汉防己甲素联合屈洛昔芬对K562和K562/A02细胞NF-κB蛋白表达的影响

目的 研究汉防己甲素(Tet)和屈洛昔芬(DRL)单独及联合用药后对K562细胞及其耐药细胞株K562/A02的核因子κB(NF-κB)表达的影响,以进一步探讨其逆转多药耐药的作用机制.方法 采用免疫细胞化学及Western blotting法分别检测Tet(1μmol/L)、DRL(5 μmol/L)单独及联合作用于K562和K562/A02细胞后NF-κB核转位水平和胞核NF-κB蛋白表达水平的变化.结果①K562/A02细胞NF-κB核转位水平[(65.0±4.2)%]及胞核NF-κB蛋白表达(3.545±0.219)明显高于K562细胞[(39.6±0.9)%和2.366±0.141](P＜0.01);②Tet、DRL单独及联合作用6、12 h,对K562细胞NF-κB核转位水平及胞核NF-κB蛋白表达水平无明显影响(P＞0.05);③两药单独及联合作用6、12 h,可明显降低K562/A02细胞NF-κB蛋白核转位水平和胞核NF-κB蛋白表达水平(P＜0.05和P＜0.01),两药联合作用增强(P＜0.05),作用12 h较作用6 h效果更显著(P＜0.05).结论K562/A02细胞的胞核NF-κB蛋白表达水平明显高于K562细胞,NF-κB的活化可能参与了K562/A02细胞耐药的发生;抑制NF-κB活化可能参与了Tet和DRL逆转K562/A02细胞多药耐药过程.     

汉防己甲素联合伊马替尼对K562／G01细胞诱导凋亡作用及其相关机制

本研究探讨伊马替尼（imatinib,IM）和汉防己甲素（tetrandrine,Tet）单用和联合应用对K562／G01细胞的凋亡诱导作用及其可能机制。应用M1fr法检测IM和Tet单用及联合用药对细胞增殖抑制的作用,用流式细胞术（FCM）检测细胞周期和凋亡率,用实时荧光定量PCR检测caspase-3、BCL-2mRNA的表达,应用Westernblot分析caspase-3、BCL-2蛋白的表达情况。结果表明,1．0μmol／LIM和／或1．5μmol／L Tet单用及联合作用于K562／G01细胞48h后,对细胞增殖的抑制率分别是（22．74±0．05）％、（20．34±0．57）％、（44．28±0．60）％,两药联合应用较单药抑制作用明显。流式细胞术检测显示,Tet作用后细胞向G,／s期转化;Tet1．5μmol／L、3μmol／L与1．0μmol／LIM联合应用48h的早期凋亡率分别为（7．81±0．16）％、（14．10±0．28）％,诱导凋亡作用比单药组明显增加。FQ—PCR和Westernblot检测均显示单独应用Tet和IM后caspase-3表达上调,BCL-2表达下调,联合用药组作用更显著。结论：单独应用Tet对K562／G01细胞有诱导凋亡的作用,两药联合应用具有明显的协同效应,且具有时间和剂量依赖性,其机制可能与上调caspase-3mRNA及其蛋白表达和下调BCL-2mRNA及其蛋白的表达有关。     

汉防己甲素、托瑞米芬及其联合应用逆转K562/A02细胞多药耐药的研究

本研究探讨汉防己甲素（Tet）、雌激素受体抑制剂托瑞米芬（Tor）及其联合应用对K562/A02细胞多药耐药的逆转作用。采用噻唑蓝法（MTT）测定阿霉素（ADR）的半数抑制量,RT-PCR法检测MDR1基因mRNA表达水平,FCM检测P-gp的表达和细胞内ADR浓度。结果表明：ADR对K562/A02和K562细胞的IC50分别为57.43和1.16mg/L,Tet（1μmol/L）和Tor（2.5μmol/L）单用及两药联用处理K562/A02细胞时,ADR的IC50值分别为14.12,20.74和9.14mg/L。Tet及Tor单独作用后耐药株MDR1 mRNA下调微弱,联合用药下调效果明显。Tet及Tor均可降低P-gp蛋白的表达,且具有协同作用。Tet及Tor作用后细胞内ADR浓度增加,两药联合作用时效果增强。结论：Tet及Tor均可逆转K562/A02细胞多药耐药,联合作用时效果增强。     

