HIV-1包膜单基因Nest-PCR体系优化及包膜基因准种扩增

目的确定HIV-1包膜(envelope,env)单基因扩增(single genome amplification,SGA)的最优反应体系,获得env单基因扩增产物。方法采用SGA及Nest-PCR扩增HIV-1 env全长基因,并对Nest-PCR反应体系中各成分量进行优化;在此基础上,适当稀释HIV-1感染者cDNA模板进行Nest-PCR,以获得PCR扩增产物阳性率不超过30%的模板稀释度。结果 SGA Nest-PCR扩增HIV-1 env全长基因,引物浓度为0.3μmol/L,dNTP浓度为0.25μmol/L时可获得特异性高的env全长基因;凝胶回收纯化及稀释第一轮PCR产物可有效提高特异性条带的产量。采用优化反应体系成功从一名HIV-1感染者体内扩增出18株env单基因序列。结论优化了HIV-1 env基因SGA Nest-PCR的反应体系,并从HIV-1感染者获得了病毒包膜基因准种,为后续进行准种分析奠定了基础。     

链延伸反应提高压电基因传感器的灵敏度的实验研究

目的　利用链延伸反应的原理延长引物链以提高压电基因传感器表面的质量负载 ,从而提高传感器的灵敏度。方法　基因传感器阵列表面分别固定上金黄色葡萄球菌mecA及femA两种探针片段 ,待杂交上相应的靶序列片段后 ,加入Klenow酶 ,室温下 (2 0℃左右 )进行链延伸反应 8h。结果　 50nmol L单链mecA在杂交反应及链延伸反应的过程中 ,频率的下降值分别为 (99.2± 8.5)Hz、(1 92 .9± 1 3 .3 )Hz。而femA则分别下降了 (1 42 .4± 1 1 .2 )Hz、(2 2 2 .6± 1 6.6)Hz。mecA、femA在链延伸反应前的检测灵敏度为 0 .5nmol L ,但经链延伸反应后检测灵敏度提高到了 0 .0 5nmol L。结论　链延伸反应有效地提高了压电基因传感器的灵敏度 ,可用于微量DNA的检测、核酸同源性分析等方面     

大鼠心脏移植急性排斥反应期基因表达变化的研究

目的　研究同种异基因大鼠心脏移植急性排斥反应期相关基因表达的改变。方法　采用近交系Lewis和SD大鼠 ,分别建立Lewis(供体 )→SD(受体 )大鼠心脏移植模型为实验组 (n =2 4 ) ;Lewis→Lewis大鼠心脏移植模型为同期对照组 (n =2 4 )。术后 1、3、5d各时点分别处死 ,取移植心脏进行普通病理检查 ;应用基因芯片技术对术后5d移植心脏进行mRNA检测。结果　实验组移植心脏术后 3d开始发生急性排斥反应 ,术后 5d全部发生严重的急性排斥反应 ;而对照组未发生急性排斥反应。共发现差异表达基因总数为 2 1 0条 (下调 96条 ,上调 1 1 4条 ) ;其中已知基因有 33条 (下调 1 3条 ,上调 2 0条 ) ;未知基因 1 77条 (下调 83条 ,上调 94条 )。结论　心脏移植急性排斥反应涉及多基因表达改变 ,分析差异表达的基因 ,有助于进一步了解心脏移植急性排斥反应的发生机制。     

C反应蛋白基因单核苷酸多态性与脓毒症易感性及严重程度的关系

<正>脓毒症是一种由感染引起的危及生命的系统性炎症反应综合征~([1])。炎症反应的程度与脓毒症的预后密切相关。C反应蛋白(CRP)是脓毒症的重要生物标志物,可反映炎症反应和败血症的严重程度~([2-3])。CRP基因的遗传变异在血管损伤中发挥作用,而血管损伤可能是脓毒症引起的微血管功能障碍的基础~([4-5])。然而,CRP基因多态性与脓毒症易感性和严重程度的相关性尚不明确。基于此,本研究探讨CRP基因rs1205位点和rs3093062位点与脓毒症的易感性和严重程度之间的关系,报道如下。     

