褐藻多糖硫酸酯减轻1-甲基-4-苯基吡啶离子引起的细胞损伤和氧化应激

目的以1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+)为工具药处理MN9D细胞,建立帕金森病(Pakinson’s disease,PD)的细胞模型,观察褐藻多糖硫酸酯对细胞的保护作用,并初步探讨其作用机制。方法用不同浓度(25、50、100、200μmol/L)的MPP+处理MN9D细胞36h,50μmol/L MPP+处理MN9D细胞,时间分别为12、2436、48h,建立细胞损伤模型。用0.01、0.1、1g/L褐藻多糖硫酸酯预孵育MN9D细胞1h后,加入50μmol/L MPP+共同作用36h以探讨褐藻多糖硫酸酯的保护作用。MTT法检测细胞活力、生化法测定乳酸脱氢酶(LDH)释放量,并采用二氯荧光素乙二酯(DCF-DA)染色法检测细胞内的氧化应激水平。结果随着MPP+浓度增加或作用时间延长,MN9D细胞MTT值逐渐降低。50μmol/L MPP+处理细胞36h,MTT值明显下降,LDH释放量增加。而0.1、1g/L的褐藻多糖硫酸酯预孵育1h,可明显减轻MN9D细胞的损伤,提高MTT值并降低LDH释放量,细胞形态学改变与生化实验结果一致。50μmol/L MPP+作用12h,可使MN9D细胞的氧化应激水平明显升高,而0.1、1g/L的褐藻多糖硫酸酯预处理1h,可以拮抗MPP+引起的细胞内氧化应激水平增高。结论褐藻多糖硫酸酯可以有效拮抗MPP+对MN9D细胞的损伤作用,其机制可能与褐藻多糖硫酸酯具有抗氧化活性有关。     

迷迭香酸对MPP~+导致MES 23.5细胞损伤保护作用

目的观察迷迭香酸对1-甲基-4-苯基吡啶阳离子(MPP+)所致MES 23.5细胞损伤的保护作用。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)检测方法,观察不同浓度的迷迭香酸对MPP+处理的MES 23.5细胞的保护作用。结果 10-9~10-6mol/L的迷迭香酸对MES 23.5细胞无毒性作用(F=0.581,P>0.05)。200μmol/L的MPP+可使细胞存活率降低(F=44.863,P<0.01),而应用10-9~10-6mol/L的迷迭香酸预孵育细胞后,能明显提高细胞的存活率(P<0.01)。结论迷迭香酸能拮抗MPP+对MES 23.5细胞的毒性作用,具有一定的神经保护作用。     

6-羟基-1-氢-吲唑保护 MPP +诱导凋亡的 SH-SY5Y 细胞的机制

目的：研究6-羟基-1-氢-吲唑对1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP +)诱导凋亡的 SH-SY5Y 细胞的保护作用机制。方法体外培养人神经母细胞瘤细胞 SH-SY5Y,以200μmol/ L MPP +诱导 SH-SY5Y 细胞凋亡建立体外帕金森病细胞模型。 Western blot 法分别检测200μmol/ L MPP +和200μmol/ L MPP +联合0.1μmol/ L 6-羟基-1-氢-吲唑作用后 SH-SY5Y 细胞内糖原合酶激酶3β(GSK-3β)、周期依赖性蛋白激酶5(CDK5)以及凋亡蛋白酶3(caspase-3)的活性。结果200μmol/ L MPP +作用 SH-SY5Y 细胞8 h, GSK-3β、CDK5与 caspase-3活性升高。200μmol/ L MPP +联合0.1μmol/ L 6-羟基-1-氢-吲唑作用 SH-SY5Y 细胞8 h,GSK-3β、CDK5与 caspase-3的活性降低。结论6-羟基-1-氢-吲唑对MPP +诱导凋亡的 SH-SY5Y 细胞的保护机制可能是抑制GSK-3β、CDK5和 caspase-3的活性。     

