复方丹参滴丸对培养的乳鼠心肌细胞缺氧及缺氧/复氧时Fas/FasL蛋白表达的影响

探讨复方丹参滴丸 (DanShenPill,DSP)对培养的乳鼠心肌细胞缺氧及缺氧 /复氧时凋亡相关基因Fas/FasL蛋白表达的影响。方法 :按常规培养新生 4d乳鼠心肌细胞 ,于培养 2 4h后进行缺氧及缺氧 /复氧实验 ,以免疫组织化学方法检测心肌细胞Fas/FasL蛋白表达的变化。结果 :缺氧 4 5h及 10 5h后 ,心肌细胞Fas/FasL蛋白的阳性表达指数 (positiveexpressionindex ,PEI %)均显著高于对照。 10 5h组与 4 5h组无明显差异。复方丹参滴丸组PEI明显低于缺氧组 (P <0 0 5 )。缺氧 30min后再给氧 4h与 10h ,心肌细胞Fas/FasL蛋白的PEI显著高于对照 ,复氧 10h组与 4h组无明显差异 ,复方丹参滴丸组PEI低于缺氧复氧组 (P <0 0 5 )。结论 :缺氧及缺氧 /复氧时均有凋亡相关基因Fas及其配体FasL蛋白表达的增强 ,复方丹参滴丸可通过下调Fas/FasL蛋白表达以减少凋亡从而减轻缺氧损伤及缺氧 /复氧损伤。     

复方丹参滴丸对缺氧心肌细胞内钙离子平均荧光强度的影响

目的:探讨复方中药丹参滴丸对缺氧/复氧心肌细胞的保护作用。方法:培养的乳鼠心肌细胞,用钙探针Fluo-3/AM染色,利用激光扫描共聚焦显微镜观察心肌细胞缺氧/复氧及在复方丹参滴丸保护作用下心肌细胞内钙离子荧光强度变化。结果:缺氧加丹参保护组,细胞内钙离子荧光强度(1217.78±312.07)明显低于单纯缺氧组(1509.43±508.58);缺氧复氧加丹参组,细胞内钙离子荧光强度为(1567.91±577.61),亦较缺氧再给氧组(1617.6±477.53)低。结论:复方丹参滴丸对缺氧心肌细胞有明显保护作用。     

钙敏感受体表达增加诱发内质网应激在缺氧复氧性心肌损伤中的作用

目的：观察钙敏感受体表达增加诱发内质网应激在缺氧复氧性心肌损伤中的作用。方法:乳鼠原代心肌细胞培养4-5 d后，随机分为5组:正常对照组（N组）、缺氧/复氧组（H/Re组）、阻断剂（NiCl2,CdCl2）组、激动剂（GdCl3,NiCl2,CdCl2）组和caffeine组。采用饱和氮气pH6.8的D-Hands液培养细胞3 h，再用含20%新生牛血清的DMEM液培养细胞9 h，复制心肌缺氧/复氧模型。检测血清LDH活力，MTT检测细胞存活率，心肌细胞caspase-12和CaSR 蛋白表达水平Western blotting检测, 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）测定心肌细胞内游离钙的变化。结果:缺氧/复氧组和激动剂组LDH活力、细胞内游离钙浓度均高于对照组;同时，caspase-12和CaSR的表达也明显高于对照组。反之，细胞存活率低于对照组。结论:心肌缺氧/复氧过程中，钙敏感受体表达增多,从而破坏了细胞内钙稳态诱发过度的内质网应激,通过caspase-12等凋亡蛋白表达的增多等途径引起心肌细胞凋亡。     

淫羊藿苷对缺血/再灌致神经元损伤的保护作用研究

目的 :观察淫羊藿苷对体外模拟缺血 /再灌致神经元损伤的保护作用 ,初步探讨其可能的作用机制。方法 :原代培养大鼠乳鼠大脑皮层神经元 ,分别在缺氧和缺糖 (6h) /再复氧和复糖培养后不同时间点 (0、3、1 2、2 4h)检测细胞活度、LDH活性、细胞凋亡率和细胞内游离钙离子浓度。结果 :淫羊藿苷 0 .2 5、0 .5和1mg·L 1明显减轻缺氧和缺糖 /复氧和复糖致神经细胞损伤 ,提高神经元MTT值 ,减少乳酸脱氢酶释放 ,减少凋亡和抑制细胞内游离钙离子浓度的升高。结论 :淫羊藿苷具有保护神经元抵抗模拟缺血性损伤的作用 ;其阻止细胞内钙离子超载可能是…     

