低氧反应元件对缺血心肌转染人血管内皮生长因子165基因表达的调控作用

目的 观察低氧反应元件(HRE)对低氧、复氧心肌细胞及缺血心肌转染人血管内皮生长因子165(hVEGF165)基因表达的调控作用.方法 分离新生SD大鼠心肌细胞,采用不同氧条件进行培养;建立猪心肌缺血一复灌动物模型,将在HEK293T细胞包装后获得的rAW-9HRE.hVEGF165病毒分别转染心肌细胞及动物缺血心肌.取培养心肌细胞及培养液,另取缺血区心肌组织,采用细胞免疫荧光法、酶联免疫吸附试验(ELISA)及Western blot方法 分别测定hVEGF165蛋白表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定hVEGF165 mRNA表达;Ⅷ因子染色,计数缺血心肌新生血管变化.结果 病毒转染率为87%;心肌细胞A、B及E组培养液中hVEGF165蛋白含量显著升高(P＜0.01),细胞免疫荧光hVEGF165蛋白染色呈阳性;RT-PCR检测显示,心肌细胞A、B及E组可见484 bp目的 条带;在动物整体水平,与转基因缺血组比较,转基因复灌组hVEGF165 mRNA及蛋白表达显著减弱(P＜0.01),心肌毛细血管密度亦减少.结论 HRE作为氧敏感基因调控开关能有效地调控缺血心肌转染hVEGF165基因的表达.     

血管内皮生长因子的调控及其作用研究进展

血管内皮生长因子（VEGF）是主要的血管生成因子,许多生长因子是通过诱导VEGF的表达而起作用的。本文对VEGF的分子生物学特性、作用、表达及生成的调节进行综述。     

人血管内皮生长因子165基因转染人骨髓间充质干细胞的实验研究

Objective To establish an effective method of transfecting human marrow mesenchymal stem cells (MSC) with human vascular endothelial growth factor 165 ( VEGF 165) gene. Methods MSCs isolated and cultured in vitro were divided into transfection group (pShuttle-CMV/VEGF 165 plasmid was transfected into MSCs through liposome-mediating method), empty plasmid group (pShuttle-CMV vehi-cle was transfected into MSCs as control), liposome group (liposome was transfected into MSCs as control) and control group(normal culture). Expressions of Mrna and protein of MSCs were determined by RT-PCR, enzyme-linked immunosorbent assay and Western Blot. Sensitivity to MSCs on VEGF plasmid transfec-tion was detected by MTT test. Results Expression level of VEGF 165 gene Mrna in transfection group, empty plasmid group, liposome group, and control group was respectively 0.89 ± 0.03, 0. 34 ± 0.04, 0.40 ± 0.03, and 0.30 ± 0.03, and the difference between transfection group and the other three groups was statistically significant ( P <0. 01 ). Content of VEGF protein in transfection group, empty plasmid group, liposome group, and control group was respectively (778 ± 35 ), (543 ± 24), (561 ± 28), (571 ± 23) pg/Ml, and the difference between transfection group and the other three groups was statistically significant ( P <0.01 ). In the transfection group, expression level of VEGF protein peaked on 7th day after transfec-tion, which was decreased gradually later. In transfection group, expression level of V EGF 165 protein was obviously higher than that of the other three groups ( P <0. 01 ), and no inhibitory effect of VEGF plasmid transfection on MSCs proliferation was found. Conclusions The method for transfecting human VEGF 165 gene into MSCs is established in this research, through which target gene and protein can express effectively.     