MPTP对小鼠多巴胺能神经元细胞MN9D凋亡的影响

目的:探讨MPTP对小鼠多巴胺能神经元细胞MN9D凋亡的影响及其可能机制。方法:MN9D细胞分别以0、1μmol/L MPTP处理(对照组和MPTP组),或分别以pcDNA4、pcDNA4-BACE2转染(对照组和BACE2组),采用Western blot法检测BACE2、Cleaved Caspase-3和内源性DSG2蛋白的表达。MN9D细胞分为DSG2组、DSG2+BACE2组和DSG2+BACE2+BACE抑制剂组,分别转染pENTER-DSG2+pcDNA4、pENTER-DSG2+pcDNA4-BACE2以及转染pENTER-DSG2+pcDNA4-BACE2后用1μmol/L的BACE抑制剂处理,采用Western blot法检测DSG2全长以及DSG2各片段的表达。结果:与对照组相比,MPTP组中BACE2及Cleaved Caspase-3表达均上升(P<0.05);与对照组相比,BACE2组Cleaved Caspase-3表达增加,内源性DSG2表达减少(P<0.05)。与DSG2组相比,DSG2+BACE2组中全长DSG2表达下降,DSG2羧基末端...     

MPP+诱导SK-N-SH细胞热休克蛋白的表达研究

目的研究SK-N-SH细胞在受到1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP )损伤时,细胞内热休克蛋白(HSPs)的表达。方法SK-N-SH细胞中加入不同浓度的MPP 制备帕金森病(PD)细胞模型,分别于培养24 h和48 h时,检测细胞存活率,选择合适的MPP 实验浓度。免疫印迹法(W estern b lot)和免疫细胞化学法观察细胞内Hsp70、Hsp40(HD J-1和HD J-2)和Hsp90的变化。结果细胞存活率检测表明MPP 合适的实验浓度为10~500μmol/L。W estern b lot和免疫细胞化学法检测均显示250μmol/L MPP 处理24 h,细胞内Hsp70含量明显升高(P<0.05);MPP 处理48 h,Hsp70含量随MPP 浓度的升高而下降;Hsp40/HD J-1和Hsp90的变化趋势基本与Hsp70相同;而HD J-2在细胞内的含量无明显改变(P>0.05)。结论HSPs的含量在MPP 制备的PD细胞模型中,随MPP 作用时间的延长而呈现先增加后降低的趋势。     

MPP+诱导SK-N-SH细胞热休克蛋白的表达研究

目的 研究SK-N-SH细胞在受到1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)损伤时,细胞内热休克蛋白(HSPs)的表达.方法 SK-N-SH细胞中加入不同浓度的MPP+制备帕金森病(PD)细胞模型,分别于培养24 h和48 h时,检测细胞存活率,选择合适的MPP+实验浓度.免疫印迹法(Western blot)和免疫细胞化学法观察细胞内Hsp70、Hsp40(HDJ-1和HDJ-2)和Hsp90的变化.结果 细胞存活率检测表明MPP+合适的实验浓度为10 ～ 500 μmol/L.Western blot和免疫细胞化学法检测均显示250 μmol/L MPP+处理24 h,细胞内Hsp70含量明显升高(P<0.05);MPP+处理48 h,Hsp70含量随MPP+浓度的升高而下降;Hsp40/HDJ-1和Hsp90的变化趋势基本与Hsp70相同;而HDJ-2在细胞内的含量无明显改变(P>0.05).结论 HSPs的含量在MPP+制备的PD细胞模型中,随MPP+作用时间的延长而呈现先增加后降低的趋势.     

人脂肪间充质干细胞通过抑制小胶质细胞迁移活性对MPP+诱导帕金森细胞模型的保护作用

目的 本研究旨在探讨经人脂肪间充质干细胞(h ADMSCs)诱导后的小胶质细胞(microglia)对多巴胺能神经元的作用。方法 利用200u MMPP+处理MN9D细胞建立PD细胞损伤模型,利用h ADMSCs条件培养基培养BV2小胶质细胞,建立MPP+致毒的MN9D细胞与BV2小胶质细胞共培养系统,于Transwell共培养系统检测h ADMSCs条件培养基作用下对BV2细胞迁移能力的影响。TUNEL法检测MN9D细胞凋亡,Westernblot检测MN9D细胞DAT及TH的表达水平的影响。结果 Transwell结果发现,与MPP+处理组相比,h ADMSCs条件培养基处理组(MPP+/CM)中的BV2细胞迁移率明显减少(96.3±10.129 vs 40.33±13.193)。TUNEL结果发现,经h ADMSCs条件培养基培养的BV2小胶质细胞可抑制MN9D细胞凋亡,增加MN9D细胞DAT及TH的蛋白表达水平。结论 经h ADMSCs条件培养基诱导后的小胶质细胞对DA能神经元起保护作用。     

