应用反向斑点杂交法检测耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变

目的　探讨快速检测rpoB基因突变的敏感方法 ,以期建立适合我国国情的结核分支杆菌耐药株的快速检测手段。方法　根据结核分支杆菌野生株序列 ,自行设计覆盖rpoB基因核心突变区的系列寡核苷酸探针并将其固定在尼龙膜上 ,然后应用生物素标记的特异性引物扩增包含核心突变区的rpoB基因片段 ,与固定在膜上的寡核苷酸探针杂交 ,对突变位点进行快速检测 ,并与药敏试验及DNA测序结果进行比较。结果　应用反向斑点杂交法检测 36株耐药株和 2 2株敏感株rpoB基因的突变位点 ,并据此判断其对利福平的药敏特性 ,结果敏感性为 88.9% ,特异性为 86 .4 % ,药敏结果符合率为 87.9% ,与测序结果的符合率为 89.7%。结论　反向斑点杂交法可以快速、敏感地检测rpoB基因突变 ,进而早期判断结核分支杆菌对利福平的药敏特性。     

中国耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变特点

目的 为了阐明中国结核分支杆菌耐利福平析rpoB基因突变特点。方法 对242株结核分支杆菌临床分离包括rpoB基因核心区域81个碱基在内的588个碱基进行序列测定,其中耐利福平株193株,利福平敏感株46株,人工诱导的耐利福平株3株。结果 89．1％（172．193）的临床分离耐药株存在rpoB基因突变,而46株敏感株无突变。531位氨基酸突变率为46．1％;526位氨基酸突变率为17．1％;联合突变发生率为12．4％;还有4株细菌发生同义突变;未检测到发生缺失或插入突变的菌株。高耐药组（耐250μg/ml利福平）531位氨基酸的突变率显著高于低耐药组（耐50μg/ml利福平）,P＜0．05。结论 中国结核分支杆菌耐利福平株的rpoB基因突变的发生率约为90％,其中最常见的突变位点是531位丝氨酸和526位组氨酸,两者突变率之和约为63％;利福平高耐药组531位氨基酸发生突变的几率高于低耐药组;受度蓖株未发现搬运入或缺失突变;DNA序列分析对临床用药有指导意义。     

中国耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变特点

目的：为了阐明中国结核病耐利福平菌株rpoB基因突变特点。方法：对212株结核分支杆菌菌株包括rpoB基因核心区域81个碱基在内的588个碱基进行序列测定,其中利福平耐药株163株;利福平敏感株46株,及人工诱导的利福平耐药株3株。结果：有89．0％（145／163）的耐药株存在rpoB基因突变,而对照敏感株无突变。531位氨基酸突变率为49．1％;526位氨基酸突变率为17．8％;联合突变发生率为12．3％;还有2株细菌存在同义突变;未检测到发生缺失或插入突变的菌株。高耐药组（耐250μg/ml利福平）531位氨基酸的突变率显著高于低耐药组（耐50μg/ml利福平）,P＜0．05。结论：中国结核菌耐利福平菌株的rpoB基因突变的发生率约为90％,其中最常见的突变位点是531位色氨酸和526位组氨酸,二者总体突变率是66．9％;利福平高耐药组531位氨基酸发生突变的几率高于低耐药组,插入和缺失突变在我国比较罕见;DNA序列分析对临床用药有指导意义。     

结核分支杆菌耐利福平与rpoB基因

90年代初 ,全球结核病呈现死灰复燃趋势。到目前为止 ,结核病仍是造成成人死亡的感染性疾病中最常见的病因 ,全球 2 6 %的可避免死亡与结核病有关。我国约有 6 0 0万结核病患者 ,每年死于结核病者约 2 5万 ,为死于其他各类传染病人数总和的 2倍 ,每年由结核病带来的直接损失超过 35亿。结核病疫情恶化的原因主要有两方面 :一是耐药 ,尤其是耐多药结核 (ＭＤＲ ＴＢ)的出现 ;另一原因是人类免疫缺陷病毒 (ＨＩＶ)感染的爆发流行。我国结核病具有耐药率高的特点 ,初治病人中耐药结核病占 2 8 1% ,复治病人中占 41 1%。耐药结核病中继发耐药占…     