环加氧酶-2在大鼠原代皮质神经细胞缺氧损伤中的作用

目的:观察环加氧酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)在原代培养的大鼠皮质神经细胞缺氧-再给氧损伤中的作用以及COX-2特异性抑制剂NS398的保护作用。方法: 原代培养大鼠皮质神经细胞,随机分为对照组(未处理组)、缺氧再给氧组、COX-2特异性抑制剂NS398+缺氧再给氧组。用噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞生存率,用Western印迹法检测COX-2蛋白质的表达,用DNA凝胶电泳法检测细胞凋亡情况。结果: 培养的大鼠原代皮质神经细胞经缺氧再给氧处理后,COX-2蛋白质表达水平明显高于对照组及缺氧再给氧+NS398组(P＜0.05);缺氧再给氧+NS398予处理组神经细胞生存率明显高于单独缺氧再给氧组(P＜0.05和P＜0.01),DNA凝胶电泳显示DNA断裂显著减轻。结论:COX-2参与缺氧再给氧后神经细胞凋亡的病理过程,COX-2特异性抑制剂明显减轻缺氧再给氧后神经细胞的损伤,保护神经细胞免遭缺氧诱导的细胞凋亡。     

缺氧、高氧对肝星形细胞基质金属蛋白酶Ⅱ表达及活性的影响

目的　研究缺氧、高氧对肝星形细胞基质金属蛋白酶Ⅱ (MMP 2 )表达及其活性影响。方法　分离大鼠肝星形细胞 ,在缺氧或高氧条件下培养 ,以免疫细胞化学标记链霉素卵白素生物素(LSAB)法及酶联免疫吸附 (ELISA)法分别检测细胞内MMP 2、基质金属蛋白酶组织抑制因子Ⅱ(TIMP 2 )、膜型基质金属蛋白酶Ⅰ (MT1 MMP)的表达 ,和培养上清中MMP 2、TIMP 2的相对含量 ,并以酶谱法测培养上清MMP 2活力。结果　 (1)缺氧培养 12h ,MMP 2表达增高 (缺氧组阳性指数 :5 7±2 0 ;对照组 :3 2± 1 0 ,;P <0 0 1) ,TIMP 2表达则降低 (缺氧组阳性指数 :2 5± 0 7;对照组 :3 6±1 0 ;P <0 0 5 ) ;培养上清中MMP 2酶活性明显降低 (缺氧组总吸光度值 :7 334± 1 92 2 ;对照组 :17 2 77± 7 4 2 4 ;P <0 0 1)。缺氧不同时段 (6、12、2 4h)比较 ,变化以 6h段最明显。 (2 )高氧培养 12h ,上清中MMP 2、TIMP 2蛋白相对含量均高于对照组 ,TIMP 2更明显 (高氧组A450 :0 0 5 0± 0 0 14 ;对照组 :0 0 2 2± 0 0 10 ;P <0 0 1) ,酶活性亦高于对照组 (高氧组总吸光度值 :5 2 5 2± 0 771;对照组 :4 30 4± 1 0 83;P <0 0 5 ) ,高氧组MT1 MMP表达增强。结论　肝星形细胞对氧敏感。缺氧使肝星形细胞MMP 2表达增加 ,该影响在     

丹参滴丸对缺血/再灌注损伤心肌高能磷酸化合物的影响

目的 :进一步探讨丹参滴丸对缺血 /再灌注损伤心肌的保护作用及其机制。方法 :采用Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ离体心脏灌流技术 ,制备心肌缺血 /再灌注损伤模型 ,利用高效液相色谱仪 (ＨＰＬＣ)测定离体大鼠心肌组织中的高能磷酸化合物的含量变化。本实验共分 6组 :正常对照组 :大鼠心脏离体后 ,接在灌流装置上持续灌流 75ｍｉｎ。单纯缺血再灌组 :先预灌 1 5ｍｉｎ ,然后停止灌流 ,保持心脏温度恒定在 37℃ ,在无氧 ,无灌流液的条件下旷置 40ｍｉｎ ,再恢复灌流 2 0ｍｉｎ。丹参滴丸前保护组 :预灌时加丹参滴丸 ,后处理同单纯缺血再灌组。丹参…     