小檗胺对K562细胞体外及体内作用的实验研究

为了探讨小檗胺(berbamine,BER)在体外及体内抗人白血病细胞株K562细胞的作用及其可能的机制,用MTr法测定K562细胞的增殖抑制,用流式细胞术检测凋亡细胞,用RT-PCR方法检测bcr/abl基因表达,用Westem blot方法检测BCR/ABL蛋白质水平表达,利用K562细胞荷瘤裸鼠模型观察小檗胺治疗后瘤体大小、组织病理及bcr/abl基因表达的改变.结果表明小檗胺对K562细胞有明显的增殖抑制作用,呈时间-浓度依赖关系.经8.0μg/ml BER作用24、48、72小时,对K562细胞的抑制率分别为(26.63±3.57)%,(61.84±4.74)%,(75.32±1.95)%,与对照组相比,P＜0.01.IC50值(72小时)为(5.227±1.307)μg/ml.与空白对照组相比,经8.0μg/ml小檗胺处理72小时后,K562细胞凋亡率明显增加[(61.77±4.35)%vs(0.50±0.14)%,P＜0.01].小檗胺能下调K562细胞bcr/abl mRNA表达和P210水平,且呈浓度-时间依赖效应,并与细胞凋亡率有一定的相关性.经8.0μg/ml BER处理后,与同浓度点对照组相比,72小时组的表达明显地减弱(0.97±0.01vs1.38±0.02,P＜0.01).4.0-16.0μg/ml BER处理24小时后,P210的相对表达量由未加药对照组的1.04±0.02降至16.0μg/ml组的0.63±0.01(P＜0.01),与所设的对照组药物酪氨酸蛋白激酶抑制剂STI571的作用结果相似.在K562荷瘤裸鼠模型,小檗胺治疗组瘤重较未治疗对照组的明显减少[(1.46±0.43)g vs(2.90±0.94)g,P＜0.01],抑瘤率为49.66%.瘤体细胞的bcr/abl mRNA的表达水平明显下调.结论小檗胺在体外对K562细胞具有明显的增殖抑制作用及明确的诱导凋亡作用,并呈时间-浓度依赖关系;小檗胺诱导细胞凋亡可能与其下调bcr/abl基因和(或)P210的表达水平有关;在荷瘤裸鼠体内,小檗胺同样具有显著的抑制K562细胞生长的作用,尤其能下调瘤体组织细胞bcr/abl mRNA的表达水平.     

联合应用尼洛替尼和汉防己甲素逆转K562/A02细胞耐药与诱导凋亡的研究

本研究旨在探讨联合应用尼洛替尼(nilotinib)和汉防己甲素(tetrandrine,Tet)逆转K562/A02细胞耐药与诱导凋亡的相关性及其机制。应用MTT法检测细胞敏感性,计算尼洛替尼和Tet干预后的柔红霉素(DNR)的半数抑制浓度(IC50),用流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率,RT-PCR检测bax、survivin mRNA的表达及Western blot分析BAX、SURVIVIN蛋白的表达情况。结果表明:5 nmol/L尼洛替尼或1.0μml/L Tet单独作用48小时后,DNR对K562/A02细胞的IC50分别为(5.71±0.72)mg/L和(6.52±0.43)mg/L,两药联合应用时DNR对K562/A02细胞的IC50降为(3.12±0.13)mg/L。单用尼洛替尼或Tet均能增加经DNR作用的K562/A02细胞的凋亡率,两药联合作用时凋亡率增高更明显。单用5 nmol/L尼洛替尼或1.0μml/L Tet 48小时后可上调bax mRNA及其蛋白的表达,且两药联合作用时上调幅度明显。单用5 nmol/L尼洛替尼或1.0μml/LTet48小时后可下调survivin mR...     

