彩虹明樱蛤多糖对转染HBV的HepG2细胞表达功能的影响

目的研究彩虹明樱蛤多糖(MIP)对转染HBV的HepG2细胞表达功能的影响。方法以不同浓度(10-2~104μg/ml)MIP作用于体外培养的HepG2.2.15细胞,采用MTT法、时间分辨免疫分析法(TRFIA)和ELISA法检测MIP对HepG2.2.15细胞的毒性作用及HBsAg、HBeAg、Pre-S1Ag表达的影响,采用FQ PCR检测MIP对HBV DNA复制的抑制作用。结果 MIP在10-2~102μg/ml浓度范围内对HepG2.2.15细胞无毒性作用,TC50为4633μg/ml。MIP在10-2~102μg/ml浓度范围内,对HBsAg、HBeAg、Pre-S1Ag以及HBV DNA均有一定抑制作用,相应的治疗指数分别为129、28、20和83。结论 MIP具有一定的抗HBV活性。     

乙型肝炎病毒基因组转染HepG2细胞的microRNA表达研究

目的 检测乙型肝炎病毒(HBV)全基因组转染对人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞中microRNA(miRNA)表达的影响,为进一步探讨肝细胞中HBV复制的分子生物学机制提供平台.方法 分别提取HepG2.2.15细胞(转染HBV全基因组的HepG2细胞,实验组)和其亲本HepG2细胞(对照组)的总RNA并分离miRNA,采用含509条探针的哺乳动物miRNA表达谱芯片对两组之间差异表达的miRNA进行分析.用SAM软件针对差异miRNA筛选的标准为在两组之间荧光强度差异4倍以上,差异miRNA的整体假阳性率为0.选择其中2个miRNA,应用实时荧光定量RT-PCR方法对芯片结果进行验证.结果 HepG2.2.15细胞与HepG2细胞间差异表达的miRNA共27个(占5.3%),其中7个表达上调,20个表达下调.miR-181d和miR-15a的实时荧光定量RT-PCR验证结果与芯片表达结果基本一致.结论 肝细胞中存在着与HBV复制相关的miRNA,这些上调和下调表达的miRNAs可能参与了HBV在肝细胞中的复制.     

miR-181a在转染乙型肝炎病毒基因组的nepG2.2.15细胞中的表达研究

目的 鉴定分析microRNA(miRNA)miR-181a在转染了乙型肝炎病毒(HBV)基因组的HepG2.2.15细胞中的表达情况,探讨miR-181a在与HBV相关的肝脏疾病中的作用.方法 以本课题组基因芯片结果为基础,设计并合成miR-181a探针,采用Northern blotting检测miR-181a在HepG2.2.15和HepG2细胞(对照组)中的表达水平,应用生物信息学方法结合mRNA表达谱芯片结果预测miR-181a的靶基因,选取靶基因HLA-A2,应用流式细胞仪分析HLA-A2分子在上述2种细胞中的表达.结果 Northernblotting结果显示,与对照组相比,miR-181a在HepG2.2.15细胞中的表达量显著增高;miR-181a可能的靶基因包括C8A、IDH1和HLA-A等,miR-181a可能通过其种子序列与其靶基因HLA-A的3'-UTR区部分互补结合来调节HLA-A的表达;流式分析也显示HLA-A2分子在HepG2.2.15细胞中的表达量(43.9%)显著低于HepG2细胞(96.6%).结论 miR-181a在HBV转染的HepG2.2.15细胞中高表达,并可能下调靶基因HLA-A的表达,推测这可能是HBV感染后病毒逃避免疫反应、持续复制的机制之一.     