MicroRNA-30a调控Beclin-1对缺氧复氧乳鼠心肌细胞的保护效应

目的: 观察microRNA-30a(miR-30a)在原代心肌细胞缺氧复氧中的作用,探讨miR-30a保护缺血再灌注心肌的分子机制。方法: 重组构建慢病毒miR-30a表达载体(LV-GFP-miR-30a)感染原代乳鼠心肌细胞,构建缺氧复氧损伤模型。实验分为正常培养组、单纯缺氧复氧组、LV-GFP加缺氧复氧组、LV-miR-30a-GFP加缺氧复氧组和3-甲基腺嘌呤(3-MA)加缺氧复氧组。Real-time PCR检测缺氧复氧和慢病毒感染对miR-30a的表达影响,Western blotting检测LC3和Beclin-1蛋白表达变化,TUNEL和PI染色检测缺氧复氧后心肌细胞死亡情况。结果: (1)缺氧复氧后心肌miR-30a表达水平下调(P<0.05);(2)慢病毒miR-30a表达载体高效感染后心肌细胞miR-30a表达水平上调(P<0.05),心肌过表达miR-30a下调Beclin-1蛋白表达(P<0.05);(3)心肌过表达miR-30a抑制缺氧复氧后Beclin-1表达(P<0.05);3-MA处理减少缺氧复氧后心肌Beclin-1表达,减少缺氧复氧后LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ(P<0.05);(4)过表达miR-30a和3-MA处理减少缺氧复氧后心肌细胞凋亡(P<0.05)。结论: 心肌细胞过表达miR-30a显著下调Beclin-1;抑制自噬可以减少缺氧复氧后心肌细胞死亡。     

缺氧后适应中蛋白激酶Cε与钙敏感受体相互作用对乳鼠心肌细胞的保护作用

目的:研究缺氧后适应中蛋白激酶Cε(PKCε)与钙敏感受体(CaR)相互作用对乳鼠心肌细胞的保护作用.方法:Wistar乳鼠(出生后3-7 d)心肌细胞培养3-5 d,随机分为7组:正常对照组(N组),缺氧/复氧组(H/Re组),缺氧后适应组(HPC组),GdCl3组(GdCl3,NiCl2,CdCl2组),caffeine组(caffeine, GdCl3,NiCl2,CdCl2组),PKCε抑制剂组(PKCI组)和PKCI+GdCl3组 (PKCI,GdCl3,NiCl2,CdCl2组).采用饱和氮气pH6.8的D-Hanks液和含20%新生牛血清的DMEM液复制心肌缺氧/复氧模型.检测各组细胞存活率及各组乳酸脱氢酶(LDH)活力和丙二醛(MDA)含量变化,Western blotting检测心肌细胞膜CaR和PKCε蛋白表达水平,免疫共沉淀检测细胞膜上CaR和PKCε的相互作用,激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)测定心肌细胞内游离钙([Ca2+]i)的变化,TUNEL染色观察细胞凋亡.结果:H/Re、GdCl3和PKCI组的细胞存活率低于对照组和HPC组;反之,LDH活力和MDA含量高于对照组和HPC组.同时,在GdCl3、caffeine和PKCI+ GdCl3组CaR的蛋白表达水平较HPC和PKCI组增高,且[Ca2+]i和细胞凋亡率也高于后2组;而PKCI和PKCI+ GdCl3组PKCε蛋白表达水平低于H/Re、HPC、GdCl3和caffeine组.免疫共沉淀检测到CaR和PKCε在细胞膜上发生相互作用.结论:在乳鼠心肌细胞缺氧后适应中,PKCε已转位到细胞膜和CaR相互作用,此相互作用能减少[Ca2+]i,对缺氧的乳鼠心肌细胞在进行复氧时产生保护作用.     