2-甲氧基雌二醇诱导K562细胞凋亡及机制研究

本研究探讨2-甲氧基雌二醇（2-ME2）对K562细胞的诱导凋亡作用及其机制。采用不同浓度2-ME2处理K562细胞,MTT法检测K562细胞的增殖活性,DNA琼脂糖凝胶电泳和Annexinv／PI双染色法检测K562细胞的凋亡效应,流式细胞术检测细胞线粒体膜电位的变化,RT-PCR和Western blot方法分别检测相关基因mRNA和／或蛋白的表达变化。结果表明：2-ME2抑制K562细胞增殖呈时间和剂量依赖性;48小时的半数抑制浓度（IC。）为2μmol／L;2μmol／L2-ME2作用于K562细胞24、48、72小时,DNA凝胶电泳分析可见典型DNA梯形条带;Annexinv／PI双染色法检测显示,细胞凋亡率分别为13．78％、22．32％和29．43％,而对照组凋亡率仅为1．78％（P〈0．05）;1、2和4μmol／L2-ME2分别处理K562细胞24小时,流式细胞术检测显示细胞线粒体膜电位下降;2μmol／L2-ME2处理K562细胞24、48和72小时,K562细胞中bcr／abl、bcl-2mRNA表达下调,而baxmRNA表达上调,Bcl-2、procaspase-3、procaspase-9、PARP（116 kD）和p-Akt蛋白表达下调,胞浆Cyto-C和PARP活性片段（85kD）表达上调,而对总Akt蛋白表达无影响。结论：2-ME2通过升高bax／bcl-2比值降低线粒体膜电位、促使细胞色素C（Cyto-c）释放入胞浆、触发K562细胞的线粒体凋亡途径,活化caspase-3,导致K562细胞凋亡并抑制其增殖;通过下调bcr／ab1 mRNA表达以阻断P13K／Akt信号通路也参与了该过程。     

汉防己甲素与5-溴汉防己甲素逆转耐药机制与降低MRP7表达水平有关(英文)

本研究的目的是探索汉防己甲素(Tet)与5-溴汉防己甲素(BrTet)逆转耐药的机制是否与调节多药耐药相关蛋白7(MRP7)表达水平有关。采用MTT法检测柔红霉素(DNR)对人白血病敏感细胞株K562与人白血病耐药细胞株K562/A02细胞增殖的抑制作用,计算半数抑制浓度(IC50)及耐药倍数。将细胞分组,加入BrTet、Tet,用实时PCR法检测细胞MRP7 mRNA表达,Western bolt法检测细胞MRP7蛋白和P-糖蛋白(P-gp)的表达,流式细胞术检测细胞内DNR蓄积。结果表明:K562/A02对DNR的耐药倍数为23.65倍。分别加入1μmol/L Tet与2.0μmol/L BrTet后,K562/A02细胞的MRP7 mRNA相对表达水平分别降低至2%和12%,MRP7蛋白表达降低了53.2%与83.7%,P-gp表达分别下调58.47%与52.20%;1.0μmol/L Tet与2.0μmol/L BrTet分别使K562/A02细胞内DNR提高了94.32%与271%。结论:BrTet与Tet均可逆转耐药,其逆转机制除了抑制P-gp的表达之外,还可能与抑制MRP7的表达,增加肿瘤细胞内抗肿瘤药物浓度有关。在相同摩尔浓度下,Tet与BrTet对MRP7表达的下调作用无显著性差异。     

芒果甙诱导慢性髓系白血病K562细胞凋亡

本研究目的是探讨芒果甙对慢性髓系白血病细胞系K562细胞的作用及其作用机制。用噻唑蓝(MTT)法观察芒果甙时K562细胞生长的影响；应用细胞形态、DNA凝胶电泳和流式细胞术等观察芒果甙时K562细胞凋亡的诱导作用；用RT-PCR方法观察芒果甙作用K562细胞后ber／abl融合基因在转录水平的改变。结果发现。25—200μmol／L浓度的芒果甙均能显著抑制K562细胞的增殖，呈剂量和时间依赖性。并能诱导K562细胞凋亡。随着药物作用浓度的增加，ber/abl融合基因的转录下调。结论：芒果甙可抑制K562细胞的增殖。并可能通过抑制bcr／abl融合基因的表达诱导K562细胞凋亡。     

bcr／abl特异性siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建bcr／abl的特异性siRNA真核细胞表达载体,并初步探索对K562细胞bcr／abl mRNA和P210蛋白的影响。方法：根据GenBank数据库提供的bcr／abl基因核苷酸序列,按照Tusch 1设计原则,选择设计双链小干扰RNA（siRNA）,再转化为能表达其小发卡结构RNA（shRNA）的DNA序列,并与pTER质粒定向连接,构建受控于人RNA聚合酶Ⅱ启动子H1的真核表达载体pTER117,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定;在脂质体的介导下转染K562细胞,用RT—PCR分析bcr／abl mRNA的表达,细胞化学染色检测P210蛋白的表达。结果：构建bcr／abl融合基因siRNA真核表达载体pTER117经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致,转染K562细胞24h后,pTER117使bcr／abl mRNA的相对水平下降50％,使P210蛋白下降47％。结论：bcr／abl融合基因siRNA真核细胞表达载体构建成功,并有效干扰K562细胞bcr／abl的表达。     