靶向HBV C基因的siRNA在HepG2.2.15细胞中对HBV的抑制作用

目的研究靶向HBV C基因的短发夹状RNA(shRNA)表达质粒对HepG2.2.15细胞中HBV的抑制作用。方法设计构建两个靶向HBV C基因的shRNA表达质粒S1和S2,以及用于对照的非同源shRNA表达质粒S3。转染HepG2.2.15细胞后,通过RT-PCR和ELISA方法分别检测细胞中HBV C基因表达和细胞上清中HBV DNA、HBsAg和HBeAg表达。结果在转染后24 h时,HBV C基因mRNA表达量下降58%～83%,HBV DNA下降了2.44～3.36个log值,HBsAg和HBeAg的表达水平分别降低了51%～79%和50%～77%。S1、S2联合运用可以提高对HBV的抑制作用,而S3无抑制效果。结论靶向HBV C基因的shRNA表达质粒S1、S2及其联合运用,均能有效地抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制和表达。     

p53凋亡刺激蛋白2在HepG2215细胞中通过抑制自噬来发挥抗乙型肝炎病毒的作用

目的 研究p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis stimulating protein 2 of p53,ASPP2)对乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）和乙型肝炎E抗原（hepatitis Be antigen,HBeAg）表达的影响。方法 HepG2.215细胞用3-甲基腺嘌呤处理来抑制自噬,或用人ASPP2重组腺病毒感染来诱导ASPP2过表达,或转染GFP-LC3质粒后观察绿色LC3-Ⅱ颗粒（自噬标志物）的变化。酶联免疫吸附测定检测培养上清和胞内HBsAg和HBeAg的水平、免疫荧光检测LC3-Ⅱ颗粒的水平、免疫印记检测自噬相关蛋白的水平、免疫沉淀检测ASPP2与自噬相关蛋白的结合。结果 ASPP2过表达明显下调了绿色LC3-Ⅱ颗粒的水平和LC3-Ⅱ/Ⅰ比例、以及明显上调p62的水平,说明ASPP2过表达可抑制HepG2.215细胞的自噬。但是ASPP2并非通过抑制Atg5、Atg14和Beclin-1等自噬相关基因的表达来抑制自噬,而是通过与Atg14结合来抑制Atg14与Beclin-1的结合,阻断自噬体膜的形成,从而抑制自噬。抑制自噬和ASPP2过表达均导致培养上清和细胞内的HBsAg和HBeAg水平明显下调,表明在Hep2.215中,ASPP2通过抑制自噬来抑制HBsAg和HBeAg的产生。结论 ASPP2通过抑制自噬的作用具有抗乙型肝炎病毒感染的潜力。     

HBx基因的真核表达及其对肝癌细胞系HepG2细胞表型的影响

目的为了探讨乙型肝炎病毒(HBV)X基因与慢性乙型肝炎及肝癌发生的关系,构建HBV X基因(hep-atitis B virus X gene,HBx)真核表达载体及其肝癌(HCC)细胞系HepG2瞬转模型,并检测HBx对HepG2细胞表型的影响。方法以pCMV-HBx为模板,PCR法扩增HBx基因编码区全长序列,将其克隆至pcDNA3.1-Flag真核表达载体中,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-Flag-HBx,转染至HepG2细胞;Western印迹法检测细胞中HBx蛋白的表达水平;5-溴尿苷(5-溴脱氧尿嘧啶核苷,5-bromo-2’-deoxyuridine,BrdU)标记法检测转染HBx后细胞DNA合成变化;细胞周期检测试剂盒(CycleTESTTMPLUS DNA Reagent Kit)检测转染HBx后细胞周期的变化;AnnexinⅤ-APC/7-AAD法检测转染HBx后细胞凋亡情况。结果重组真核表达载体pcDNA3.1-Flag-HBx经双酶切和测序证明构建正确,转染该载体的HepG2细胞可检测到HBx蛋白的表达;与转染空质粒pcDNA3.1-Flag的细胞相比,细胞增殖能力增强,而细胞凋亡比率下降。结论成功构建了HBx基因真核表达载体,并研究了HBx对细胞表型的影响,为进一步探索HBx参与HBV引发HCC的分子机制奠定了基础。     