热休克诱导HO-1基因在乳鼠心肌细胞中的表达 及其抗氧自由基损伤作用

目的 :观察血红素加氧酶 - 1 (ｈｅｍｅｏｘｙｇｅｎａｓｅ ,ＨＯ - 1 )基因在热休克处理的乳鼠心肌细胞中的表达及其抗氧自由基损伤的作用。方法 :取生后 2～ 3ｄ的Ｗｉｓｔａｒ鼠若干 ,雌雄不限 ,摘取心脏 ,剪碎至 1ｍｍ× 1ｍｍ× 1ｍｍ大小 ,胰酶消化法分离、培养乳鼠心肌细胞 ,一周后 ,将细胞分别在 42℃热休克处理 0 5ｈ ,1ｈ ,3ｈ ,5ｈ ,提取细胞总ＲＮＡ ,以Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交技术观察ＨＯ - 1基因在乳鼠心肌细胞中的表达及其时间依赖性关系。同时以黄嘌呤 /黄嘌呤氧化酶氧自由基发生系统作用于热休克处理 5ｈ的乳鼠心肌细胞 ,…     

降钙素基因相关肽对高脂复合缺氧/复氧诱导乳鼠心肌细胞凋亡的影响

背景:前期研究表明,结扎冠状动脉可诱发大鼠传入神经纤维末梢逆向释放降钙素基因相关肽,提示降钙素基因相关肽参与了急性心肌缺血的病理生理过程。目的:观察降钙素基因相关肽对氧化低密度脂蛋白孵育缺氧/复氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的影响。方法:20孔原代培养的乳鼠心肌细胞随机分为5组:正常对照组、氧化低密度脂蛋白组、氧化低密度脂蛋白+缺氧/复氧组、降钙素基因相关肽组和CGRP8-37组。后4组均用氧化低密度脂蛋白孵育24 h,再建立心肌细胞缺氧/复氧模型;降钙素基因相关肽组在缺氧/复氧前30 min加入10-8 mol/L降钙素基因相关肽,CGRP8-37组在给予降钙素基因相关肽前30 min加入10-7 mol/L的降钙素基因相关肽1受体的竞争性拮抗剂CGRP8-37。采用流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率并测定caspase-3活性。结果与结论:降钙素基因相关肽能明显抑制氧化低密度脂蛋白和缺氧/复氧处理的乳鼠心肌细胞caspase-3的激活,从而阻止凋亡的发生,并且该作用能被降钙素基因相关肽1受体的竞争性拮抗剂CGRP8-37部分逆转,说明降钙素基因相关肽通过与降钙素基因相关肽1受体结合产生抗凋亡效应,进而抑制心肌细胞凋亡,对氧化低密度脂蛋白孵育乳鼠心肌细胞的缺氧/复氧损伤具有保护作用。     

胰岛素对新生大鼠缺氧/复氧心肌细胞凋亡的影响

目的:探讨胰岛素在新生大鼠缺氧/复氧心肌细胞损伤中对细胞凋亡的影响。方法:通过给原代培养乳鼠心室肌细胞行缺氧2 h/复氧4 h,建立缺氧/复氧(Anoxia/Reoxygenation)心肌细胞损伤模型。将培养心肌细胞随机分为:正常对照组(CON)、缺氧/复氧组(A/R)、缺氧/复氧+胰岛素组(I/R+INS)。于复氧4 h后,利用2,4二硝基苯肼显色法检测乳酸脱氢酶(LDH)活性,硫代巴比妥酸显色法检测丙二醛(MDA)含量,原位末端标记法(TINEL)和DNA梯带法(DNA Ladder)检测细胞凋亡,并比较各组间差异。结果:与A/R组相比,A/R+INS可明显降低MDA、LDH值(P<0.01),抑制心肌细胞凋亡(P<0.01)。结论:胰岛素具有减少新生大鼠缺氧/复氧心肌细胞损伤作用,其作用机制与抑制细胞凋亡作用有关。     

