人红细胞冰冻干燥保存研究的进展

目前红细胞临床保存方法主要有低温（4℃）和深低温（-80℃或-196℃）保存。4℃保存时间短，而且容易受到细菌污染；深低温保存大大延长了红细胞保存时间，但需要笨重的低温设备，而且由于保护液中含有甘油等渗透性保护剂，解冻后需要反复洗涤。这些缺陷限制了常规红细胞保存方法在一些特殊情况，例如在战争和自然灾害条件下的应用。相对于常规保存方法而言，冰冻干燥具有以下优势：重量大大减轻，便于运输，适合室温保存。易于再水化。本文就冰冻干燥保存红细胞研究的进展和所面临的挑战，尤其是最近海藻糖在冰冻干燥保存过程中的应用以及其作用机制进行了综合讨论，从而为发展一种安全、简单和有效的红细胞冰冻干燥保存方法提出理论指导。     

海藻糖和蔗糖在人红细胞冰冻干燥保存中的效果比较

目的 比较海藻糖和蔗糖在人红细胞冰冻干燥保存过程中对细胞的保护效果。方法 将浓缩红细胞、含有不同浓度海藻糖或蔗糖的30％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)按照1:3(V/V)的比例混合,-80℃冰箱中预冻1h,入冻干机内冻千处理后,用37℃等渗缓冲液快速水化洗涤样品,然后将其分为3个处理组:组1为30％PVP组(简称PVP组),组2、3为含有5％、10％和15％海藻糖或蔗糖的30％PVP组(简称海藻糖组或蔗糖组),测定各项指标。结果 冻干红细胞再水化后,海藻糖组的细胞回收率[(18.86±4.63)％、(21.73±7.32)％和(18.01±4.53)％]显著低于PVP组[(45.97±11.77)％](P<0.01);蔗糖组,蔗糖浓度为5％、10％时,细胞回收率分别为(37.40±2.90)％和(37.77±4.78)％,二者显著低于PVP组(P<0.05),但当蔗糖浓度升至15％时,细胞回收率[(42.54±10.25)％]和PVP组无显著差异;血红蛋白回收率,海藻糖组[(50.00±3.47)％、(40.91±9.09)％和(52.09±7.01)％]显著低于PVP组[(77.27±3.63)％](P<0.05),而蔗糖组和PVP组无显著差异,且显著高于海藻糖组(P<0.05)。洗涤后3组的游离血红蛋白浓度均<1g/L,其余各项指标的对比关系类似于水化后指标。结论 在冻干保护液中添加不同浓度的海藻糖或蔗糖对于提高冰冻干燥保存后红细胞的回收率和血红蛋白浓度作用不明显;但     

海藻糖、蔗糖、葡萄糖负载红细胞对冻干红细胞影响的比较

目的探讨细胞内的海藻糖、蔗糖、葡萄糖对冻干红细胞的影响。方法以海藻糖、蔗糖、葡萄糖、PBS作负载液,将红细胞置各负载液中孵育37℃、7h,然后冻干红细胞。再水化后测定血红蛋白回收率及红细胞内ATP含量,评价海藻糖、蔗糖、葡萄糖对冻干红细胞的影响。结果冻干后血红蛋白回收率:负载海藻糖、蔗糖及葡萄糖的红细胞明显高于PBS负载红细胞(P<0.001),海藻糖与蔗糖负载明显优于葡萄糖负载(P<0.001),海藻糖与蔗糖负载的红细胞无明显差异(P>0.05)。冻干后细胞内ATP含量:葡萄糖负载红细胞明显高于海藻糖及蔗糖负载红细胞(P<0.001),负载海藻糖高于负载蔗糖(P<0.05)。可认为负载海藻糖、蔗糖及葡萄糖的红细胞冻干后,细胞内的ATP水平葡萄糖组最高,海藻糖组其次,蔗糖组最低。结论细胞内的海藻糖、蔗糖、葡萄糖对冻干红细胞均有保护作用,综合血红蛋白回收率及红细胞内ATP含量,海藻糖较蔗糖及葡萄糖保护作用更好。     

