丙型肝炎病毒包膜蛋白基因片段的克隆与表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ和基因重组技术，从湖南地区丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染者血清中克隆了ＨＣＶ包膜蛋白基因片段（Ｅ１，Ｅ２／ＮＳ１）经与已知基因型的ＨＣＶ－１，ＨＣＶ－Ｊ，ＨＣＶ－Ｊ６和ＨＣＶ－Ｊ８进行核苷酸序列的比较分析，这些基因片段属１ｂ型ＨＣＶ基因。将克隆基因重组于表达质粒ＰＭＡＬ－ＣＲＩ中，在大肠杆菌内进行高效表达，获得了融合蛋白ＭＢＰ－Ｅ１，ＭＢＰ－Ｅ２／ＮＳ１，经ＷｅｓｔｅｍＢｌｏｔ分析证实     

Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒E2/NS1基因的克隆与序列分析

目的构建插入Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因片段的真核表达载体，分析该基因片段的核苷酸一级结构。方法利用逆转录套式ＰＣＲ扩增Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｅ２／ＮＳ１基因片段，通过定向克隆将其克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３上，采用双脱氧链终止法测定其核苷酸序列。结果构建出含有Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因片段的克隆，该区基因片段的核苷酸一级结构和Ⅲ型日本株ＨＣＶ（ＨＣ－Ｊ６）的同源性为８８．３７％，Ⅱ型中国株ＨＣＶ（ＨＣ－Ｃ２）的同源性为７０．６９％，其推定的氨基酸同源性分别为８９．２９％和７５．５５％。结论基因的核苷酸一级结构在同一基因型中有较高的同源性，而不同基因型之间的同源性则相对较低。对不同基因型之间Ｅ２／ＮＳ１基因一级结构的研究将有助于ＨＣＶ疫苗的研制。     

Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒E2／N21基因的克隆与序列分析

目的 构建插入Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因片段的真核表达载体,分析该基因片段的核苷酸一级结构。方法 利用逆转 录套式ＰＣＲ扩增Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｅ２／ＮＳ１基因片段,通过定向克隆将其克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３上,采用双脱氧链终止法测定其核苷酸序列。结果 构建出含有Ⅲ型中国株丙型肝炎病毒Ｅ２／ＮＳ１基因片段的克隆,该区基因片段的核苷酸一级结构和Ⅲ型日本株ＨＣＶ（ＨＣ－Ｊ６     

霍乱弧菌不同群体菌株的群体遗传特征比较

应用ＭＥＥ法对５９２株霍乱弧菌的１５个酶基因位点进行检测，分析和比较霍乱弧菌不同群体的群体遗传特征。结果：古典型菌株（ＣＶＣ）、埃尔托流行株（ＥＳＥＶＣ）和Ｏ１３９菌株（Ｏ１３９）的群体平均遗传多态值和平均杂合度都很低，ＨＣＶＣ＝０．１０６、ｈＣＶＣ＝１．５，ＨＥＳＥＶＣ＝０．０５６、ｈＥＳＥＶＣ＝２．３（Ｏ１３９包含在ＥＳＥＶＣ之中），被检测的基因位点多为非多态位点；而同为Ｏ１群菌的埃尔托非流行株（ＮＳＥＶＣ）的平均遗传多态值和平均杂合度要高得多，接近非Ｏ１群菌株（ＮＯ１）的群体遗传学指标，分别为ＨＮＳＥＶＣ＝０．４２５、ｈＮＳＥＶＣ＝５，ＨＮＯ１＝０．６２７、ｈＮＯ１＝６．５，被检测的基因位点几乎全是遗传多态位点。结果表明：ＥＳＥＶＣ和ＮＳＥＶＣ虽然都是Ｏ１群菌，但在群体遗传学特征上存在巨大差异；ＣＶＣ、ＥＳＥＶＣ和Ｏ１３９为遗传学性状稳定、群体遗传结构紧密的群体，而ＮＳＥＶＣ和ＮｏｎＯ１的群体遗传关系离散     