125 I-脱氧尿嘧啶核苷对肝癌细胞HepG2生长的抑制作用

目的评价125I-脱氧尿嘧啶核苷(UdR)对肝癌细胞HepG2生长的抑制作用及影响因素.方法 HepG2细胞在含有125I-UdR培养基中培养后测量其放射性,观察HepG2细胞对125I-UdR的摄取;用细胞克隆形成法评价125I-UdR对HepG2细胞生长的抑制作用.结果 HepG2摄取125I-UdR量随培养基中125I-UdR浓度增加而增加,两者显著相关(r=0.99).HepG2对125I-UdR的摄取明显高于Na125I.HepG2细胞摄取125I-UdR后其生长受到抑制,两者呈明显负相关(r=-0.943),半数致死剂量(LD50)为(0.87±0.29) kBq/mL.125I-UdR组细胞存活分数明显低于Na125I组.结论 125I-UdR对HepG2细胞生长有明显抑制作用,HepG2细胞摄取125I-UdR量有浓度依赖性.     

不同基因型HBx对乙型肝炎病毒复制的影响

目的探讨A、B、C和D四个基因型乙型肝炎病毒X蛋白（hepatitis Bvirus Xprotein,HBx）对乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus,HBV）复制的影响。方法构建含A、B、C和D四种基因型HBx的真核表达载体和提前终止HBx表达的突变型单倍体HBV表达系统,共转染至人肝肿瘤细胞系HepG2细胞,利用荧光素酶报告系统检测不同基因型HBx对HBV核心启动子的激活作用,利用酶联免疫法（ELISA）检测培养上清中HBV表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg）的表达情况,利用特异性引物PCR方法检测细胞中HBV前基因组RNA（pgRNA）和总RNA（pgRNA,2.2kb和0.8kbRNA）的转录情况。结果 A、B、C和D四种基因型HBx的表达均可显著激活HBV核心启动子活性,但不同基因型HBx的激活作用不同。除C基因型外,A、B和D三种基因型HBx均可显著增强HBsAg和HBeAg的胞外分泌水平。检测HBV复制中间产物发现,C基因型HBx对HBVpgRNA和总RNA转录水平的影响显著低于A、B和D基因型。结论不同基因型HBx对HBV复制的影响不同,为进一步研究HBV基因型与HBV复制能力以及临床病理表现的关系打下基础。     

反义STAT3寡核苷酸对B16细胞辐射敏感性的研究

目的 探讨反义STAT3转染鼠恶性黑色素瘤B16细胞后,肿瘤细胞辐射敏感性的变化。方法 利用反义寡核苷酸转染B16细胞后,以不同剂量γ射线照射。通过CCK-8试剂盒检测细胞增殖变化,Hoechst33258染色对细胞凋亡作形态学上的观察。用Annexin V/PI复染,流式细胞仪检测细胞早期凋亡率的变化。结果 反义STAT3转染后加以γ射线照射,B16细胞的增殖相比于两者单独作用组受到明显抑制,细胞凋亡水平也增加。结论 反义STAT3寡核苷酸联合γ射线对B16细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用明显增强,提高了鼠黑色素瘤B16细胞的辐射敏感性;表明阻断STAT3蛋白表达可能成为一种新的提高肿瘤辐射敏感性的有效手段。     

女性乙型肝炎病毒携带者卵巢颗粒细胞中乙型肝炎病毒感染情况与临床检测结果分析

目的分析女性乙型肝炎病毒(HBV)携带者卵巢颗粒细胞中HBV感染情况与临床检测结果。方法选取自2014年1月至2016年1月于自贡市第三人民医院接受辅助生育治疗的40例女性患者作为研究对象,其中,20例患者为HBV携带者(携带组),20例患者为非HBV携带者(非携带组),分离患者卵泡液中的颗粒细胞并制成涂片。应用经地高辛标记的特异性HBV DNA探针,通过原位杂交对颗粒细泡涂片进行检测;应用碱性磷酸酶系统进行显色反应。结果携带组患者的颗粒细胞涂片显示,5例可见200个成簇的颗粒细胞,细胞核中检测出20个HBV DNA阳性细胞;6例患者可见220个片状、单层的颗粒细胞,细胞核中检测出8个HBV DNA阳性细胞;9例患者可见180个成簇的颗粒细胞,细胞核中检测出4个HBV DNA阳性细胞。非携带组患者的颗粒细胞涂片为阴性。显色10 min时,患者未出现阳性信号;显色20 min时,4例患者出现阳性信号;显色30 min时,3例患者背景着色较深,阳性信号不易辨认,忽略不计。因此,20 min为显色的最佳时间。结论女性HBV携带者卵巢颗粒细胞中具有HBV DNA,可通过生殖细胞向子代传播乙型肝炎。因此,应加强对HBV携带孕产妇的健康宣传教育,并采取有效措施进行阻断。     