促红细胞生成素对MPP+所致的PC12细胞线粒体氧化损伤的保护作用

目的 探讨促红细胞生成素(EPO)对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导PC12细胞变性损伤的保护作用及其机制.方法 以MPP+损伤PC12 细胞作为帕金森病(PD)细胞模型,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,罗丹明123(Rh123)染色检测细胞线粒体膜电位(ΔΨm),双氯荧光黄乙酸乙酯(DCF-DA)染色检测细胞内活性氧(ROS)的含量,免疫印迹法检测pAkt蛋白表达.结果 ①500 μmol/L的MPP+可以导致PC12细胞的存活率下降,凋亡率增加,0.1~10 U/mL的EPO可以使PC12细胞的存活率增加,凋亡率降低,并在1 U/mL时达到最大保护效应;②MPP+导致ROS含量增加、ΔΨm降低;EPO可以抑制MPP+所致ROS和ΔΨm水平的变化;③EPO增加了Akt磷酸化水平,PI3K抑制剂LY294002拮抗了EPO的保护作用和对ROS产生的抑制作用.结论 EPO对MPP+损伤PC12细胞具有保护作用,其机制是通过PI3K/Akt通路实现的.     

6-OHDA诱导过表达nurr1基因的SK-N-SH细胞凋亡

目的比较自身不表达核相关受体因子(nuclear receptor related factor1,Nurr1)基因的人神经母细胞瘤细胞株SK-N-SH和过表达外源性nurr1基因的SK-N-SH/Nurr1细胞对6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)的损伤反应,探讨nurr1基因在6-OHDA致细胞损害(死亡或凋亡)中的作用。方法用免疫细胞化学方法和RT-PCR检测基因转染细胞SK-N-SH/NURR1的nurr1蛋白及NURR1 mRNA的表达。细胞经不同浓度6-OHDA(50～100μmol/L)作用不同时间(6、12 h),经AnnexinV/PI双染后流式细胞术(flow cytometry,FCM)测定早期细胞凋亡比例。细胞经75μmol/L 6-OHDA作用12 h,通过透射电镜(transmission electronmicroscopy,TEM)观察细胞超微结构变化。用Western blotting方法检测75μmol/L6-OHDA作用6、12 h,细胞凋亡因子Caspase-3活性前体蛋白的表达水平。结果免疫细胞化学染色结果显示,基因转染细胞SK-N-SH/Nurr1表达NURR1蛋白;经RT-PCR检测,基因转染细胞表达NURR1 mRNA,说明外源性nurr1基因在转染细胞内过表达。FCM检测结果显示,75μmol/L 6-OHDA作用12 h,SK-N-SH/Nurr1细胞凋亡比例明显高于SK-N-SH细胞(P=0.000),而100μmol/L6-OHDA作用6、12 h后,2株细胞均表现为毒性损伤。TEM显示,75μmol/L6-OHDA作用12 h后,部分SK-N-SH/Nurr1细胞出现了典型凋亡改变,而SK-N-SH细胞主要表现为毒性损伤。4.75μmol/L6-OHDA作用6、12 h,SK-N-SH/Nurr1细胞Caspase-3活性前体蛋白表达显著下降(P=0.000),而SK-N-SH细胞Caspase-3活性前体蛋白表达变化不明显。结论外源性nurr1基因过表达促进6-OHDA诱导的SK-N-SH/Nurr1细胞凋亡,在低剂量(≤75μmol/L)时,凋亡比例与剂量呈正相关,高剂量时6-OHDA主要诱导细胞毒性损伤。     