序列分析重庆地区耐利福平结核分支杆菌的rpoB基因突变

目的　研究重庆地区结核分支杆菌对利福平 (R)的耐受与rpoB基因突变的关系。方法　PCR扩增 6 7株分离自重庆地区肺结核患者的耐R结核分支杆菌的rpoB基因片段 (319bp) ;测定扩增片段的序列 ,并与野型株序列作对比分析。 结果　 6 7株临床分离的耐R株中 ,8株 (12 % )无变异 ,5 9株 (88% )有突变 ,突变涉及 8个氨基酸位点。突变有 14种类型 ,4 9株(83% )的突变为单个密码子取代 ,9株为双密码子取代 ,1株为 3个碱基 (一个密码子 )插入 ,未检出碱基缺失。突变高发位点为 5 31位 (37/ 5 9)密码子 ,其次为 5 16位 (13/ 5 9)和 5 2 6位 (7/ 5 9)。 3株菌在 4 77位的谷氨酸 (Glu) ,天冬氨酸 (Asp)突变为首次发现。结论　重庆地区结核分支杆菌耐利福平的发生与rpoB基因的突变密切相关 ,突变的类型与国外的报告基本相似。PCR扩增和产物测序将是临床检测结核分支杆菌耐利福平和耐多药的一种迅速、准确的方法     

聚合酶链反应－单链构象多态性用于耐利福平结核分支杆菌rpoB基因突变的研究

目的研究结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因突变及其与利福平（ＲＦＰ）耐药性的关系。方法以参考菌株结核分支杆菌Ｈ３７Ｒｖ为对照，用聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）方法分析了４０株结核分支杆菌临床分离株。ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法由ＰＣＲ扩增和扩增产物ＤＮＡ单链多态性分析组成。结果两对引物ＰＣＲ扩增产物分别为４１１和２５８ｂｐ，其敏感性分别为５ｐｇ／μｌ、５００个菌／ｍｌ和１ｐｇ／μｌ、５００个菌／ｍｌ；均为属特异性。４０株结核分支杆菌临床分离株２５８ｂｐ扩增片段ＳＳＣＰ图谱的特点：以参考菌株结核分支杆菌Ｈ３７Ｒｖ为对照，１０株敏感株均无区别；单耐ＲＦＰ或包括ＲＦＰ多种抗结核药３０株，除３株外，其余２７株ＳＳＣＰ图谱有明显的区别；检测阳性率为９０％，特异性为１００％。结论ＰＣＲ－ＳＳＣＰ方法可检测出耐ＲＦＰ结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因突变；该基因是ＲＦＰ的药物靶编码基因，它的突变与ＲＦＰ耐药性有密切关系，这有助于结核分支杆菌耐药性的快速检测和研究     

链亲合素包被磁珠用于PCR—SSCP检测耐利福平结核分支杆菌rpoB基因 …

在ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术用于结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因突变的检测中，为解决传统解链方法的复性和电泳需在低温条件下进行的问题，我们应用磁珠解链法，即在ＰＣＲ扩增时应用生物素标记正向引物，然后用链亲合素包被磁珠吸附扩增产物中被标记的ＤＮＡ。     

异烟肼耐药与结核分支杆菌katG基因突变的研究

探讨异烟肼耐药结核分支杆菌ｋａｔＧ基因突变的关系。     

六安地区结核分枝杆菌耐药基因katG 和rpoB 的突变特征

目的 分析临床分离的结核分枝杆菌katG 和rpoB 基因的突变情况与耐药之间的关系,了解六安地区耐药结核分枝杆菌的基因突变特征。方法 采用比例法对六安地区65 株结核分枝杆菌临床分离株进行药敏试验;通过特异性引物,对目的基因片段katG 和rpoB 进行扩增、测序后进行分析。结果 60 株结核分枝杆菌中分别有有9 株耐异烟肼和14 株耐利福平,其中同时耐异烟肼和利福平的6株。9 株耐异烟肼菌株中,4 株katG 在315（Ａ GC→ACC 或ACA）位点发生突变,占44.4％;14 株耐利福平菌株中,11 株rpoB 分别在516（GAC→GTC）、526(CAC→CGC 或TAC)和531(TCG→TTG)位点发生突变,占总耐药菌株的78.6％;6 株同时对利福平和异烟肼耐药,其中5 株katG 或rpoB 基因发生突变,占83.3％。结论 六安地区结核分枝杆菌耐异烟肼和耐利福平分别主要是由katG 和rpoB 基因突变引起,其中耐异烟肼主要在315（AGC→ACC 或ACA）位,而耐利福平在516（GAC→GTC）、526(CAC→CGC或TAC)和531(TCG→TTG)位,都发生了突变。     