乙肝病毒前S1抗原与乙肝病毒血清标志物联合检测的临床意义

目的探讨乙肝病毒前S1抗原（PreS1-Ag）与乙肝病毒血清标志物（HBV-M）联合检测在临床应用中的意义。方法用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定328例乙型肝炎患者血清中PreS1-Ag和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）、乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）、乙型肝炎病毒e抗体（HBeAb）、乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）5项HBV血清标志物。结果 PreS1-Ag在HBsAg（＋）、HBeAg（＋）、HBcAb（＋）组和HBsAg（＋）、HBeAg（＋）组的阳性率显著升高,分别为87.3%和80.0%;在HBsAg（＋）、HBeAb（＋）、HBcAb（＋）组和HBsAg（＋）、HBcAb（＋）组及HBsAg（＋）组的PreS1-Ag阳性率分别为47.5%、63.9%和25.0%;PreS1-Ag在HBeAg（＋）组的阳性率为86.2%,明显高于在HBeAg（-）组的52.1%（χ2=21.33,P〈0.01）;328例乙型肝炎患者中,PreS1-Ag阳性率为61.9%,HBeAg阳性率为28.7%（χ2=73.098,P〈0.01）。结论 PreS1-Ag能较好地反映HBV的复制情况,且对HBV感染的早期诊断和判断治疗效果具有重要的临床意义。     

pSUPER-Racl-siRNA质粒的构建表达及对肝癌细胞HepG2体外增殖的抑制

目的 使用pSUPER作为产生siRNA的载体,构建针对Racl的siRNA表达载体,并观察其对肝癌HepG2细胞中Racl蛋白表达的抑制作用,同时研究Racl蛋白表达抑制后肝癌细胞HepG2的体外增殖情况.方法 合成用于产生针对Racl的发卡状RNA的寡核苷酸,含64个碱基,退火后插入线性化pSUPER载体的H1启动子下游.重组载体经限制性酶切和测序,构建载体pSUPER-Racl-siRNA,并将其转染肝癌细胞系HepG2.空载体pSUPER-Control-siRNA作为阴性对照.Western blotting检测转染质粒后细胞内Racl基因的变化,MTT法检测Racl蛋白表达后体外细胞增殖情况.结果 成功构建了可以表达针对Racl的siRNA表达载体pSUPER-Racl-siRNA.转染该载体能有效地下调HepG2细胞中Racl蛋白的表达,受抑制率为82%.MTT检测结果显示,抑制Racl蛋白表达后,细胞增殖速度明显减慢.结论 成功构建了针对Racl的发卡状RNA表达载体pSUPER-Racl-siRNA,其可以高效而特异地下调HepG2细胞内靶基因Racl的表达.Racl蛋白沉默对肝癌细胞增殖具有明显的抑制作用,说明其在细胞的体外生长过程中具有重要作用.     