人反义血管内皮生长因子基因表达对肾癌细胞的影响

目的　探讨人反义血管内皮生长因子 (VEGF)基因对肾癌细胞VEGF表达及生长的影响。　方法　采用RT PCR方法将VEGF基因克隆于 pcDNA3.1反义真核表达载体 ,构建VEGF的pcDNA3.1反义真核表达载体 ,酶切鉴定。转染人肾癌 780 0细胞 ,G4 18筛选阳性克隆。免疫组化法检测VEGF表达 ,MTT法测生长曲线。　结果　pcDNA3.1 (antisense)VEGF组VEGF蛋白表达阳性细胞率 (10 .3% )明显低于 780 0 PC组 (92 .8% )和 780 0组 (96 .6 % ) ,P <0 .0 1;VEGF反义真核表达载体抑制肾癌 780 0细胞生长 ,在培养的第 4、5、6天 ,抑制率分别为 2 6 .38%、4 1.78%和 37.6 4 %。　结论　VEGF的 pcDNA3.1反义真核表达载体可明显降低肾癌细胞VEGF的表达 ,明显减慢肾癌细胞生长。     

血管内皮生长因子基因在原代培养大鼠肝细胞的转染表达

目的　研究血管内皮生长因子基因 (VEGF12 1)在原代培养大鼠肝细胞中转染表达。方法　构建 pIRES EYFP /VEGF12 1质粒 ,逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、WesternBlot和荧光显微镜观察VEGF基因在原代培养大鼠肝细胞中的转染表达。结果　pIRES EYFP/VEGF12 1质粒成功构建并转染原代培养大鼠肝细胞 ,RT PCR观察到 2 5 8bp的VEGF特异性条带 ,WesternBlot检测到相对分子质量 42× 10 3 的特异性条带 ,荧光显微镜观察到转染阳性肝细胞发出黄绿色荧光。结论　pIRES EYFP/VEGF12 1质粒在原代培养大鼠肝细胞转染并表达 ,为VEGF基因修饰肝细胞移植和基因治疗奠定基础。     

血管内皮生长因子基因转染血管内皮祖细胞治疗肢体缺血的实验研究

目的利用血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF-165）基因转染体外诱导的血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）,并移植到下肢缺血的新西兰兔体内,观测其促进血管新生,改善肢体缺血的效果。方法（1）梯度离心法分离兔骨髓单个核细胞,然后用含有VEGF、bFGF、IGF-1的M199培养液诱导培养EPCs。并以免疫荧光、透射电镜等方法进行鉴定。（2）用携带VEGF165基因的腺病毒质粒（Adv-GFP-VEGF165）转染所培养的细胞,ELISA法检测上清液中VEGF蛋白的表达。（3）制作兔下肢缺血模型,并将其随机分为A、B、C 3组,分别移植EPCs、VEGF165基因转染后的EPCs、M199培养基,多种方法检测移植效果及局部整合情况。结果（1）自兔骨髓诱导出梭形贴壁细胞,免疫荧光及电镜检测证实为EPCs。（2）Adv-GFP-VEGF165成功转染EPCs,ELISA法检测转染VEGF165后的EPCs其上清液中VEGF蛋白浓度明显升高。（3）Brdu示踪显示移植细胞整合到缺血局部,CTA及免疫组化检查显示VEGF-165基因转染后的EPCs移植后其改善肢体缺血效果优于其他两组。结论VEGF基因转染EPCs后能改进EPCs质量,移植后促血管新生能力增强,其效果优于未转染组。     

聚四氟乙烯血管材料携带的血管内皮生长因子基因转染血管内皮细胞并促进其生长的可行性

目的探讨聚四氟乙烯（PTFE）血管材料携载血管内皮生长因子（VEGF）基因转染内皮细胞并促进其生长的可行性。方法将pCDI-hVEGF121／pCDI／pEGFP质粒溶液处理过的PTFE人工血管修剪成圆片，置于生理盐水中并于不同的时间测溶液中DNA浓度，绘出体外释放曲线。分离和培养人脐静脉内皮细胞，将内皮细胞种植到携带上述质粒的PTFE材料表面，监测细胞增殖情况并用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测培养液中VEGF表达量，荧光显微镜下观察表达绿色荧光蛋白的内皮细胞比率。结果体外释放曲线提示从0．5～4．0h的这段时间内质粒释放较快，随后减缓，直至72h仍有质粒的释放。在24、72、120h，pCDI-hVEGF121组PTFE材料上的内皮细胞数和增长倍率都明显高于pCDI／pEGFP组材料（P〈0．05），pCDI—hVEGF121组培养液的VEGF水平明显高于pCDI／pEGFP组（P〈0．01），荧光显微镜下观察到pEGFP组内皮细胞内绿色荧光蛋白的表达。结论证明了PTFE材料能够携带VEGF基因转染内皮细胞并促进其生长。     