1例接种重组乙肝疫苗局部反应的报告

<正>重组(酵母)乙型肝炎疫苗是一种基因重组型疫苗,是通过对酵母的基因进行改造,使酵母表达出与乙肝病毒外形相似的蛋白,由于蛋白内不具备病毒的基因,接种后可刺激免疫系统产生保护性抗体。正常人接种乙肝疫苗是非常安全的,但极个别受种者接种后可能出现异常反应。现将2013年7月观察到的1     

含有成对皮质酮激素反应元件的基因在小鼠组织内的表达分析与验证

目的验证基于生物信息学的方法发现含有成对皮质酮激素反应元件(GREs)的皮质酮激素作用新基因。方法应用程序"NURD-finder2",从小鼠36 000个基因中筛选出含有成对GREs的88个基因,并选取了10个基因进行动物体内实验来验证。对小鼠(C57BL/6)的14种不同组织进行33P末端标记的原位杂交,用Image J软件分析。结果 10个所检测基因至少在一种组织中表达,而且发现脾脏对皮质酮激素急性应激有强反应;6个所测基因的mRNA水平在激素处理后有显著提高(P<0.05),其中质膜微囊蛋白家族-1(caveolin-1)在肺部有明显上调(P<0.05),生理上具有较强反应,其GRE序列与大鼠和人类的cav-1基因有较高同源性。结论验证了"NURD-finder2"发现新的含有成对GREs的皮质酮激素反应基因,这些基因具有组织特异性,可能在生理平衡的过程中具有重要作用。     

屋尘螨变应原Der p9基因的克隆表达、纯化及反应原性鉴定

目的克隆表达及纯化屋尘螨第九组变应原(Der p9)蛋白,并鉴定其反应原性。方法提取屋尘螨总RNA,通过RT-PCR克隆Der P9基因,并连接到pET-32a表达载体上,得到的重组质粒pET-32a-Der p9转化至E.Coli BL21(DE3),用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过镍离子亲和层析纯化目的蛋白;通过Western blotting等方法检测Der p9重组蛋白的反应原性。结果 Der p9基因片段大小约为850 bp,其基因片段与Gen Bank公布的Der p9基因(登录号为AAP57077.1)同源性为81.94%;重组Der p9在BL21(DE3)中可高效表达,分子质量约为47 k Da,表达后的重组蛋白主要以包涵体的形式存在。Der p9重组蛋白与屋尘螨过敏患者血清呈阳性反应,具有反应原性。结论成功克隆并表达出Der p9,通过纯化获得较强反应原性的Der p9重组蛋白,为尘螨过敏性疾病诊断及免疫治疗奠定理论基础。     

从基因敲除小鼠心肌组织中筛选热休克反应中受HSF1调控的靶基因

目的：用cDNA芯片从热休克转录因子1（HSF1）基因敲除小鼠心肌组织中筛选热休克反应受HSF1调控的靶基因。方法：用cDNA芯片检测热休克反应（42℃ 15 min,恢复3 h）中HSF1 / 小鼠心肌组织基因表达谱的改变(以HSF1+/+小鼠为对照);用RT PCR对cDNA芯片筛选结果进行验证;对差异表达的已命名基因进行启动子区转录因子结合位点的分析。结果：共筛选到差异表达基因1 142个;其中在HSF1 / 小鼠心肌中表达下调的基因为398个,已命名基因为173个;在HSF1 / 小鼠心肌中表达上调的基因为641个,已命名基因为235个。在HSF1 / 小鼠心肌中表达下调2.5倍的已命名基因中,有5个基因启动子区含有热休克元件（HSE）;在HSF1 / 小鼠心肌中表达上调2.5倍的已命名基因中,有6个基因启动子区含有HSE。结论：在热休克反应中,HSF1可对多个基因的表达进行直接或间接的调控。     