人参皂苷Rg1对1-甲基-4-苯基吡啶离子诱导的PC12细胞凋亡的保护作用

目的探讨人参皂苷Rg1对1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinum,MPP+)诱导的PC12细胞凋亡是否具有保护作用。方法采用MPP+诱导的具有多巴胺能神经元特性的PC12细胞凋亡作为帕金森病(Parkinson disease,PD)的体外模型。实验分正常对照组、MPP+损伤组、人参皂苷Rg1(10、20、50μmol/L)3个浓度预处理组。用MTT法测定细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡,TUNEL法检测细胞凋亡断裂的DNA片段,蛋白质印迹法分析细胞色素C(cytochrome C,Cyt C)蛋白含量。结果 10、20、50μmol/L人参皂苷Rg1对MPP+诱导的PC12细胞具有一定的保护作用。与MPP+损伤组[(52±4.7)%]相比,10、20、50μmol/L人参皂苷Rg1预处理细胞活力分别上升为(64±3.4)%、(72±5.2)%、(83±6.2)%(P<0.05或P<0.01)。经流式细胞术检测,正常组、MPP+损伤组、人参皂苷Rg1预处理组(10、20、50μmol/L)细胞凋亡率分别为1.8%、44.5%、32.9%、21.1%和14.2%。人参皂苷Rg1预处理后,细胞断裂的DNA片段明显减少。另外,蛋白质印迹分析也显示人参皂苷Rg1可抑制MPP+诱导的Cyt C的过表达。结论人参皂苷Rg1对MPP+诱导的细胞凋亡具有浓度依赖性的保护作用,其保护机制可能与下调线粒体内Cyt C的过表达有关。     

Alu-LTR PCR方法检测HAART治疗系列各细胞亚群的整合型HIV-1 DNA

目的应用Alu-LTR PCR方法对高效抗反转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy,HAART)系列的CD4+T,CD8+T及B细胞进行检测,明确不同细胞亚群及HAART治疗的不同阶段是否存在整合的HIV-1 DNA。方法收集20例HIV-1感染患者HAART治疗过程中0、4、12周及10例健康对照的抗凝血标本,纯化CD4+T,CD8+T及B细胞并提取DNA,应用Alu-LTR PCR方法进行检测。结果 20例HIV-1感染者HAART治疗系列中CD4+T细胞及CD8+T细胞成功扩出目的片段,CD8+T细胞所扩条带亮度均低于CD4+T细胞,HAART治疗系列0、4、12周标本所扩条带亮度没有明显差异。B细胞及10例健康者均为阴性。结论 CD4+T及CD8+T细胞存在整合型HIV-1 DNA,HIV储藏库主要存在于CD4+T细胞内。B细胞内不存在整合型HIV-1 DNA。随着HAART治疗的进程,整合型HIV-1 DNA仍然存在,进一步证明HAART不能根除HIV储藏库。     

调节性CD4~+T细胞及非调节性CD4~+T细胞与HIV/AIDS患者疾病进展关系的研究

目的分析比较中国HIV感染者CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(CD4+regulatory T cells,Treg)及非Treg细胞与疾病进展的关系,探讨Treg细胞在HIV感染过程中的作用。方法选取76例HIV/AIDS患者,根据其CD4+T细胞计数水平不同分为3组,A组CD4<200个/μL,B组CD4200～400个/μL,C组CD4>400个/μL。采用流式细胞仪胞内染色技术检测CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的水平,并分析其与CD4计数及病毒载量的相关性。结果随着疾病的进展,Treg细胞百分比逐渐升高,各组间差异有统计学意义;Treg细胞及非Treg细胞的绝对计数均明显下降,且以非Treg细胞下降为主;Treg绝对计数与病毒载量呈负相关(P<0.05)。结论中国HIV感染者随着疾病进展,辅助性T细胞等非Treg细胞的数量下降,对机体免疫保护能力降低,而Treg细胞数量及功能的下降使其对机体的过度免疫活化的抑制作用减弱,病毒复制,加剧病情进展。     