血管内皮生长因子对骨折愈合相关因子表达的调控

目的探讨应用和拮抗血管内皮生长因子(VEGF）对骨折愈骨相关因子表达的影响，并观察骨折愈台过程中的病理改变。方法用105只天上I=白兔制作骨折模型．随机分为对照组、应用VECF组和拮抗vEGF组，分别于伤后8、24、72b和1．3、5、8周测定各组动物骨折端相关因子的表达变化、同时取骨折端标本脱钙进行兜镜观察。结果应甩VEGF使骨折端埘BMP的表达时同提前和延良，拈抗VEGF抑制rBMP的表达，应用VEGF组伤后3J嗣时骨折端充填有纤维性骨痴，软骨骨痂和骨性骨痂．5周时新生骨以编织骨为主，8周时骨折正常愈合；括抗VH押导受伤后初期骨细胞坏死增多，1～5周各时相点骨折端均有灶性坏死出现，3同时骨折部位血管生成明显减少。结论骨折愈台过程需要多因子参与、协调，VEGF有可能是作为骨折愈台过程中的一种重要因子在发挥作用     

血管内皮生长因子基因转染促进股骨头坏死修复

目的　探索治疗股骨头及其它骨缺血性坏死新方法。方法　将血管内皮生长因子真核表达质粒pCD hVEGF1652 0 0 μg与胶原混合植入坏死的兔股骨头内 ,术后 2、4周用免疫组化SABC方法检测血管内皮生长因子 (VEGF)表达情况 ,组织形态学分析术后 2、4周修复区血管生成情况及术后 6、8周股骨头新骨形成情况。结果　术后 2周免疫组化证实基因转染组股骨头内有VEGF表达 ,组织形态学检测发现术后 2、4周转染基因的股骨头内血管生长快于对照组 ,术后 4、8周转染基因股骨头新骨形成多于对照组 ,差异均有显著性(P <0 0 1)。结论　利用VEGF基因转染刺激坏死骨组织内血管再生 ,可促进坏死骨修复 ,为临床治疗骨缺血性坏死提供了新的研究方向     

糖尿病足动脉缺血患者骨骼肌血管内皮生长因子基因表达

目的　研究糖尿病患者缺血下肢肌肉组织内源性血管内皮生长因子 (VEGF)基因表达及其与糖尿病足发病机理的关系。　方法　将 2 4例患者 ,33条肢体分为 3组 :无下肢动脉缺血的糖尿病 (DM) 5例 ,10条肢体 ;无糖尿病的下肢动脉粥样硬化闭塞症 (ASO) 10例 ,13条肢体 ;糖尿病下肢动脉硬化闭塞症 (DLASO) 9例 ,10条肢体。对照组为正常志愿者 (NOR) 5例 ,10条肢体。通过肌肉穿刺获取小腿骨骼肌组织 ,采用RT PCR法测定肌肉组织中hVEGF16 5mRNA表达。　结果　DM组和NOR组小腿骨骼肌组织中hVEGF16 5mRNA无表达。DLASO组小腿骨骼肌组织有hVEGF16 5mRNA表达 (0 0 2 1± 0 0 13) μg ,但明显低于ASO组 (0 133± 0 0 2 4 ) μg ,(t=13 32P <0 0 1)。　 结论　DLASO组缺血下肢肌组织内源性VEGF基因表达水平明显低于ASO组 ,是糖尿病足部溃疡发生发展的重要内在原因。     