阴道毛滴虫肌动蛋白cDNA克隆与表达

目的克隆阴道毛滴虫肌动蛋白基因片段,表达及纯化肌动蛋白重组蛋白,免疫豚鼠获得抗血清,为进一步研究肌动蛋白在阴道毛滴虫体内定位及其在细胞衰老过程中的作用奠定基础。方法应用PCR方法获得阴道毛滴虫肌动蛋白基因部分片段,并克隆入表达载体pET-41a,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21,IPTG诱导重组质粒表达,亲和层析纯化表达产物,Brandford法测定重组蛋白含量并免疫豚鼠,用SDS-PAGE和Western-blot进行分析鉴定。结果肌动蛋白基因的PCR产物片段大小500bp;构建了阴道毛滴虫肌动蛋白基因重组表达质粒;表达了肌动蛋白重组蛋白;SDS-PAGE显示分离纯化的肌动蛋白重组蛋白为47000u;Western-blot结果表明所获得抗血清可与肌动蛋白重组蛋白在47000u及阴道毛滴虫总蛋白在41000u处特异性反应。结论重组肌动蛋白获得高效表达,其免疫豚鼠获得的抗血清可与阴道毛滴虫肌动蛋白重组蛋白反应,也可识别阴道毛滴虫虫体肌动蛋白,该抗血清可用于进一步的研究。     

细胞凋亡的线粒体通路

对细胞死亡的研究可以追溯到一个多世纪以前.但是直到最近一二十年,人们才认识到:细胞死亡是一个主动过程,是细胞外界环境因素与细胞自身综合作用的结果;正如细胞有丝分裂一样,该过程的启动和进行受到基因的精确调控;细胞死亡源于这些基因产物的相互作用. 根据起源、性质和生物学意义可将细胞死亡分为两种不同的类型,即凋亡(apoptosis)或称程序性细胞死亡(programmed cell death)和坏死(necrosis).前者是一种受基因调节的自主控制过程,在生物个体发育和生存中起着非常重要的作用;而坏死则是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡.在体内,两者最大的区别是前者不能引起机体炎症反应,而后者则可引起炎症反应.因此在生理和绝大多数病理条件下的细胞死亡都呈现凋亡或程序性细胞死亡的典型特征.     

大鼠肝移植术后一氧化氮和白细胞介素2的变化

目的 :探讨一氧化氮 ( NO)在 BN至 Lew大鼠异种原位肝移植急性排斥反应中的价值。方法 :应用 BN至 Lew近交系大鼠异种原位肝移植急性排斥反应及同基因 ( Lew- Lew)肝移植动物模型 ,检测肝移植术后血浆 NO和白细胞介素 2 ( IL- 2 )的变化。结果 :大鼠异种原位肝移植急性排斥反应时血浆 NO含量明显升高 ,且变化早于 IL - 2 ;FK5 0 6显著抑制 NO的合成 ,氨基胍减轻排斥反应的程度 ;同基因组 NO不升高。结论 :NO可作为大鼠肝移植急性排斥反应的诊断指标     

T细胞分化群40补体免疫球蛋白基因修饰骨髓间充质干细胞在肝移植排斥反应中的作用

目的探讨T细胞分化群40补体免疫球蛋白(CD40LIg)基因修饰骨髓间充质干细胞(MSCs)肝移植排斥反应中的作用。方法采用双袖套法建立DA-Lewis大鼠原位肝移植模型,经门静脉输注CD40LIg基因转染的MSCs,观察大鼠肝移植术后肝功能的变化、生存情况和移植肝病理形态学的改变,检测肝移植大鼠干扰素(INF-γ)和白细胞介素4(IL-2)水平的变化。结果(1)基因转染MSCs组生存时间显著长于对照组、单纯MSCs组和基因转染组,而单纯MSCs组和基因转染组又较对照组显著延长(P<0.05)。(2)对照组谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBil)、IL-2和INF-γ水平在肝移植术后急剧升高,各时段均显著高于3个治疗组(P<0.05);(3)肝脏组织病理检查,对照组呈重度排斥反应,单纯MSCs组和基因转染组为轻度排斥反应,而基因转染MSCs组无明显排斥反应。结论 CD40LIg基因修饰MSCs可以延长肝移植大鼠的存活时间,抑制大鼠肝移植的排斥反应。     