HIV感染者调节性T细胞消耗可导致HIV特异CD8~+细胞凋亡

目的了解在HIV感染患者CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞(Treg)的降低是否能够引起HIV特异CD8+细胞过度凋亡。方法本研究对75例没有治疗的HIV患者进行研究,检测其外周血中Treg细胞计数及CD8+细胞的活化及凋亡情况并分析其相关性;同时纯化Treg细胞及CD8+细胞,在体外进行共培养,用五聚体检测HIV特异CD8+细胞的活化情况。结果在HIV感染患者,Treg细胞与CD8+细胞的活化及凋亡呈负相关,Treg细胞能够抑制HIV特异的CD8+细胞的凋亡。结论 HIV感染患者Treg细胞的降低可导致CD8+细胞、尤其HIV特异CD8+细胞的凋亡增加。     

阿尔茨海默病大鼠模型PET在体成像研究

目的研究18F-FDG及Aβ蛋白显像剂(4’-schiff-O[11CH3])PET成像技术在判别阿尔茨海默病大鼠模型中的作用。方法对10只注射Aβ1～40复制阿尔茨海默模型大鼠及10只注射生理盐水对照大鼠行HE染色及刚果红染色,检测大鼠脑内病理学改变。用18F-FDG及4’-schiff-O[11CH3]PET显像技术在体观察2组大鼠脑内Aβ蛋白分布及葡萄糖代谢情况。结果模型组大鼠海马出现神经元减少并形成淀粉样斑块。模型组PET显像可见注射侧海马葡萄糖代谢减低及4’-schiff-O[11CH3]摄取增加。对照组仅见轻微神经元损伤,PET显示葡萄糖代谢轻度减低。结论18F-FDG及4’-schiff-O[11CH3]PET显像结合行为学及病理学观察可作为检测模型成功与否的方法之一。     

Na~+-K~+-2Cl~-共转运体不同亚型在大鼠胃黏膜的差异性分布及表达

目的研究Na+-K+-2Cl-共转运体(Na+-K+-2Cl-co-transporter,NKCC)的两种亚型在胃不同部位黏膜层的差异性分布及表达的意义。方法用免疫荧光组织化学法和实时定量PCR技术检测NKCC不同亚型NKCC1与NKCC2在正常大鼠胃不同部位(胃底、胃体和胃窦)黏膜组织的分布和表达。结果①免疫荧光组织化学显示:NKCC1多分布于胃底、胃窦黏膜底部及胃体黏膜中下部,细胞膜表达最多;而NKCC2则多分布于胃体、胃窦黏膜全层及胃底黏膜上1/3部,细胞质、细胞膜均有表达。②实时定量PCR显示:NKCC1的mRNA在正常大鼠胃体表达最高,NKCC2的mRNA则在胃窦表达最高。结论正常大鼠NKCC1与NKCC2在不同部位胃黏膜上皮细胞的分布及表达含量不同,NKCC1多分布在黏膜底部或中下部,NKCC2多分布于黏膜顶部或全层。     

大鼠非心肌细胞对心肌细胞凋亡的影响

目的探讨大鼠心脏非心肌细胞对心肌细胞凋亡的影响。方法分别培养SD乳鼠心肌细胞(MC)和非心肌细胞(NMC)。制备非心肌细胞条件培养液(NMCM)。培养细胞的分组及药物干预:M组:MC+新鲜培养液;C组:MC+70%新鲜培养液+30%NMCM;L组:MC+新鲜培养液+Losartan;CL组:MC+70%新鲜培养液+30%NMCM+Losartan;P组:MC+新鲜培养液+PD123319;CP组:MC+70%新鲜培养液+30%NMCM+PD123319;LP组:MC+新鲜培养液+Losartan+PD123319;CLP组:MC+70%新鲜培养液+30%NMCM+Losartan+PD123319。用图像分析仪测定各组心肌细胞的面积,用流式细胞仪检测各组心肌细胞凋亡情况。结果用药物干预后,L组、P组及LP组与M组比较,心肌细胞面积无明显变化(P>0.05);C组及CP组细胞面积较M组、L组、P组、LP组明显增大(P<0.01)。C组及CP组细胞凋亡率明显高于其他组(P<0.001),CP组细胞凋亡较C组更为明显(P<0.05)。结论非心肌细胞培养液在促进心肌细胞肥大的同时,也促进了细胞的凋亡。Losartan可抵消非心肌细胞条件培养液促进心肌细胞凋亡的作用,提示AT1受体介导促进心肌细胞凋亡。     