再水化液因素对冰冻干燥保存后红细胞回收率的影响

目的　寻求一种能有效提高冰冻干燥 (简称冻干 )保存后人红细胞回收率的再水化体系。方法　测定1 0 %聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、6 %羟乙淀粉 (HES)、5 %羧甲基淀粉钠 (CMS)、生理盐水、0 75mol/L葡萄糖、等渗缓冲液及高渗缓冲液 (5×Buffer)的晶体渗透压和胶体渗透压 ;将浓缩红细胞和保护液混匀 ,预冻后移入冻干机内作冻干处理 ,冻干完毕后 ,用不同种类或不同温度的再水化液快速水化洗涤样本。结果　人红细胞冻干再水化后 ,6 %HES组、1 0 %PVP组和 5 %CMS组的红细胞回收率分别为 (93.6 5± 6 .1 8) %、(88.80± 9.4 9) %和 (91 .34± 8.1 3) % ,血红蛋白回收率分别为 (93.4 8± 4 .6 7) %、(89.0 2± 4 .6 7) %和 (88.79± 5 .35 ) % ,均极显著高于其他 4组[(1 5 .5 6± 1 2 .0 2 ) %～ (2 7.77± 6 .4 8) % ,(1 7.78± 1 0 .80 ) %～ (4 1 .5 0± 6 .4 3) % ) ](P <0 .0 1 ) ;不同温度的 6 %HES的再水化效果表明 ,再水化后 3个温度组的红细胞回收率无显著差异 ,但 37℃和 2 5℃组的血红蛋白回收率分别为(87.4 8± 5 .84 ) %和 (91 .37± 3.94 ) % ,均极显著高于 4℃组 (73.1 0± 5 .90 ) % (P <0 .0 1 )而且上清游离血红蛋白浓度也显著低于 4℃组。结论　再水化液的胶体渗透压对冻干保存后红细胞的保护作     

人红细胞冻干保护剂的研究进展

冷冻干燥法是实现红细胞长期保存的方法之一,要实现冻干,首要解决的问题是维持细胞膜的完整性和功能。低温和干燥是对膜产生损伤的主要因素,通过添加保护剂,优化降温速率及冻干程序、复水方法等,可以缓解冻干过程对膜的损伤。其中冻干保护剂的作用是保持细胞膜结构和减少渗透性损伤,其构成主要为碳水化合物(糖类)、聚合物、蛋白类和其他一些成分。本文对目前常用的冻干保护剂的种类、作用机制、研究进展和存在的问题,进行了分析和总结,并对未来研究及发展方向进行了展望。     

冰冻干燥红细胞超微结构的分析

本研究的目的是探讨冰冻干燥红细胞在电镜下的形态变化。全血采自健康献血者 ,实验分为 3组。组 1:新鲜红细胞 ,4℃保存不超过 2 4小时 ;组 2 :红细胞中加入终浓度为 35 %的甘油 ,- 80℃保存 2 4小时 ;组 3:红细胞经过预处理 ,冰冻干燥 16小时。对解冻红细胞或水化重悬冰冻干燥的红细胞进行计数 ,电镜下观察 3组红细胞超微结构 ,并对电镜下红细胞平均直径、平均光密度及积分光密度进行图像分析。平均光密度及积分光密度代表细胞内血红蛋白的相对含量。结果表明 ,冰冻干燥后红细胞回收率为 5 3% ,红细胞具有圆盘状的结构。组 1红细胞平均直径(μm)、平均光密度及积分光密度分别为 4 .7± 0 .4 ,0 .14± 0 .0 2 ,1.5 8± 0 .4 6 ;组 2红细胞平均直径 (μm)、平均光密度及积分光密度分别为 4 .6± 0 .7,0 .14± 0 .0 2 ,2 .35± 0 .6 4 ;组 3红细胞平均直径 (μm)、平均光密度及积分光密度分别为 4 .4± 0 .4 ,0 .17± 0 .0 5和 2 .35± 0 .4 6。对电镜下红细胞平均直径、平均光密度及积分光密度数据进行统计学处理 ,三元方差分析的Wilks′Lambda检验显示 ,组 3与组 2之间无显著差异 ,组 3与组 1相比较差异显著。结论 :冰冻干燥红细胞具有相对完整的超微结构 ,平均直径及血红蛋白的含量与冰冻保存红细胞相     