利用PCR技术构建GM—CSF／Fcγ2融合蛋白载体

目的：构建 Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ／ Ｆｃγ２ 融合蛋白载体。方法：利用 Ｐ Ｃ Ｒ技术,将人 Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ基因与人免疫球蛋白 Ｉｇ Ｇ２ 的 Ｆｃ 段基因联接,构建融合基因ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ Ｈ Ｖ２;并将此片段定向克隆到真核表达质粒ｐ Ｒｃ／ Ｃ Ｍ Ｖ２ 载体。结果：琼脂糖凝胶电泳结果显示 Ｐ Ｃ Ｒ扩增出了 １．３ ｋｂ 的融合基因片段;限制性内切酶图谱分析,成功地完成了 Ｇ Ｍ  Ｃ Ｓ Ｆ／ Ｆｃγ２ 融合蛋白载体的构建。结论：（１）经 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增技术由质粒 Ｐ Ｃ Ｄｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ和 Ｐ Ｓ Ｖ Ｖ Ｎ Ｐ Ｈ Ｖ２ 分别扩增到了所需的ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ ｃ Ｄ Ｎ Ａ 片段和 Ｉｇ Ｇ２ 从绞链区到 Ｃ Ｈ３ 的基因组 Ｄ Ｎ Ａ 片段。（２）利用 Ｐ Ｃ Ｒ介导,扩增出了融合基因片段ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ Ｈ Ｖ２。（３）构建了真核细胞表达载体ｐ Ｒｃ／ Ｃ Ｍ Ｖ２／ｈ Ｇ Ｍ Ｃ Ｓ Ｆ Ｈ Ｖ２ 。     

疱疹病毒I型中国株胸苷激酶基因治疗脑瘤的临床前研究

目的验证胸苷激酶（ＴＫ）基因介导的羟甲基无环鸟苷（ＧＣＶ）系统对人脑恶性神经胶质瘤基因治疗的有效性及安全性。方法从中国疱疹病毒Ｉ型（ＨＳＶ－Ｉ）株（１７）中分离了胸苷激酶（ＴＫｃ）基因，并作了ＤＮＡ序列分析，组建了含ＴＫｃ基因的逆转录病毒重组载体（ｐＬＴＫｃＳＮ）及其含ｐＬＴＫｃＳＮ病毒的病毒生产细胞（ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ）。体外有效性试验：应用ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ与大鼠脑瘤Ｃ６细胞共培养后用ＧＣＶ处理。体内有效性试验：以ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ原位注入大鼠颅内移植的Ｃ６脑瘤。安全性试验：通过小鼠、大鼠和猴植入ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ并注射ＧＣＶ观察其毒副作用。结果ＨＳＶ－ＩＴＫｃ基因与ｐＯＰＦＨＳＶ－１ＴＫ基因比较有５个核苷酸和２个氨基酸的变异。ｐＬＴＫｃＳＮ及其ｐＬＴＫｃＳＮ／ＶＰＣ，在体内外能有效地介导ＧＣＶ对Ｃ６产生细胞毒作用。其病毒滴度为２×１０６ＣＦＵ／ｍｌ。经过４８只小鼠、２４只大鼠和６只猴体内未见严重毒副作用和不可逆的病理改变。结论疮疹病毒胸苷激酶基因治疗脑肿瘤是有效和安全的，通过药审后可用于临床试验。     

丙型肝炎病毒E2及preS融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达

丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｃ基因与ｐｒｅＳ２基因嵌合，嵌合基因免疫小鼠能产生抗ＨＣＶＣ蛋白的抗体，而单独接种ＨＣＶＣ基因则不能诱导小鼠产生抗Ｃ蛋白的抗体［１］。为研究ｐｒｅＳ能否增加ＨＣＶＥ２蛋白的免疫原性提供物质基础，我们在哺乳动物细胞稳定表达了Ｅ２?..     

PCR法在疱疹病毒性脑炎诊断及疗效观察中的应用

选择疱疹病毒科病毒ＤＮＡ多聚酶基因高保守区中的一对引物，一次ＰＣＲ可同时扩增疱疹病毒科的４种病毒［单纯疱疹病毒Ｉ型（ＨＳＶ１）、单纯疱疹病毒Ｉ型（ＨＳＶ２）、ＥＢ病毒（ＥＢＶ）、及巨细胞病毒（ＣＭＶ）］相应的ＤＮＡ片段。根据扩增产物分子的大小及对扩增产物酶切分析，可将标本中的４种病毒准确分型。用该法检测临床疑为病毒脑炎患者和其他中枢神经系统疾病患者（对照组）的脑脊液（ＣＳＦ），脑炎组ＣＳＦ阳性率３０％（９／３０），对照组ＣＳＦ阳性率６．７％（２／３０）；其中８例为ＨＳＶ１阳性，２例为ＣＭＶ阳性，１例为ＨＳＶ２阳性。２例病毒脑炎患者经用无环鸟苷抗病毒治疗７～１０ｄ后其ＣＳＦ中的ＨＳＶ１ＤＮＡ由阳转阴。由此说明ＰＣＲ法不仅可早期诊断疱疹病毒性脑炎，还可显示抗病毒药物的疗效。     