mdr-1基因骨髓造血干细胞移植诱导大鼠肝移植免疫耐受

目的 探讨mdr-1基因骨髓造血干细胞移植诱导肝移植术后免疫耐受的可行性及其可能机制.方法 选用雄性Wistar大鼠30只为肝移植供体,另选雌性SD大鼠20只为异基因肝移植受体,随机分为mdr-1基因骨髓造血干细胞移植联合肝移植组(A组)和单纯肝移植组(B组).雌性Wistar大鼠10只为同基因肝移植受体(C组).比较A、B两组大鼠肝移植术后1周生存率、生存状况、生存时间,以及移植肝脏的病理变化.结果 C组大鼠生存时间均达60 d以上,A组为(31.2±4.9)d,明显高于B组[(12.1±4.7)d],差异有统计学意义(P<0.05).B组病理组织切片可见中、重度急性排斥反应,肝内单核细胞浸润较为明显,主要集中在汇管区;A组移植肝内组织损伤程度明显减轻;C组基本无排斥反应,接近正常肝组织.结论 mdr-1基因骨髓造血干细胞可明显减轻大鼠肝移植后免疫排斥反应.     

异基因大鼠小肠移植选择素的表达与急性排斥反应的相关性

目的: 建立大鼠异位全小肠移植的急性排斥反应动物模型,分析急性排斥反应过程中选择素的表达变化及其在排斥反应中的意义.方法: 选用近交系Wistar/A和F344/N大鼠建立全小肠移植模型.实验共分4组,每组供受体各18只:第1组非手术对照组(F344/N);第2组同基因移植组 (F344/N→F344/N);第3组异基因移植组(F344/N→Wistar/A);第4组异基因移植治疗组(F344/N→Wistar/A FK506).每组分别于术后第3,5,7日处死,在无菌条件下取移植肠行常规HE染色,观察组织学变化;免疫组织化学染色测组织中选择素的表达,同时检测移植肠中选择素mRNA表达的变化.结果: 异基因大鼠异位全小肠移植术后3,5,7 d可出现典型的轻、中、重度排斥反应,而同基因组及异基因移植治疗组中未出现排斥反应. P-选择素在异基因移植术后早期显著升高,但随着排斥反应的加重,持续升高不明显,而E、L-选择素随着排斥反应的加重而持续升高,而同基因移植及治疗组选择素的升高不明显,且治疗组略低于同基因移植组.结论: 早期肠黏膜中P-选择素的表达对急性排斥反应的早期诊断及治疗有一定意义.     

基因治疗与移植免疫耐受的研究进展

基因治疗是未来治愈各种临床疾病的希望所在。目前,通过基因治疗手段诱导移植耐受成为移植免疫研究的热点。离体灌注途径可对移植物进行靶向性基因转导,洗脱多余的载体可降低其毒性和免疫原性。利用抗排斥反应基因(如免疫抑制性细胞因子或阻断协同刺激信号)或反义核酸阻断与排斥反应相关的分子(如粘附分子)等,能有效防止急、慢性排斥反应的发生。介导同种抗原(如MHC-Ⅰ、Ⅱ等)的基因治疗也是诱导产生供体特异性无反应的有效手段,可避免系统性免疫抑制及药物毒性或相关并发症的发生。     

利用线性指数PCR-焦磷酸测序技术快速检测3种海洋弧菌

目的： 建立一种基于线性指数聚合酶链式反应(linear-after-the-exponential PCR,LATE-PCR)焦磷酸测序技术快速检测致病性海洋弧菌的方法。方法： 首先根据海洋弧菌的16S rRNA基因和外膜蛋白K(OmpK)基因的目的片段设计引物并优化反应条件进行LATE-PCR扩增,其次利用酶促反应处理PCR产物中干扰焦磷酸测序反应的副产物,最后加入退火引物后直接进行焦磷酸测序。结果： 成功进行了LATE-PCR扩增,制备出足量单链DNA模板供焦磷酸测序反应;取1~2 μL的PCR产物即可获得理想的焦磷酸测序信号。测序结果与Sanger法的结果一致,测得序列与GenBank所报道的相符合。通过对16S rRNA基因片段的检测,可以确认样品是否为海洋弧菌;通过对OmpK基因目的片段的检测可以初步区分弧菌种类,对3种常见弧菌：副溶血弧菌、哈维弧菌和溶藻弧菌成功地进行了检测。结论： 本方法结果准确,灵敏度高,操作简便且成本低,可快速检测大量样品,在弧菌快速检测和诊断中具有很好的应用前景。     