海藻糖和葡萄糖联合负载红细胞的效果评价

目的探讨海藻糖和葡萄糖联合负载红细胞的效果,为冷冻干燥红细胞提供新的保存剂。方法分别采用0、0．125、0．25、0．5和1mol／L的海藻糖、葡萄糖以及海藻糖联合葡萄糖37℃负载红细胞6h。分别检测负载后红细胞内海藻糖和葡萄糖的浓度。结果负载液中糖类浓度为0．125、0．25和0．5mol／L时,联合负载组与海藻糖或葡萄糖组负载后红细胞内的海藻糖和葡萄糖浓度的差异无统计学意义（P〉0．05）。而负载液糖类浓度达到1mol／L时,联合负载组红细胞内海藻糖和葡萄糖的浓度明显低于海藻糖和葡萄糖单独负载组,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论浓度小于1mol／L时,海藻糖联合葡萄糖负载红细胞并不影响海藻糖和葡萄糖进入红细胞内,可以满足红细胞冷冻干燥的要求。     

人红细胞冻干前负载海藻糖最佳化研究

为更好的实现海藻糖在红细胞冻干保存中的保护作用,关键是克服质膜对海藻糖的非渗透性,使胞质内海藻糖达到有效浓度。本研究的目的是通过对人红细胞负载海藻糖的规律性研究,筛选出海藻糖负载的最佳负载条件并评价海藻糖负载对红细胞各项理化指标的影响。在不同孵育温度(4、22和37℃)、孵育时间(0、2、4、6、8、10小时)、不同负载缓冲液浓度(0、200、400、600、800、1000mmol/L)条件下检测新鲜红细胞对海藻糖的成功负载量及红细胞各项理化指标;在固定负载条件下,对新鲜红细胞和4℃保存72小时红细胞海藻糖负载、游离血红蛋白(FHb)、血红蛋白(Hb)和红细胞平均体积(MCV)进行了比较。结果表明:红细胞对海藻糖的负载与孵育温度、时间及负载缓冲液海藻糖浓度密切相关。随着温度的升高、时间的延长和负载缓冲液海藻糖浓度的增加,红细胞对海藻糖的摄取量也随之增加。在海藻糖负载最佳条件下,新鲜红细胞和4℃保存72小时红细胞的胞内海藻糖浓度、FHb浓度分别为65.505±6.314mmol/L、66.2±5.002mmol/L和6.567±2.568g/L、16.168±3.922g/L。结论:红细胞负载海藻糖的最佳条件是采用新鲜红细胞,在37℃条件下、海藻糖浓度为800mmol/L的负载缓冲液中孵育8小时,这一条件可使胞内海藻糖达到有效浓度,并保持红细胞细胞理化性质稳定和膜完整性。     

苯甲醇对红细胞冻干前海藻糖负载红细胞影响研究

为研究苯甲醇对海藻糖负载红细胞的影响,在4℃条件下将红细胞孵育在浓度分别为10、30、50、100mmol/L的苯甲醇-海藻糖溶液中24小时,用氰化血红蛋白试剂盒测定海藻糖负载红细胞的溶血率,用硫酸-蒽酮法检测红细胞内海藻糖浓度水平。结果表明：在100mmol/L苯甲醇-海藻糖溶液组,其红细胞内海藻糖浓度为72±12.98mmol/L,与其它各组相比,有显著统计学差异（p=0.000）;溶血率为17.99±3.75%,与其它各组相比,有显著统计学差异（p=0.000）。结论：苯甲醇可提高海藻糖负载红细胞的负载率,随着苯甲醇浓度的升高红细胞海藻糖负载率也提高,100mmol/L的苯甲醇浓度为可用浓度。     