HBV前S2蛋白对胰岛素受体基因下调作用的研究

目的 探讨乙型肝炎病毒前S2蛋白(pre-S2)对胰岛素受体(INSR)基因的转录调节作用.方法 以pGEM-Teasy-65-2质粒为模板,扩增乙型肝炎病毒(HBV)pre-S2基因片段,构建真核表达载体pcDNA3.1-preS2,以不同剂量(1.0、1.5、2.0μg)转染肝癌细胞系HepG2和Huh7,36h及72h后分别提取转染后细胞总RNA,利用实时荧光定量PCR检测细胞内的INSR mRNA水平,观察HBV的pre-S2蛋白对INSR基因的转录调节作用,同时观察阻断pre-S2蛋白后INSR的表达情况.结果 转染不同剂量pcDNA3.1-preS2后,HepG2细胞内INSR基因的表达水平分别为对照的61%、20%、11%(转染后36h)和92%、69%、37%(转染后72h),Huh7细胞内INSR基因的表达水平分别为对照的63%、47%、35%(转染后36h)和83%、73%、34%(转染后72h);细胞INSR mRNA水平随真核表达载体pcDNA3.1-preS2转染剂量的增加而降低.在转染2μg pcDNA3.1-preS2的同时,将抗pre-S2单克隆抗体加入培养上清,可部分阻断pre-S2蛋白对INSR mRNA表达的抑制,HepG2细胞中的INSR mRNA水平分别恢复到转染空质粒对照的65%(转染后36h)和81%(转染后72h),Huh7细胞中的INSR mRNA水平则分别恢复到69%(转染后36h)和96%(转染后72h).结论 HBV pre-S2蛋白对肝癌细胞系HepG2和Huh7细胞的INSR基因有明显下调作用,抗pre-S2抗体能部分阻断这种下调作用,此机制可以在分子水平部分解释肝源性糖尿病的发生.     

百赛诺对乙型肝炎的临床疗效观察

目的 :了解百赛诺 (双环醇 )对慢性乙型肝炎的临床疗效。方法 :应用百赛诺治疗 2 2例慢性乙型病毒性肝炎患者 ,总结分析其治疗前后肝功能、HBVDNA、HBV抗原抗体变化。结果 :2 2例慢性乙型肝炎患者服用百赛诺 3个月后ALT明显下降 ,与服药前相比有显著性差异 (5 4 82± 3 4 68vs14 2 0 5± 71 4 8,P <0 0 1) ;AST明显下降 ,与服药前相比具有明显差异 (68 64± 5 1 4 7vs93 82± 5 1 19,P <0 0 5 )。半年疗程后复查ALT仍低于服药前 (5 6 5 5± 64 0 2vs14 2 0 5±71 4 8,P <0 0 1) ,AST仍保持在较低水平。 2 2例病人中 ,半年疗程后及停药 3个月后共有 4例发生HBeAg转换 ,由HBeAg( )变为HBeAb( ) ,有 2例HBVDNA转阴 ,另有 2例HBVDNA定量明显下降。结论 :百赛诺具有明显的降酶护肝作用 ,可能有一定的抗病毒作用。     

不同病毒载量乙型肝炎患者的肝功能与肠道微生态分布及数量变化的关系研究

目的 分析不同病毒载量乙型肝炎患者的肝功能与肠道微生态分布及数量变化的关系。方法 选择2017年1月-2021年1月经宜兴市人民医院治疗的乙型肝炎患者94例为研究对象,根据乙型肝炎病毒（HBV）-DNA检测结果将患者分为阴性组29例,阳性组患者共65例。按照HBV-DNA载量将患者分为低、中拷贝组43例、高拷贝组22例,同期选择50例正常者为对照组。比较各组肝功能指标及与肠道微生物数量变化,分析高病毒载量乙型肝炎患者的肝功能与肠道微生态的关系。结果 阳性组患者丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase, γ-GT)水平均高于阴性组、对照组（P＜0.05）。低、中拷贝组和高拷贝组患者ALP、γ-GT水平比较无显著差异（P＞0.05）。高拷贝组患者ALT、AST水平均高于低、中拷贝组（P＜0.05）。阳性组患者普雷沃氏菌属、梭菌属、肠杆菌科细菌、粪球菌属、白色念珠菌数量均高于阴性组、对照组（P＜0.05）,而拟杆菌属、瘤胃球菌属、乳酸杆菌属、双歧杆菌属低于阴性组、对照组（P＜0.05）。高拷贝组患者普雷沃氏菌属、瘤胃球菌属、梭菌属、粪球菌属、白色念珠菌数量均高于低、中拷贝组（P＜0.05）,而拟杆菌属低于低、中拷贝组（P＜0.05）。高病毒载量乙肝患者ALT、AST、γ-GT水平与拟杆菌属、瘤胃球菌属、乳酸杆菌属呈负相关,与普雷沃氏菌属、梭菌属、双歧杆菌属、粪球菌属、白色念珠菌、肠杆菌科细菌呈正相关（P＜0.05）。结论 高病毒载量乙肝患者肝功能与肠道微生态变化呈相关性。其患者病毒载越高,肠道微生态越紊乱,导致肝功能受损,影响肝功能指标水平变化。     