慢性髓系白血病细胞中SphK-1／S1P信号通路的初步研究

慢性髓系白血病（CML）是一种以髓系细胞受累为主的多能造血干细胞的克隆性疾病。为探讨SphK-1／S1P信号通路元件在CML细胞中的表达情况，研究P210^bcr/abl是否涉及到SphK-1／S1P信号通路，首先采用RT—PCR检测bcr／abl阳性的K562细胞和bcr／abl阳性的原代CML细胞中SphK-1和S1P受体mRNA的表达.进一步利用P210^bcr/abl特异抑制剂甲磺酸伊马替尼处理bcr／abl阳性的K562细胞和CML原代细胞，然后通过^32P-ATP掺入法测定细胞内SphK-1的酶活性。结果表明：K562细胞经2．5μmol／L甲磺酸伊马替尼处理0．5,2,6,24和48小时后，对SphK-1活性抑制强度分别为0．007％、38．9％、34．6％、28．1％和76．1％；CML原代细胞在使用2．5μmol／L甲磺酸伊马替尼处理后SphK-1活性较对照下降（16．8—41．9）％。结论：CML细胞中存在SphK-1和S1P的表达，P210^bcr/abl具有激活SphK-1的作用。     

Effect of tetrandrine in combination with droloxifen on the expression of NF-kappaB protein in K562 and K562/A02 cell lines

OBJECTIVE: To study the effect of tetrandrine (Tet) in combination with droloxifen (DRL) on the expression of nuclear factor kappa B (NF-kappaB) in K562 and K562/A02 cell lines and its reversal mechanism. METHODS: The activation of NF-kappaB in K562 and K562/A02 cell lines and the effect of Tet or DRL alone or in combination on NF-kappaB protein expression were determined with immunocytochemistry and Western blotting respectively. RESULTS: (1) K562/A02 cells displayed higher level of NF-kappaB protein expression than K562 cells. (2) The application of Tet or DRL alone or in combination had no effect on NF-kappaB expression in K562 cells at 6 h and 12 h (P > 0.05). (3) Tet and DRL alone or in combination could significantly down-regulate NF-kappaB protein expression in nuclei of K562/A02 cells. The effect was more significant in combination than either alone. This effect was more significant at 12 h than at 6 h. CONCLUSIONS: (1) Activation of NF-kappaB may be involved in the mechanism of MDR of K562/A02 cell line. (2)Inhibition of NF-kappaB activation may be involved in the reversal of multidrug resistance in K562/A02 cells by Tet and DRL.     

TEC启动子介导BCR/ABL基因在BaF3细胞中的表达

转P210bcr/abl基因小鼠是研究慢性髓系白血病的理想模型,但广泛表达的启动子容易引起转基因小鼠的胚胎致死,所以应用在造血细胞中特异表达的启动子是成功建立转P210bcr/abl基因小鼠模型的关键。本研究探讨TEC启动子介导BCR/ABL基因在BF3细胞中的表达。从小鼠的基因组中克隆TEC启动子的-364至+22区域,并替换掉IRES2-eGFP载体的CMVie启动子,同时在该载体的EcorⅠ酶切位点插入7.2 kb的P210bcr/abl基因,再将构建好的载体分别转染BaF3细胞和293细胞,观察eGFP基因与P210bcr/abl基因在2种细胞中的表达情况。结果通过荧光显微镜和流式细胞仪检测发现,eGFP基因在BaF3细胞成功表达,表达率在转染后6、24、72 h分别为7.10%、23.35%和64.61%,而在293细胞中未见eG FP基因表达。RT-PCR在BaF3细胞中扩增出BCR/ABL mRNA中372 bp的片段,而在293细胞中未扩增出任何片段。结论:TEC启动子的-364至+22区域能介导相关基因在造血细胞中高效特异性表达,适合于构建转P210bcr/abl基因小鼠模型。     