环氧合酶-2与肝脏疾病

1 环氧合酶-2概述 环氧合酶又称前列腺素合酶(PGS),COX具有催化花生四烯酸(AA)生成各种前列腺素、血栓素和前列环素的功能.近年来的研究证实,COX存在稳定表达型环氧合酶I(COX-1)和可诱导型环氧合酶Ⅱ(COX-2)两种异构酶.甚至有人推测可能存在环氧合酶Ⅲ[1].运用基因克隆技术发现COX-2基因与COX-1基因明显不同,COX-1基因启动子不含众多增强子元件,可诱导性弱,被归类为"看家基因".而COX-2基因的启动子则含有许多与转录有关的功能序列,如cAMP反应元件(CER)等,因此,COX-2可被多种刺激因子诱导.大量研究显示:COX-2不仅是启动炎症反应的关键酶,还参与多种肿瘤的发生和发展.     

色氨酸羟化酶2基因多态性与重症抑郁发作和治疗反应的关系分析

目的 分析中国汉族人群中色氨酸羟化酶2(TPH-2)基因单核苷酸多态性(SNP)rs4570625 和rs7305115位点与重症抑郁发作(MDD)和抗抑郁药物治疗反应的关系.方法 设立病例组(汉族MDD患者,n=346)和对照组(汉族正常人,n=347);根据对治疗的反应,病例组患者再分为难治性抑郁症组(TRD组,n=72)和非TRD组(NTRD组,n=274).通过Taqman探针SNP基因分型技术对TPH-2基因的 rs4570625和rs7305115位点进行基因分型,分析等位基因和基因型频率在各组间的分布差异.结果 病例组TPH-2基因rs4570625位点的基因型及等位基因分布的频率与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).按性别分层后,男性TRD组与男性NTRD组SNPs rs4570625和rs7305115位点的基因型和等位基因分布频率比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 TPH-2基因rs4570625位点可能与抑郁症的发病有关;男性患者rs4570625和rs7305115位点的多态可能可用于预测对治疗的反应.     

胃腺癌核仁组成区的形态学定量观察

<正> 核仁组成区(nucleolar organi er region,简称NOR)是位于某些染色体上特殊部位的核糖体基因(rDNA),通过其转录而形成核糖体,在蛋白质合成中起着极其重要的作用。 NOR可用银染色方法显示。银与rDNA相关的酸性非组蛋白结合,这种蛋白称为核仁组成区嗜银蛋白(简称Ag—NOR)。因此,Ag—NOR可作为NOR及其rDNA转录活动的标志,可用来反应     

GSTT1?GSTM1基因多态性与儿童急性淋巴细胞白血病早期治疗反应及化疗不良反应的关系

目的:研究谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)家族中GSTT1?GSTM1基因多态性与儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)早期治疗反应和化疗不良反应的关系?方法:筛选ALL患者98例,采用多重PCR技术分析GSTT1?GSTM1基因型,比较不同基因型患者早期治疗反应和发生化疗毒副作用的差异?结果:GSTT1基因缺失型患者早期治疗反应较GSTT1基因非缺失型患者好(OR=3.35,95%CI:1.05~10.73,P=0.041),GSTT1和GSTM1基因双非缺失型患者发生早期治疗反应差的风险明显高于GSTT1和GSTM1任一基因缺失型及双缺失型(OR=5.73,95%CI:1.73~18.95,P=0.004)?GSTM1基因缺失型患者发生口腔黏膜炎?肝功能异常及感染的风险高于GSTM1基因非缺失型患者(P < 0.05),GSTT1和GSTM1基因双缺失型患者发生肝功能异常及感染的风险明显高于两基因非双缺失型患者(P < 0.05)?结论:GSTT1和GSTM1基因型与ALL患者早期治疗反应及化疗不良反应发生率相关,GSTT1和GSTM1基因型有助于指导ALL患者个体化治疗方案的制定?