乳腺癌组织中NHERF1、PTEN和ERα蛋白的表达及其临床意义

目的在乳腺癌及癌旁组织中研究钠氢交换子调节因子1(Na+/H+exchanger regulatory factor 1,NHERF1)、PTEN和雌激素受体亚型ERα的免疫组织化学表达情况及其与乳腺癌临床病理分型的关系。方法采用免疫组织化学(SP)法评价乳腺癌组织及癌旁组织中NHERF、PTEN和雌激素受体亚型ERα蛋白表达情况,对其进行比较研究。结果乳腺癌组织中NHERF1和PTEN均呈现弱阳性表达或者不表达,而在癌旁组织中两者均有表达,而且在癌旁组织与癌组织中的表达量的差异有统计学意义(P<0.01)。而ERα的表达量在乳腺癌组织中明显高于癌旁组织(P<0.01)。结论乳腺癌组织中PTEN蛋白的表达水平可能与乳腺癌组织中NHERF1的表达有很大的相关性,雌激素受体在乳腺癌的发生发展过程中起了很重要的作用。     

11,12-EET对大鼠心脏缺血/再灌注损伤保护作用研究

目的观察不同质量浓度11,12-EET对心肌缺血/再灌注损伤的影响及给药后不同时间11,12-EET保护作用的变化,以期了解11,12-EET对心肌保护作用的特点。方法复制大鼠心脏缺血/再灌注模型,给予不同浓度的11,12-EET,观察不同时间点的心功能变化。结果给予6.24×10-7.5mol/L、6.24×10-8mol/L 11,12-EET均可改善心肌缺血/再灌注损伤的大鼠心功能,6.24×10-9mol/L 11,12-EET作用较弱;给药24 h后11,12-EET拮抗大鼠心肌缺血/再灌注损伤的作用也减弱。结论11,12-EET的浓度及给予11,12-EET的时间对心脏保护作用有一定的影响。     

小剂量多巴酚丁胺门控心肌显像预测左心室功能受损的冠心病患者CABG术后早期疗效

目的用小剂量多巴酚丁胺结合99mTc-甲氧基异丁基异腈(MIBI)门控心肌显像(SPECT)检测结果预测存活心肌在接受冠状动脉旁路移植术(CABG)的左心室功能受损的冠心病患者的疗效。方法对38例接受CABG的患者手术前行静息与小剂量多巴酚丁胺结合99mTc-MIBISPECT显像,术后3个月行静息SPECT随访。根据术后左心室射血分数(LVEF)与基线的变化,患者被分为2组:A组19人,术后LVEF值提高≥5%;B组19人,术后LVEF值提高<5%。结果A组术后LVEF值较基线提高(P<0.001),左心室舒张末期容积(EDV)、左心室收缩末期容积(ESV)明显缩小(P<0.05);B组术后LVEF、EDV、ESV值均无明显改善(P>0.05)。临床随访过程中B组有3位患者因心力衰竭再次住院治疗。以术后LVEF较基线提高≥5%作为标准,用ROC曲线得出多巴酚丁胺负荷试验过程中LVEF提高≥4.5%为预测值。多巴酚丁胺负荷试验过程中LVEF提高≥4.5%在A组中有10人,在B组中有3人。以多巴酚丁胺负荷试验过程中LVEF提高≥4.5%作为术后LVEF提高的标准,敏感度为76.9%,特异性为64%,准确性为68.4%。多巴酚丁胺负荷试验过程中LVEF与术后LVEF有明显相关性(r=0.83,P=0.000);多巴酚丁胺负荷试验过程中EDV、ESV与术后EDV、ESV有明显相关性(r=0.79,P=0.000,r=0.88,P=0.000)。结论小剂量多巴酚丁胺结合99mTc-MIBISPECT显像中LVEF提高≥4.5%可作为术后LVEF提高的预测指标。