17—β雌二醇对原代人脐静脉内皮细胞一氧化氮合酶基因表？…

目的：阐明雌二醇对内皮细胞一氧化氮（ＮＯ）生成及一氧化氮化合酶（ｃＮＯＳ）基因表达的影响，方法；观察雌二醇作用于原代人脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）一定时间（１－２４ｈ）后的ＮＯ产量，采用Ｇｒｅｉｓｓ反应测定代谢产物ＮＯ２的量及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交技术分析雌二醇作用于ＨＵＶＥＣ１８ｈｃＮＯＳｍＲＮＡ的表达，结果：１００，３０，１０及１ｎｍｏｌ．Ｌ＾－１的雌二醇作用下，ＨＵＶＥＣ分别于１，４，１２及１     

慢性丙型肝炎患者（2＇，5＇）寡腺苷酸合成酶的活性测定

目的：了解慢性丙型肝炎患者（２＇，５＇）寡腺苷酸合成酶（２－５ＡＳ）活性在干扰素治疗过程中的动态变化及意义。方法：ＰＥＩ－ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ薄板层析法。结果：（１）慢性丙型肝炎患者２－５ＡＳ基础水平比正常人显著升高（Ｐ＜０．０１）；（２）ＩＦＮα治疗结束后ＨＣＶＲＮＡ持续阳性的病人２－５ＡＳ基础水平比ＨＣＶＲＮＡ转阴的病人要高（Ｐ＜０．０５）；（３）ＩＦＮα治疗效果较好，ＨＣＶＲＮＡ转阴的病人２－５ＡＳ水平在用药后２４ｈ比ＨＣＶＲＮＡ未转阴的病人上升得更高（Ｐ＜０．０１）；（４）用药后１个月２～５ＡＳ水平与ＩＦＮα治疗效果无显著相关性（Ｐ＞０．０５）。结论：２－５ＡＳ可以作为评价干扰素治疗效果的１个机体反应指标。     

HCV E2和HBV preS融合蛋白真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞 …

目的 构建丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｅ２和乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ｐｒｅＳ融合蛋白的真核表达载体。方法 用ＰＣＲ方法扩增ＨＢＶｐｒｅＳ和ＨＣＶＥ２蛋白基因,并将二者克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３中,用脂质体转染试剂将其转入ＣＯＳ７细胞,通过免疫荧光检测细胞瞬时表达的融合蛋白,结果Ｅ２－ｐｒｅＳ融合蛋白基因包括了全长的ＨＢＶｐｒｅＳ和ＨＣＶＥ２蛋白基因,嵌合基因长度约１．６ｋｂ表达载体在ＣＯＳ７细胞表达出     

17-β雌二醇对原代人脐静脉内皮细胞一氧化氮合酶基因表达的影响

目的：阐明雌二醇对内皮细胞一氧化氮（ＮＯ）生成及一氧化氮合酶（ｃＮＯＳ）基因表达的影响。方法：观察雌二醇作用于原代人脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）一定时间（１～２４ｈ）后的ＮＯ产量，采用Ｇｒｅｉｓ反应测定代谢产物ＮＯ－２的量及Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交技术分析雌二醇作用于ＨＵＶＥＣ１８ｈｃＮＯＳｍＲＮＡ的表达。结果：１００、３０、１０及１ｎｍｏｌ·Ｌ－１的雌二醇作用下，ＨＵＶＥＣ分别于１、４、１２及１８ｈ起，ＮＯ－２产量有明显增高。０．１ｎｍｏｌ·Ｌ－１雌二醇作用２４ｈ内，ＮＯ－２产量与对照组比较差异无统计学意义。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果表明：１～１００ｎｍｏｌ·Ｌ－１雌二醇可明显促进ｃＮＯＳｍＲＮＡ的表达；而０．１ｎｍｏｌ·Ｌ－１雌二醇无此效应。结论：雌二醇可促进ＨＵＶＥＣＮＯ的生成及ｃＮＯＳ基因的表达，可能为雌激素保护作用的重要机制，雌二醇作用的阈浓度可能在０．１～１ｎｍｏｌ·Ｌ－１之间     