荧光定量PCR技术快速检测rpoB基因突变及其临床应用

目的探讨荧光定量PCR技术检测基因突变的价值及其临床应用。方法针对结核分枝杆菌rpoB基因利福平耐药决定区(Rifampicin Resistance Determining Region,RRDR)526密码子和531密码子常见的突变形式设计探针(526CAC,526TAC,531TCG和531TTG),应用已知rpoB基因RRDR区序列的38株利福平耐药临床分离株和24株利福平敏感临床分离株以及5株非结核分枝杆菌菌株建立荧光定量PCR检测基因突变的方法。继而,应用该技术检测84份肺结核病例痰标本,与痰罗氏培养以及药敏结果进行比较,部分标本进行DNA测序证实。结果在38株利福平耐药、24株利福平敏感的临床分离株和5株非结核分枝杆菌中,其检测526密码子和531密码子突变的敏感性和特异性达100%。在84份肺结核病例的痰标本中,罗氏培养阳性62株,其中利福平耐药株48份,荧光定量PCR检测痰标本结核分枝杆菌DNA阳性为75例。荧光定量PCR检测到531密码子TTG突变65例,526密码子TAC突变7例。在48株利福平耐药株中,荧光定量PCR检测43株为531TTG突变,3株为526TAC突变,另2株利福平耐药株,经测序证实,1株514密码子TTC插入突变,1株为511密码子CCG和516密码子GGC联合突变。结论荧光定量PCR技术能快速检测rpoB基因突变,并能作为临床肺结核病人早期快速耐药诊断的辅助手段。     

荧光定量PCR技术快速检测rpoB基因突变及其临床应用

目的探讨荧光定量PCR技术检测基因突变的价值及其临床应用。方法针对结核分枝杆菌rpoB基因利福平耐药决定区（Rifampicin Resistance Determining Region，RRDR）526密码子和531密码子常见的突变形式设计探针（526CAC，526TAC，531TCG和531TTG），应用已知rpoB基因RRDR区序列的38株利福平耐药临床分离株和24株利福平敏感临床分离株以及5株非结核分枝杆菌菌株建立荧光定量PCR检测基因突变的方法。继而，应用该技术检测84份肺结核病例痰标本，与痰罗氏培养以及药敏结果进行比较，部分标本进行DNA测序证实。结果在38株利福平耐药、24株利福平敏感的临床分离株和5株非结核分枝杆菌中，其检测526密码子和531密码子突变的敏感性和特异性达100％。在84份肺结核病例的痰标本中，罗氏培养阳性62株，其中利福平耐药株48份，荧光定量PCR检测痰标本结核分枝杆菌DNA阳性为75例。荧光定量PCR检测到531密码子TTG突变65例，526密码子TAC突变7例。在48株利福平耐药株中，荧光定量PCR检测43株为531TTG突变，3株为526TAC突变，另2株利福平耐药株，经测序证实，1株514密码子TTC插入突变，1株为511密码子CCG和516密码子GGC联合突变。结论荧光定量PCR技术能快速检测rpoB基因突变，并能作为临床肺结核病人早期快速耐药诊断的辅助手段。     

套式PCR及测序方法用于痰标本中结核分枝杆菌rpoB耐药基因突变检测

目的应用套式PCR—DNA测序方法直接检测痰标本中结核分枝杆菌相关的rpoB基因突变，以期建立一种直接检测分枝杆菌耐利福平的快速方法，并评价其临床应用价值。方法采用套武PCR—DNA测序方法直接检测112例活动性肺结核患者和20例非结核性肺部疾病患者痰、标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变情况。同份痰标本同时做涂片抗酸染色，罗氏培养及菌型鉴定。结果112例活动性肺结核患者痰标本套式PCR扩增87例呈阳性，产物DNA测序31例有rpoB基因突变。其中分离出耐利福平株的32例痰中29例发生了基因突变，耐药突变率90．6％（29／32），39例菌阴（涂阴培阴）痰中有2例发生突变。分离出对利福平敏感株的37例痰中未发生突变，20例非结核性肺部疾病患者痰标本套式PCR扩增均为阴性，特异性100％。结论套式PCR—DNA测序可望为直接检测临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平的准确、特异、快速的方法。     