前S1抗原在乙型肝炎诊断中的作用

目的：分析乙型肝炎病毒前S1抗原（PreS1）与乙型肝炎病毒（HBV）复制的关系。方法：采用酶联免疫吸附实验（ELISA）方法对364例乙型肝炎不同标志物的患者血清进行PreS1测定并与用荧光定量聚合酶链反应对HBV—DNA进行含量测定，然后做对比分析。结果：364例乙型肝炎患者中，167例HBsAg、HBeAg、抗HBc^＋阳性组中PreS1叶。144例（86．2％），HBVDNA阳性147例（88．0％），这组患者病毒高度复制，PreS1和HBVDNA两者间差异无显著意义，P〉0．05。122例HBsAg、抗HBe、抗HBc阳性组中PreS1^＋38例（31．1%），HBVDNA阳性43例（35．2％），表明HBeAg阴性患者仍有病毒复制，两者间差异无显著意义，P〉0．05。65例HBsAg和抗HBc阳民生组中PreS1^＋17例（26．2％），HBVDNA^＋20例（30．7％），表明病人仍有病毒在复制。10例HBsAg、HBeAg阳性组中PreS1^＋7例（70．0％），HBVDNA＋9例（90．0％），表明病人病毒在复制。结论：乙肝病毒前S1抗原是乙肝病毒在体内复制和传染的可靠指标，特别是在反映HBeAg阴性的乙型肝炎患者是否有病毒复制的诊断中有重要意义。     

Prevalence of hepatitis B virus chronic carriers and risk factors for hepatitis B virus infection among Lithuanian army soldiers

The aim of this study was to evaluate the prevalence of hepatitis B serological markers (hepatitis B virus (HBV) superficial antigen (HBsAg)) and risk factors for HBV infection among Lithuanian Army soldiers. The study was carried out in Lithuanian military subunits in 2003. Serum samples were draw from 1,830 soldiers (average age, 21.6 (0.707) years) and tested for hepatitis B infection markers (HBsAg). Questionnaires were used to obtain information about risk factors associated with HBV infection. A total of 1.97% of soldiers was seropositive for HBsAg. The prevalence rate of HBV infection was related to military subunit (p > 0.05). Most of the HBsAg-positive soldiers (53.8%) served 4 to 6 months. Among soldiers who were offered to use drugs, the prevalence of HBsAg was 4.3%; in the remaining group, the prevalence was 1.9%. No association was found between other risk factors for HBV infection and the prevalence rate of the hepatitis B marker. Study data proved the need for health promotion, prophylactic vaccination, and monitoring programs at the Lithuanian Armed Forces.     

黄芩苷诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的p38MAPK途径研究

目的研究黄芩苷对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用及其对p38MAPK信号通路的影响。方法以不同浓度的黄芩苷与人肝癌HepG2细胞共同培养24、48、72 h后,采用MTT法测定细胞增殖抑制率;通过活细胞计数,检测不同浓度黄芩苷处理后细胞活力的变化;采用western blotting方法检测黄芩苷处理72 h后HepG2细胞p38和p-p38蛋白的表达变化。结果黄芩苷对HepG2细胞生长有抑制作用,并随药物作用时间的延长和药物浓度的增加,其抑制效果越明显;通过对活细胞计数发现黄芩苷对HepG2细胞生长有抑制作用,随黄芩苷浓度的增加,细胞存活率下降,细胞增殖速度明显减缓;在黄芩苷处理72 h后p38蛋白表达兀明显变化,而p-p38蛋白表达上调且随黄芩苷浓度升高蛋白表达升高。结论黄芩苷可能通过激活p38MAPK信号通路诱导人肝癌HepG2细胞凋亡。     