人血管内皮生长因子C基因真核表达载体的构建

目的：VEGF—C基因的真核表达载体，以便进一步研究VEGF—C基因在淋巴管生成中的作用。方法：根据人VEGF—C的cDNA序列，设计合成一对5’端分别含有EcoRI和BamH I酶切位点的特异性引物，运用RT—RCR方法扩塔人乳腺癌细胞MDA—MB－231中的VEGF—C cDNA(1.26kb)；回收PCR产物(1．28kb)，并将其连接至克隆载体pUMT—18中，重组的pUMT—18在大肠杆菌DH5α内扩增后，经质粒提取、EcoR I和BamH I酶切，筛选出阳性重组子，并进行基因测序鉴定；琼脂糖凝胶电泳回收含有VEGF—C cDNA全长的酶切片断(1．27kb)，然后在DNA连接酶作用下将其与真核表达载体pcDNA3．1（－)连接，重组质粒经EcoR I和BamH I酶切予以鉴定。结果：RT—PCR产物自有VEGF-C cDNA，基因测序显示重组的pUMT—18中自有正确的人VEGF—C cDNA全长序列，重组的pcDNA3．1(-)中含有人VEGF—C cDNA全长序列。结论：VEGP—C/pcDNA3．1(－)。     

人脑膜瘤血管内皮细胞生长因子表达的临床意义

目的　探讨脑膜瘤血管内皮生长因子 (VEGF)基因表达与血管生成和脑水肿的关系。方法　应用免疫组织化学方法检测 3 5例脑膜瘤组织中VEGF基因表达 ;Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体组织化学染色显示微血管 ,用微血管记数 (MVC)测定血管生成 ;从脑水肿与肿瘤本身的体积之比估计脑水肿程度。结果　 3 5例脑膜瘤VEGF表达率 77% (2 7/3 5 ) ,4例可疑染色 ,其中恶性脑膜瘤和血管母细胞型脑膜瘤呈现高表达 (10 0 % ) ;VEGF表达与脑膜瘤血管生成 ,瘤周脑水肿呈显著正相关 (r =0 .682 3 ,P <0 .0 1;r =0 .765 3 ,P <0 .0 1)。结论　VEGF存在于脑膜瘤组织中 ,在脑膜瘤血管生成和瘤周水肿中发挥重要作用。     

Regulation of vascular endothelial growth factor on the expression of fracture healing,related factors

Objective ： To study the effect of vascular endothelial growth factor （VEGF）and anti-VEGF on the expression of fracture healing-related factors and observe pathological changes at fractured sites. Methods： Fracture models were established in 105 New Zealand white rabbits and they were randomly divided into control group, VEGF group and anti-VEGF group. The relevant factors expression at fractured sites was assayed and pathological changes were observed in decalcified samples at 8, 24, 72 hours and 1,3,5,8 weeks after fracture. Results： After application of VGEF, the expression of BMP appeared earlier and expression time lasted longer. On the contrary, anti-VEGF completely inhibited the expression of BMP. The fractured sites were filled with fibrous callus, cartilaginous callus and bony callus at the 3rd week and woven bone was constructed at the 5th week. Fracture healing was accomplished at the 8th week in VEGF group. In anti-VEGF polyclonal antibody group, cellular necrosis increased at early period. Continuous focal necrosis was seen in the fractured sites from the 1st week to 5th week. Vascularization reduced obviously at the 3rd week. Conclusions： Fracture healing is a result of mutual regulation and coordination among many factors. VEGF may be an important factor in fracture healing.     

血管内皮生长因子基因多态性与糖尿病肾病的相关性研究

目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)-634G／C基因多态性与糖尿病肾病(DN)的关系。方法 运用PCR-限制性多态性片段长度(RFLP)技术检测98例健康对照者和216例2型糖尿病患者[其中DN患者104例，单纯2型糖尿病(DM)患者112例]的基因型，比较各组的基因型和等位基因频率。结果 (1)CC基因型者血清VEGFT水平高于CG及GG型者；(2)DN组CC基因型和C等位基因频率显著高于DM组和正常对照组；(3)与GG型和CG型组相比，CC型组DN的发生率明显上升；(4)Logistic回归分析显示VEGF、VEGF基因多态性、收缩压(SBP)、HbA1c、LDL-C、体重指数(BMI)是DN的危险因素。结论 VEGF-63gG／C多态性与2型DM伴发肾病的发生有关，C等位基因可能是DN的易感基因。     

