜成纤维细胞、牙龈成纤维细胞间的复合培养,分别于复合培养第2、4、6、8和10天,以细胞计数手段检测血管内皮细胞共存条件下2种牙周组织细胞的增殖情况,并与单独培养的2种牙周组织细胞作为对照,采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析。结果：在血管内皮细胞存在条件下,2种牙周组织细胞的增殖速率均显著高于单独培养条件。血管内皮细胞存在时,牙周膜成纤维细胞增殖速率逐渐超越牙龈成纤维细胞(第6天起),并在第8天细胞数量上超过牙龈成纤维细胞,差异具有显著性(P<0.01)。结论：血管内皮细胞的存在,对牙周组织细胞的增殖具有促进作用,对牙周膜成纤维细胞增殖的促进作用显著高于牙龈成纤维细胞。     

牙龈成纤维细胞、牙周膜细胞对白细胞介素8的趋化反应

目的评价牙龈成纤维细胞、牙周膜细胞对白细胞介素8（interleukin-8,IL-8）的趋化反应。方法将体外培养第6代的牙龈成纤维细胞和牙周膜细胞（2.5×10