OPH对缺血-再灌注损伤心肌能量代谢的影响

目的 :ＯＰＨ是本研究所合成的创新化合物 ,对心血管系统有明显活性。以往的研究显示它对冠脉阻断 -再灌或全心停灌 -复灌所致心肌损伤有明显保护作用 ,为探讨其作用的生化机制 ,研究ＯＰＨ对再灌注心肌能量代谢的影响。方法 :大鼠Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ氏心脏 ,Ｋ -Ｈ液灌流 1 0 0ｍｉｎ作为正常对照组 ;平衡 30ｍｉｎ后 ,停灌 40ｍｉｎ -复灌 30ｍｉｎ作为再灌注损伤组 ;给药组于停灌前 5ｍｉｎ至停灌前及复灌期灌注含ＯＰＨ的Ｋ -Ｈ液。取复灌 30ｍｉｎ时的心脏 ,液氮保存 ,用酶学法测心室肌ＡＴＰ ,ＰＣｒ与Ｐｉ含量。结果 :停灌 -复灌…     

有机锗（Ge—132）对损伤大鼠肝枯否细胞免疫活性及酶活性的影响

材料与方法一、取日龄1～5天的Wistar 系大鼠乳鼠肝枯否细胞原代单层培养4～8天,选生长良好的细胞瓶分为正常组、损伤组(加入5mol/L 含CC(?)4的20%FCS RPMl1640培养液3ml)、实验组(同上加CC(?)4再加Ge-132 0.1mg/ml)和阳性对照组(CC(?)4加     

一氧化氮在不同类型缺氧致死小鼠心、脑损害中的作用

目的 :探讨一氧化氮 (ＮＯ)在乏氧性缺氧、ＣＯ中毒、亚硝酸钠中毒性缺氧致死小鼠心、脑损害中的作用。方法 :健康小白鼠 48只 ,随机分为 4组 ,每组 1 2只 ,①正常对照组 ;②乏氧性缺氧组 :将小鼠放入含有 5ｇ钠石灰 2 50ｍＬ密闭缺氧瓶中致死 ;③ＣＯ中毒 :将小鼠放入充满ＣＯ气体的缺氧瓶中致死 ;④亚硝酸钠中毒性缺氧 :5%亚硝酸钠腹腔注射致死。分别在缺氧致死后快速取心、脑组织制成 1 0 % (ｇ/ｍＬ)匀浆 ,采用Ｇｒｉｅｓｓ法测定血清ＮＯ代谢终产物亚硝酸盐 (ＮＯ-2 )的变化 ,间接反映ＮＯ的含量。常规心、脑组织病理切片、染色 ,进行…     

硫化氢拮抗乳鼠心肌缺氧/复氧损伤机制初探

目的： 观察乳鼠心肌细胞内源性CSE/H2S通路的改变以及给予H2S供体对缺氧/复氧心肌细胞的影响,探讨该通路与心肌缺氧/复氧损伤的关系及作用机制。方法：出生48 h以内乳鼠心肌细胞原代培养,缺氧(2%O2、5%CO2)3 h/复氧(21%O2、5%CO2)2 h造成缺氧/复氧损伤,采用比色法检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、心肌细胞丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）; 采用RT-PCR 方法测定心肌细胞CSE mRNA表达。结果：与缺氧/复氧组相比,NaHS+IR组及IR+NaHS组心肌细胞存活率明显提高,培养液中LDH漏出量降低,心肌细胞中SOD产生增加,MDA生成减少,加入CSE的抑制剂PPG后各项观察指标无明显变化,同时RT-PCR结果显示IR损伤可以下调心肌细胞中CSE mRNA的表达。结论：缺氧前后加入NaHS可以明显减轻乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤,此作用可能是通过降低自由基和保护细胞膜完整性完成的。     