DNA序列分析与PCR-SSCP分析结核分支杆菌利福平敏感性的比较

目的　了解DNA序列分析与PCR-SSCP法分析利福平敏感性的价值。方法 应用DNA序列分析与PCR-SSCP法检测利福平敏感的结核分支杆菌临床分离株 25株、耐药株 41株的利福平耐药相关基因rpoB基因核心区域的突变情况。 结果 25株利福平敏感株DNA序列分析未检测到rpoB基因突变,41株耐利福平株中 38株发生突变,突变率为 92.7% (38/41);25株利福平敏感的结核分支杆菌菌株PCR-SSCP带型与对照H₃₇R_v株相同,41株耐利福平结核分支杆菌菌株中38株SSCP带型不同于对照株,提示有突变存在。与DNA序列分析相比,PCR-SSCP检测准确率为 93.9% (62/66),敏感度为 92.1% (35/38);特异度是 96.4% (27/28)。结论 DNA序列分析对判断结核分支杆菌耐利福平非常有价值;PCR-SSCP可用于利福平耐药结核分支杆菌的初步筛选。     

结核分枝杆菌rpoB基因突变特征的初步探讨

目的 了解浙江省耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变特征.方法 对65株临床分离菌株rpoB基因509-631位点分别进行PCR-SSCP检测和DNA序列测定,观察不同耐药株rpoB基因突变的规律.结果 耐利福平分离株96.4%（27/28）存在rpoB基因突变,其中526位突变率64.3%（18/28）,513位突变率21.4%（6/28）,531位突变率7.1%（2/28）,529位突变率3.6%（1/28）;耐其他抗结核药18.5%（5/27）存在rpoB基因突变,突变位点具有随机性.所有敏感菌株均无突变.结论 rpoB基因突变与利福平耐药密切相关,浙江省rpoB基因突变主要以526位突变为主,其次为513位,两者占总数的86%（24/28）,而耐其他抗结核药菌株也存在rpoB基因的突变,但没有明显规律,且均对利福平敏感.     

结核分枝杆菌rpoB基因突变特征的初步探讨

目的了解浙江省耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变特征。方法对65株临床分离菌株rpoB基因509-631位点分别进行PCR-SSCP检测和DNA序列测定,观察不同耐药株rpoB基因突变的规律。结果耐利福平分离株96.4%(27/28)存在rpoB基因突变,其中526位突变率64.3%(18/28),513位突变率21.4%(6/28),531位突变率7.1%(2/28),529位突变率3.6%(1/28);耐其他抗结核药18.5%(5/27)存在rpoB基因突变,突变位点具有随机性。所有敏感菌株均无突变。结论rpoB基因突变与利福平耐药密切相关,浙江省rpoB基因突变主要以526位突变为主,其次为513位,两者占总数的86%(24/28),而耐其他抗结核药菌株也存在rpoB基因的突变,但没有明显规律,且均对利福平敏感。     

中国异烟肼耐药结核分枝杆菌基因突变特征分析

目的: 明确中国异烟肼(INH)耐药结核分枝杆菌基因突变的分子特征。方法: 在PubMed、中国知网、万方、维普数据库中检索有关中国结核分枝杆菌耐INH基因突变的研究文献,对纳入文献的突变基因的突变位点、突变类型,以及氨基酸改变数量等信息进行整合分析。结果: 共纳入69篇中英文文献,共6393株INH耐药结核分枝杆菌。95.71%(6119/6393)检测到基因突变或缺失,其中katG、inhA、aphC突变数量最多,分别占77.57%(4959/6393)、15.20%(972/6393)、3.69%(236/6393)。单基因单位点突变占87.80%(5613/6393),联合突变占12.20%(780/6393)。katG315突变占INH耐药菌株总数的56.22%(3594/6393),katG463突变占10.03%(641/6393),inhA15突变占10.10%(646/6393)。突变形式最常见的是C→T,占10.03%(641/6393)。结论:中国INH耐药结核分枝杆菌突变基因最多的是katG、inhA、ahpC,突变密码子最多的是katG315、katG463、inhA15。