边缘性人格障碍与焦虑症的诱发电位比较

目的 探讨边缘性人格障碍（ＢＰＤ）和焦虑症（ＡＮ）在诱发电位中的特点。方法 收集２７例ＢＰＤ组,３４例ＡＮ及５２名正常成人对照组（ＮＣ）,应用美国仪器以及光、声触刺激,完成视觉诱发电位（ＶＥＰ）、听觉诱发电位（ＡＥＰ）和体感诱发电位（要与ＮＣ相比,ＢＰＤ组潜伏期ＶＥＰ／Ｐ１、Ｐ２,ＡＥＰ／Ｐ１,Ｎ２前移,波幅ＶＥＰ／Ｎ１－Ｐ２,Ｐ３,ＡＥＰ／Ｐ３,ＳＥＰ／Ｐ３,Ｐ３增高但波幅ＶＥＰ／Ｐ２－Ｎ２、Ｐ     

质粒单独转染与共转染哺乳动物培养细胞的对比研究

我们对ＢＡＬＢ／Ｃ近交系小鼠肥大细胞瘤细胞株Ｐ８１５细胞通过鳞酸钙围染技术，用含ＨＢＶＳ基因的质粒ｐＲｃ／ＣＭＶＳ与含筛选标记基因ｎｅｏ’基因的质粒ｐＳＶ２－ｎｅｏ进行了共转染，用含ＨＣＶＣ，Ｅ１，Ｅ２以及ｎｅｏ基因的质粒ｐＲｃ／ＣＥ２进行了单独转染，经Ｇ４１８筛选，分别获得了Ｇ４１８抗性细胞；Ｐ８１５－Ｓ和Ｐ８１５－ＣＥ２细胞，提示单独转染与共转染的获成功，进一步证实的质粒单独转染与共转染哺乳支     

丙型肝炎病毒基因高变区（E1,E2／NS1）的分子克隆及基因型鉴定

对广东省一个患血血清中的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因高变区进行分子克隆及基因型鉴定。采用微粒吸附法提取ＨＣＶ ＲＮＡ，随机引物逆转录后进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）。所用引物位于Ｅ１，Ｅ２／ＮＳ１区，扩增产物８０６ｂｐ，产物提纯后定向插入ｐＢＶ２２０质粒载体，重组体转染ＤＨ５α菌株，筛选菌落经增殖后碱变性法提取质粒，再通过ＰＣＲ及酶切法鉴定阳性克隆。我们还用酶切法对此株克隆的基因型作了初步鉴定，证明属于     

阿尔茨海默病与老年精神分裂症患者的诱发电位比较

目的了解Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病（ＡＤ）与老年精神分裂症患者（ＳＳ）在感觉性诱发电位检查中的异同。方法共收集３９例ＡＤ患者、３４例ＳＳ患者及４０名正常老年人（ＮＣ）对照。应用丹麦仪器以及光和声刺激,完成视觉诱发电位（ＶＥＰ）和听觉诱发电位（ＡＥＰ）检查。结果发现ＡＤ组波形变异大,ＶＥＰ的Ｎ２、Ｐ３以及ＡＥＰ的Ｐ１、Ｎ１、Ｐ２、Ｎ２、Ｐ３波潜伏期明显延迟,ＶＥＰ主波Ｐ２平均波幅较ＳＳ组和ＮＣ组分别降低３２％和５７％。ＡＥＰ主波Ｐ２平均波幅较ＳＳ组和ＮＣ组分别降低３６％和７０％。ＳＳ组ＶＥＰ和ＡＥＰ的Ｎ２、Ｐ３均比ＮＣ组明显延迟。ＳＳ组ＶＥＰ和ＡＥＰ／Ｐ２波平均波幅比ＮＣ组降低分别为１６％和２０％。结论ＶＥＰ和ＡＥＰ可作为ＡＤ患者和ＳＳ患者鉴别诊断的辅助手段。     

丙型肝炎病毒基因高变区（E1，E2／NS1）的分子克隆及基因型鉴定

对广东省一个患者血清中的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因高变区进行分子克隆及基因型鉴定。采用微粒吸附法提取ＨＣＶＲＮＡ，随机引物逆转录后进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）。所用引物位于Ｅ１，Ｅ２／ＮＳ１区，扩增产物８０６ｂｐ，产物提纯后定向插入ｐＢＶ２２０质粒载体，重组体转染ＤＨ５α菌株，筛选菌落经增殖后碱变性法提取质粒，再通过ＰＣＲ及酶切法鉴定阳性克隆。我们还用酶切法对此株克隆的基因型作了初步鉴定，证明属于１组Ⅱ型。     