缺氧复氧致心肌AC16细胞损伤途径的研究

目的:探讨缺氧复氧条件下不同复氧时间致心肌细胞损伤的途径。方法:培养人心肌AC16细胞,先置入1%O_2、无糖无血清条件下培养24 h,再更换含10%胎牛血清的低糖DMEM联合21%O_2进行不同时间的复氧培养,采用CCK-8法检测细胞活力,并通过Western blot法检测不同细胞损伤途径标记分子的蛋白水平,如细胞自噬相关蛋白LC3-II/-I、细胞焦亡相关蛋白caspase-1和gasdermin D及凋亡相关蛋白caspase-3、Bax和Bcl2。结果:与空白对照组相比,各缺氧复氧组细胞活力降低,且随复氧时间延长,细胞活力相应持续降低(P0.05),同时缺氧组LC3-II/-I上调(P0.05),而复氧后LC3-II/-I较缺氧组下降,但仍高于对照组;此外,cleaved caspase-1和cleaved gasdermin D蛋白在复氧6 h组和复氧12 h组表达水平上调(P0.05); cleaved caspase-3水平和Bax/Bcl2在复氧12 h组上调(P0.05)。结论:缺氧致心肌AC16细胞的自噬上调,并随复氧时间增加自噬水平减弱,且在复氧过程中细胞焦亡的激活早于细胞凋亡。     

增龄对心肌细胞流变力学特性的影响

目的 :在已建立的心肌细胞力学模型基础上 ,进一步了解增龄对心肌细胞流变力学特性的影响。方法 :采用微管吸吮技术观察培养的乳鼠、成年鼠心肌细胞的粘弹力学特性。结果 :成年鼠心肌细胞的三个粘弹性系数K1 、K2 和 μ均大于对应的乳鼠心肌细胞的值 ( 6 2 6 .5± 2 2 5.3vs 4 0 7.9± 137.9,32 1.4± 191.0vs 2 2 9.3± 139.6 ,81.3±6 3.1vs 50 .0± 14 .5) ,且二组间差异显著 (P <0 .0 5～ 0 .0 1)。结论 :成年鼠心肌细胞较乳鼠心肌细胞更不易发生变形 ,随着年龄的增长 ,心肌细胞刚性增强 ,细胞变形能力下降     

新生鼠体外神经干细胞缺氧模型的建立

目的体外建立新生鼠神经干细胞缺氧模型。方法提取新生24h SD大鼠海马组织进行细胞培养,选取第三代神经干细胞作为缺氧细胞,缺氧前将培养基更换为与基础培养基成分相似的DMEM无糖培养基,通入5%CO2+95%N2混合气体使细胞缺氧,缺氧30min、1h、2h后复氧复培养基继续培养,缺氧前后均进行细胞形态学观察、台盼蓝计数以及cck-8法检测。结果缺氧1h细胞出现形态学改变,不规则、破裂及絮状沉淀;随着缺氧时间的延长细胞死亡数增多(P0.05),细胞活性降低(P0.05)。结论在无糖培养基及5%CO2+95%N2混合气体中培养1h可以成功建立神经干细胞缺氧模型。     

左旋卡尼汀对缺氧/复氧诱导的心肌细胞氧化、凋亡影响的体外研究

目的：探讨左旋卡尼汀（L-carnitine）对缺氧/复氧（A/R）诱导的乳鼠心肌细胞抗氧化、抗凋亡效应及其可能的作用机制。方法： 采用原代培养乳鼠心肌细胞作为模拟缺血再灌注损伤实验模型，实验分3组：①正常对照组（control）；②A/R组:缺氧120 min,复氧240 min;③L-carnitine组：A/R前2 h加用L-carnitine设4个浓度梯度，1组20 mg/L，2组50 mg/L，3组100 mg/L，4组200 mg/L。观察各组细胞经A/R损伤后，细胞内超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量、琥珀酸脱氢酶（SDH）活性的变化情况，并用流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡率，透射电镜观察细胞超微结构的改变。结果： A/R组SOD活性、SDH活性明显低于对照组，MDA含量、细胞凋亡率均高于对照组(P＜0.05）；在L-carnitine用药组，随给药浓度的增加，MDA含量逐渐恢复正常，SOD活性、SDH活性逐渐回升，而且细胞凋亡率下降，各药物治疗组与A/R组比较各实验指标均显著差异(P＜0.05)；A/R组心肌细胞超微结构损伤明显重于药物治疗组。结论:左旋卡尼汀对心肌细胞具有保护作用，其作用在一定范围内呈剂量依赖关系。