血管内皮生长因子基因治疗大鼠缺血皮瓣的实验研究

目的　研究血管内皮生长因子 (VEGF)基因治疗对大鼠缺血皮瓣生存的影响。方法建立大鼠缺血皮瓣的动物模型 ,采用直接注射法转移 pcD2 /hVEGF12 1真核表达质粒于大鼠缺血皮瓣肉膜层 ,术后 7d ,应用苏木素 伊红 (HE)染色、单光子发射计算机断层摄影 (SPECT)及计算机图像分析软件等方法检测皮下血管密度、皮瓣血供和皮瓣成活率。结果　经VEGF基因治疗组的大鼠缺血皮瓣与对照组相比较具有皮下血管密度增加、血液供应增多和皮瓣成活率显著性增高 (P <0 .0 1)。结论　VEGF基因治疗能够诱导新血管形成、增加血流灌注 ,促进缺血皮瓣的生存。     

pcDNA3.1(+)载体携带血管内皮生长因子治疗大鼠缺血皮瓣

目的 观察注射真核表达载体pcDNA3.1(+)携带血管内皮生长因子(VEGF)基因后对大鼠缺血皮瓣存活的影响.方法 构建重组质粒pcDNA3.1(+)-VEGF,将SD大鼠随机分成3组,每组10只.pcDNA3.1(+)-VEGF组:于背部皮肤皮下多点注射pcDNA3.1(+)-VEGF 30 μg/100μl;VEGF组:多点注射VEGF蛋白100 ng/100μl;生理盐水(NS)组:注射生理盐水100μl,注射2d后在其背部形成7 cm×3 cm的全厚随意型皮瓣,48 h后按原设计掀起皮瓣并原位缝合.术后10 d测量皮瓣的成活面积,计算成活面积百分比,并行免疫组织化学检测.结果 皮瓣成活面积百分比:pcDNA3.1(+)-VEGF组为(79.1±3.5)％,VEGF组为(62.2±2.7)％,NS组为(59.9±3.1)％,pcDNA3.1(+)-VEGF组皮瓣成活面积明显高于其他两组(P＜0.05).结论 皮下注射pcDNA3.1(+ )-VEGF可促进新生血管的形成,比单纯注射VEGF蛋白更能提高皮瓣的成活率.     

RhoC基因高表达对胃癌细胞血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子表达的影响

目的 探讨RhoC基因对胃癌细胞血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的影响及其意义。方法 常规脂质体转染法将RhoC基因重组质粒转染人胃癌细胞系SGC7901；应用免疫细胞化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶(SP)法检测胃癌细胞转染RhoC基因重组质粒前后VEGF、bFGF蛋白表达的变化。结果 转染RhoC基因重组质粒在SGC7901细胞中有稳定表达。转染RhoC基因重组质粒SGC7901表达VEGF、bFGF明显强于对照组。结论 体外条件下RhoC基因可促进胃癌细胞VEGF、bFGF的表达。这可能是RhoC基因促进胃癌细胞侵袭、转移的分子基础。RhoC基因的表达可望作为估计胃癌转移的参考指标。     

肝细胞肝癌中p53、ras基因与血管内皮生长因子表达的关系

目的 研究肝细胞肝癌中血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）的表达与ｐ５３,ｒａｓ基因之间的关系。方法 用免疫组织化学方法研究４５例肝癌标本ＶＥＧＦ,ｐ５３及ｒａｓ基因的表达。结果 ＶＥＧＦ的表达率为６４．４％（２９／４５）,ｐ５３的表达率为４８．９％（２２／４５）,ｒａｓ表达率为５３．３％（２４／４５）,经连续切片对比分析表明,在ＶＥＧＦ表达较高的区域,ｐ５３,ｒａｓ的表达亦较强,但Ｘ＾２检验仅提示ｐ５３