慢病毒介导shRNA稳定干扰P210bcr/abl基因表达的体内外研究

P210bcr/abl融合基因在慢性髓系白血病(CML)发生、发展中起重要作用。针对P210bcr/abl融合基因的小分子抑制剂(如伊马替尼)治疗CML非常有效,但容易产生耐药性。P210bcr/abl基因的融合区为RNA干扰其表达提供了一个特异性靶点。本研究通过病毒载体建立能同时表达P210bcr/ablshRNA和P210bcr/abl基因的BaF3细胞系,并探讨慢病毒介导的shRNA对P210bcr/abl基因表达的作用。用荧光显微镜检测慢病毒对BaF3细胞的感染率,用台盼蓝拒染法检测细胞的增殖能力;用RT-PCR和Western blot分别检测P210bcr/ablmRNA和蛋白的表达。结果发现,P210bcr/ablshRNA能使BaF3-P210bcr/abl细胞中的P210bcr/ablmRNA及蛋白表达明显下降,并且能增强BaF3-P210bcr/abl细胞对伊马替尼的敏感性,与不表达P210bcr/ablshRNA的BaF3-P210bcr/abl细胞相比,伊马替尼对该细胞系的IC50下降50%以上。将该细胞由尾静脉移植到受致死剂量照射的裸小鼠体内,移植该细胞的小鼠生存期较移植BaF3-P210bcr/abl细胞的小鼠生存期明显延长。结论:稳定表达针对P210bcr/abl基因融合区的shRNA可能增强CML常规治疗的效果。     

高三尖杉酯碱通过抑制P210^bcr／abl诱导K562细胞凋亡

为探讨高三尖杉酯碱（ｈｏｍｏｈａｒｒｉｎｇｔｏｎｉｎｅ,ＨＨＴ）抗慢性髓细胞白血病（ＣＭＬ）的机制,以ＣＭＬ细胞系Ｋ５６２细胞为对象,应用ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＰＩ双标志和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹杂交技术,观察ＨＨＴ对细胞凋亡和Ｐ２１０＾ｂｃｒ／ａｂｌ癌蛋白的影响。结果表明,５－２０ｎｇ／ｍｌ浓度的ＨＨＴ可诱导Ｋ５６２细胞凋亡,但随着药物浓度的增加细胞出现坏死性死亡,ＨＨＴ可使细胞内融合蛋白Ｐ２１０＾ｂｃｒ／ａｂｌ的含量约减少７０％,而对正常存在于细胞内的Ｐ１４５＾ｃ－ａｂｌ无影响,上述结果证实,ＨＨＴ通过对Ｐ２１０＾ｂｃｒ／ａｂｌ的定向抑制作用促进ＣＭＬ细胞凋亡,这可能是其抗ＣＭＬ的分子机制。本研究为ＨＨＴ在临床上的进一步应用提供了实验基础。     

切割bcr/abl核酶的逆转录病毒载体构建及其对K562细胞的影响

目的：研究ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因在慢性粒细胞白血病（ＣＭＬ）中的作用以及探索ＣＭＬ基因治疗的可能性。方法：合成针对ｂｃｒ／ａｂｌ融合基因转录本ｂ３ａ２断裂点“锤头状”核酶的ｃＤＮＡ序列，定向克隆于逆转录病毒载体内，通过脂质体介导的ＤＮＡ转染法，将核酶基因导入Ｋ５６２细胞，并通过克隆分析法、流式细胞术（ＦＣＭ）、逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）、ＤＮＡ电泳及电镜观察等方法检测核酶对Ｋ５６２细胞的影响。结果：①核酶转染Ｋ５６２细胞后４８小时克隆形成抑制率达８５％；②细胞内Ｐ２１０蛋白合成受到明显抑制；③ＲＴＰＣＲ半定量检测ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ表达水平明显下降；④核酶处理组Ｋ５６２细胞发生凋亡，表现为：在ＦＣＭ图谱上可见明显的凋亡峰；ＤＮＡ电泳分析出现典型的梯状ＤＮＡ带；电镜观察呈现凋亡早期形态学改变。结论：核酶基因通过逆转录病毒载体导入Ｋ５６２细胞后可成功表达，使Ｋ５６２细胞ｂｃｒ／ａｂｌｍＲＮＡ及Ｐ２１０蛋白表达水平下降，抑制Ｋ５６２细胞增殖，同时诱导Ｋ５６２细胞发生凋亡。