阿尔茨海默病与老年精神分裂症患者的诱发电位比较(摘要)

了解Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病（ＡＤ）与老年精神分裂症患者（ＳＳ）在感觉性诱发电位检查中的异同。方法共收集３９例ＡＤ患者、３４例ＳＳ患者及４０名正常老年人（ＮＣ）对照。应用丹麦仪器以及光和声刺激,完成视觉诱发电位（ＶＥＰ）和听觉诱发电位（ＡＥＰ）检查。结果发现ＡＤ组波形变异大,ＶＥＰ的Ｎ２、Ｐ３以及ＡＥＰ的Ｐ１、Ｎ１、Ｐ２、Ｎ２、Ｐ３波潜伏期明显延迟,ＶＥＰ主波Ｐ２平均波幅较ＳＳ组和ＮＣ组分别降低３２％和５７％。ＡＥＰ主波Ｐ２平均波幅较ＳＳ组和ＮＣ组分别降低３６％和７０％。ＳＳ组ＶＥＰ和ＡＥＰ的Ｎ２、Ｐ３均比ＮＣ组明显延迟。ＳＳ组ＶＥＰ和ＡＥＰ／Ｐ２波平均波幅比ＮＣ组分别降低１６％和２０％。结论ＶＥＰ和ＡＥＰ可作为ＡＤ患者鉴别诊断的辅助手段     

临床病人口服外消旋维拉帕米的对映体药物动力学结合药效学分析

以三甲基－β－环糊精为手性选择剂，采用毛细管区带电泳模式快速监测临床病人口服外消旋维拉帕米（ＶＰＭ）后ＶＰＭ和去甲维拉帕米（ＮＶＰＭ）对映体的血浆浓度，同时测量心血管系统的药物效应（血压、心率、心电图）。运用分析临床零散数据的ＮＯＮＭＥＭ程序，分析２７名患者ＶＰＭ和（－）－ＶＰＭ的稳态群体药物动力学和１６例患者的群体药效学。ＶＰＭ的Ｒ／Ｓ（ＣＳＳ）比值为３．６２±０．９６（２．２８～５．５８），ＮＶＰＭ的Ｒ／Ｓ（ＣＳＳ）比值为２．８９±０．５３（１．６６～３．６９）；ＶＰＭ和（－）－ＶＰＭ的群体药物动力学参数θＣＬ／Ｆ（Ｌ／ｈ）、θＳＥＸ（Ｌ／ｈ）、ωＣＬ／Ｆ（％）、σＣｓｓ（％）分别为８３，－９．７，４７．５，３４．８和２００，５０，３１．５，４５．５，男女性别之间存在差异。ＶＰＭ和（－）－ＶＰＭ的群体药效学参数Ｅｍａｘ（％）、ＣＥ５０（ｎｇ／ｍｌ）、γ、ωＥｍａｘ（％）、ωＣＥ５０（％）、ωγ（％）、σＥ（％）分别为１４．８，２７．６，２．３８，４３．２，３７．６，１３４，３４．９和１４．３，４．６８，１．８２，１４．３，３０．４，８．９，１８．２。     

常频喷射通气和高频喷射通气对蒸气吸入伤犬通气效率的比较

采用蒸气吸入性损伤犬模型，比较常频喷射通气（ＮＦＪＶ）和高原喷射通气（ＨＦＪＶ）的通气效率。结果表明：（１）与ＨＦＪＶ比较，ＮＦＪＶ时的气道压峰值显著升高（Ｐ＜０．０１）；（２）与ＨＦＪＶ比较，ＮＦＪＶ时的Ｐ＿ＡＯ＿２显著下降（Ｐ＜０．０５），ＰａＣＯ＿２显著升高（Ｐ＜０．０１）；（３）与ＨＦＪＶ比较，ＮＦＪＶ时的心输出量（ＣＯ）、氧供量（ＤＯ＿２）和氧耗量（ＶＯ＿２）均显著减少（分别减少１４％、２０％和２４％，Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１），而ＰａＯ＿２、ＳａＯ＿２、Ｐ＿（Ａ－ａ）Ｏ＿２、ＰａＯ＿２／Ｆ＿１Ｏ＿２、ＰｖＯ＿２、ＳｖＯ＿２和氧摄取率（ＥＲＯ＿２）均无明显变化。提示，ＮＦＪＶ与ＨＦＪＶ比较，前者导致肺泡通气不足和ＣＯ＿２潴留，且对循环和组织氧合有不良影响。