索拉非尼联合顺铂抑制肝癌HepG2细胞生长的体外研究

目的探讨索拉非尼联合顺铂(DDP)对肝癌细胞HepG2生长的抑制作用及其可能的分子机制。方法实验细胞分为4组:空白对照组、索拉非尼单药组、顺铂单药组、索拉非尼联合顺铂组。索拉非尼和顺铂单独或联合作用于细胞,以MTT法检测24、48、72、96h时间点药物对HepG2细胞的增殖抑制率,流式细胞仪检测24、48h时间点的细胞周期与凋亡率。在药物作用后24h,用荧光染料罗丹明123(Rh123)染色细胞,流式细胞仪测定线粒体跨膜电位(ΔΨm),分光光度法检测caspase-3活性。结果索拉非尼及顺铂单独应用对HepG2生长均有抑制作用,且低剂量联合具有协同作用。联合用药可以使细胞周期阻滞于G0/G1期和G2期,且凋亡率明显高于单药组(P<0.05)。单独应用顺铂和索拉非尼均能使线粒体跨膜电位降低,而联合组作用强于单药组(P<0.05)。药物作用后caspase-3活性增高,联合组高于单药组(P<0.05)。结论索拉非尼联合顺铂能更好地抑制肝癌HepG2细胞增殖,并促进其凋亡,其机制可能与细胞周期阻滞、线粒体跨膜电位降低及caspase-3活性增加有关。     

我国患者多重耐药乙肝病毒感染的基因型和表型特点

目的分析我国大样本来源的慢性乙肝病毒(HBV)感染患者多重耐药HBV的基因型和表型特点。方法回顾性分析11 800例慢性乙肝患者血清中HBV反转录酶(RT)区与核苷(酸)类似物耐药相关的突变类型及频率,采用PCR产物直接测序法和克隆测序法(≥20个克隆/样本)对其中的46例多重耐药HBV突变株进行鉴定。采用体外表型耐药分析法检测核苷类与核苷酸类联合处理对多重耐药HBV的抑制效果。分析临床治疗方案在多重耐药HBV感染的发生及控制中的作用。结果在11 800例慢性HBV感染者中,共3658例(31.0%)检出核苷(酸)类耐药相关突变,其中拉米夫定(LAM)耐药突变2592例(70.9%),阿德福韦酯(ADV)耐药突变665例(18.2%),恩替卡韦(ETV)耐药突变293例(8.0%),替比夫定(LdT)耐药突变62例(1.7%),同时针对核苷类和核苷酸类的多重耐药(MDR)突变46例(1.3%)。对46例多重耐药感染样本的克隆测序显示,40例样本在同一病毒基因组上检出MDR突变,其他6例样本的MDR突变则存在于不同的HBV基因组中。基因型分析显示共有15种病毒变异形式,同时耐LAM(或LdT)和ADV,以及同时耐ETV和ADV的MDR株分别为10种和5种。体外表型耐药分析结果显示,ETV(或LAM)和ADV联合用药可有效抑制HepG2细胞内MDR HBV的复制,但对野生株无类似效果。临床用药方案分析显示,多重耐药HBV感染常出现在LAM(或)LdT、ADV、ETV序贯治疗的患者,以LAM→ADV(22例)和LAM→ADV→ETV(10例)最多见,发生多重耐药后大多出现病毒学和(或)生化学突破。LAM+ADV或ETV+ADV联合挽救治疗可成功将大多数多重耐药HBV的DNA复制控制在检测不到的水平。结论我国MDR HBV株具有多样性和复杂性,表型分析和临床观察均证实核苷与核苷酸类似物联合使用可有效控制MDR HBV复制。多重耐药HBV感染的发生与临床长期应用核苷(酸)类似物序贯治疗有关,密切监测病毒应答及耐药突变对于临床尽早制定最优的抗病毒策略具有重要意义。