人红细胞冻干后复水条件的初步研究

本研究旨在探讨不同复水条件对冻干红细胞回收率的影响，为冻干红细胞复水条件的优化提供实验依据。在一系列不同条件下，包括复水溶液、复水温度、复水阶段红细胞胞体积变化速率（即蒸汽预复水）等，对冻干红细胞进行复水，检测红细胞复水后回收率并检测冻干红细胞复水后各项理化功能的改变。结果显示：在复水液配方中以PBS为基液配制的10％（w／v）PVP40溶液效果较好。在复水温度方面，低于37℃时红细胞回收率随着温度的升高而增加，42℃比37℃略差，37℃下复水效果最好。在加入复水液之前将样品放置在37℃的饱和蒸汽环境中预复水能提高红细胞回收率并使细胞体积和体积分布宽度更接近于新鲜细胞数值。复水后红细胞理化性质的检测显示，红细胞的变形性较常规保存的红细胞有所下降，但胞内ATP酶、G-6-PD酶、SOD和2，3-DPG的活性降低较少，酶活性回收率大于红细胞回收率。结论：人红细胞冻干后最佳的复水条件是：冻干红细胞在37℃的饱和蒸汽环境中预复水，复水液为PBS＋10％PVP40，复水温度为37℃，但对冻干复水过程中的细胞膜的保护还需进行更深入的研究。     

生物膜的保护剂海藻糖在冻干红细胞中的应用

海藻糖作为一种稳定的非还原性双糖，在细胞冷冻、干燥、冻干过程中对细胞活性有着良好的保护作用并已广泛应用于人血细胞的冻干．海藻糖以其异常的水合能力、独特的玻璃化转换和晶体转变行为及抗高温潮湿的特性受到密切关注，并成为细胞保存研究中首选的一种保护剂。海藻糖对细胞的保护机制、海藻糖导入哺乳细胞的实验方法以及红细胞对海藻糖负载的可能作用机制部是近几年细胞保存研究的热点，本文就以上几方面的进展详细进行论述.     

保护液的玻璃化状态对红细胞冷冻干燥保存后回收率的影响

为了研究保护液的玻璃化状态对红细胞冷冻干燥 (简称冻干 )保存后回收率的影响 ,采用含有 7%二甲亚砜 (v/v)和 2 0 %、30 %、4 0 %或 5 0 %聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) (w/v)的缓冲液作为保护液进行保护液的玻璃化测试和红细胞的冻干保存实验。首先检测溶液的玻璃化状态 ,如果冷冻和解冻过程中任一过程出现白色冰晶即为非玻璃化溶液 ;再将浓集红细胞和不同的保护液按比例混匀 ,预冻后移入冻干机内进行冻干处理 ;冻干完毕后 ,快速水化样品 ,测定红细胞回收率、血红蛋白回收率和上清游离血红蛋白浓度 ,然后对冻干后红细胞形态进行电镜观察。结果表明 :2 0 %PVP +7%DMSO和 30 %PVP +7%DMSO在冷冻和解冻过程中都出现白色冰晶 ;4 0 %PVP +7%DMSO在冷冻过程中无冰晶出现 ,但在解冻过程中出现冰晶 ;而 5 0 %PVP +7%DMSO在冷冻和解冻过程中均无冰晶出现。冻干红细胞再水化后 ,4 0 %PVP +7%DMSO的细胞回收率和血红蛋白回收率分别为 (81.36±14 94 ) %和 (77.5 4± 12 .86 ) % ,显著高于其它 3组 (P <0 .0 1) ;另外 4 0 %PVP +7%DMSO的上清游离血红蛋白浓度也显著低于其它 3组 (P <0 .0 1)。研究表明 :随着溶液中PVP浓度的升高 ,溶液的玻璃化程度也随之增加 ,同时冻干 再水化后红细胞的各项指标也随之改善 ,当溶液中PV     

海藻糖负载红细胞及其冻干保存研究

为了研究海藻糖负载红细胞方法的可行性及红细胞内海藻糖对冻干红细胞的影响,利用红细胞膜在37℃时细胞膜上部分脂质由固态变为液态、流动性增大和膜通透性增加的性质,将红细胞置于高浓度海藻糖负载液中孵育7小时,并以磷酸缓冲盐溶液中孵育的红细胞作为对照,对红细胞的海藻糖负载率、形态学、渗透脆性、变形性、ATP含量及2,3-DPG含量进行评价。结果表明:负载后红细胞内海藻糖含量为36.56±7.95mmol/L,实验组红细胞溶血率为(15.663±3.848)%,对照组红细胞溶血率为(5.03±1.85)%,差异显著(P<0.05);实验组红细胞变形指数是0.0289±0.00738,对照组红细胞变形指数是0.1200±0.0121,差异显著(P<0.05);负载后实验组红细胞内ATP含量为2.67±0.54μmol/gHb,对照组红细胞内ATP含量为5.22±1.10μmol/gHb(P>0.05),实验组红细胞渗透脆性降低,明显低于对照组。尽管负载组的红细胞大小不一,形态各异,但在透射电镜下绝大多数红细胞膜完整,胞内血红蛋白密度均匀,而对照组有近一半的细胞膜不完整并有漏孔,胞内血红蛋白密度变浅。实验组与对照组中2,3-DPG含量均为零。实验组红细胞冻干再水化后,血红蛋白回收率46.44±4.14%,对照组血红蛋白回收率8.33±2.34%,差异显著(P<0.001)。结论:海藻糖负载的红细胞功能符合输注标准,负载方法可行,负载入细胞内的海藻糖能够保持细胞膜的完整性,大大提高了冻干红细胞的回收率,为红细胞的冷冻干燥成功迈出了第一步。     

海藻糖用于血细胞冻干保存中的研究进展

冰冻干燥方法是保存血细胞最佳的方法，因为冻干的血细胞制品能在常温下保存，性能稳定，保存时间长．便于运输，保存费用低廉等优势，解决了目前血细胞保存的局限性。然而，在冻干过程中血细胞膜的损伤、细胞功能的降低是一个重要的问题。目前，研究者多以海藻糖为保护剂，将海藻糖导入血细胞内，对血细胞进行冻干。本文主要综述冻干对血细胞损伤机理，海藻糖对血细胞冻干过程中的保护机制及海藻糖在血细胞冻干保存中的研究现状。     

人红细胞冻干保护剂配方及浓度的优化

本研究探讨不同红细胞冻干保护剂配方及浓度的变化对红细胞冻干-复水后回收率的影响。应用一系列不同浓度的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、海藻糖及不同渗透性保护剂组成的红细胞冻干保护剂保护冻干红细胞并检测冻干红细胞复冰后红细胞及血红蛋白的回收率．结果显示：荷载海藻糖的红细胞在添加不同浓度保护剂保护下各组的红细胞损失率差异具有显著性（P〈0．05或P〈0．01），其中以有PVP360的保护液组中的细胞损失最大（0．24％），含有PVP40且胞外海藻糖浓度为150mmol／L时，红细胞的损失最小（0．02％）．海藻糖浓度为150mmol／L与海藻糖浓度为50mmol／L的保护剂组之间存在统计学差异（P〈0．01）。冻干红细胞在添加不同PVP40浓度的冻干保护剂作用再水化后红细胞和血红蛋白回收率也不相同。15％PVP40＋150mmol／L海藻糖＋2％BSA在红细胞冻干中的保护效果最好，红细胞和血红蛋白回收率分别为（61．29±4．93）％，（62．49±5．91）％，与其它各组间存在显著差异（P〈0．01）。含有甘油的冻干保护液对红细胞冻干过程中的保护效果最好，红细胞和血红蛋白回收率分别为（65．97±4．52）％和（67．24±5．94）％，与其它渗透性保护剂组相比存在显著性差异（P〈0．01）。结论：红细胞冻干保护剂为0．8mol／L甘油＋15％PVP40＋150mmol／L海藻糖＋2％BSA是最佳保护剂浓度配方。