Resistin基因在3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化过程中表达水平的变化

目的：观察Resistin基因在3T3-L1脂肪细胞诱导分化过程中不同时段表达水平的变化。探讨Resistin基因与脂肪细胞分化、脂质积聚之间的关系。方法：体外培养3T3-L1前体脂肪细胞，在诱导其向成熟脂肪细胞分化的不同时段（第0～10天）．采用RT-PCR技术检测脂肪细胞中Resistin基因mRNA的表达水平。结果：①Resistin基因在3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化初期（第0～2天）不表达，分化第3天开始表达，分化第4～6天Resistin基因的表达显著上调，分化第6～10天Resistin基因的表达保持在较高水平并趋于稳定；②Resistin基因的表达水平除在诱导分化第3～4天、第6～10天内差异无显著性（P〉0．05）外，其余各时段间表达水平差异均有显著性（P〈0.01）。结论：Resistin基因可能参与了脂肪细胞分化的中晚期过程，在3T3-LI脂肪细胞分化过程中表达逐渐上调，其表达变化与脂肪细胞分化、脂质积聚过程相一致。     

槟榔碱对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响

目的探讨槟榔碱对3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化的影响及其机制。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和油红O染色检测不同浓度(10、30、50、100μmol/L)的槟榔碱对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响,荧光定量PCR检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和CAA T/增强子结合蛋白α(C/EBPα)的表达。结果 10～100μmol/L槟榔碱作用3T3-L1前脂肪细胞12 h和24 h能促进3T3-L1前脂肪细胞增殖,且呈一定的量效关系。到分化的第9天,与对照组相比,50μmol/L槟榔碱组胞浆中的脂滴明显减少,同时PPARγ和C/EBPαmRNA表达水平显著降低。结论槟榔碱能促进3T3-L1前脂肪细胞的增殖、抑制其分化,其机制可能与PPARγ和C/EBPα的表达降低有关。     

3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化方法优化的初步探讨

目的 观察不同诱导剂对3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化的作用。方法 在经典鸡尾酒诱导剂成分基础上,根据不同诱导剂成分,将3T3-L1前体脂肪细胞分为4组：（1）对照组;（2）罗格列酮干预组;（3）吲哚美辛干预组;（4）罗格列酮和吲哚美辛联合干预组。在诱导前体脂肪细胞分化过程中,通过显微镜观察细胞形态学变化、油红O染色以及检测胞内和胞外三酰甘油含量,评价各组成脂效率。结果 罗格列酮和吲哚美辛单独干预组及联合干预组前体脂肪细胞诱导过程中更早出现脂滴,且形成的脂滴也较对照组多,而油红O染色进一步证实以上结果。采用Image Pro Plus 6.0软件统计经油红O染色后的脂滴,单个脂滴的平均直径、平均面积以及最大直径,罗格列酮干预组和联合干预组均大于对照组,而吲哚美辛干预组与对照组比较,差异无统计学意义（P>0.05）。三酰甘油含量检测,胞外三酰甘油含量4组比较,差异无统计学意义,但胞内三酰甘油含量联合干预组高于对照组[（0.77±0.07）mmol/g vs（0.19±0.02）mmol/g,P<0.05]。结论 优化经典鸡尾酒诱导方法,在原成分基础上加用过氧化物酶体增生因子活化γ型受体（peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR-γ）激动剂罗格列酮,可显著提高3T3-L1前体脂肪细胞的诱导效率。     

维拉帕米对前体脂肪细胞3T3-L1分化及脂质积聚的影响

目的:观察钙离子通道阻滞剂盐酸维拉帕米对3T3鄄L1前体脂肪细胞分化及脂质积聚的影响。方法:体外培养3T3鄄L1前体脂肪细胞,在常规诱导分化方案基础上加用维拉帕米(终浓度30μmol/L),采用油红O染色各分化时段脂肪细胞,计数含脂滴脂肪细胞数。结果:维拉帕米干预后,脂肪细胞分化速度低于正常对照,虽未影响脂滴出现的时间(第4天),但含脂滴脂肪细胞数均显著低于同期正常对照(P<0.001)。结论:维拉帕米具有抑制脂肪细胞分化及脂质积聚的作用。     

3'-羟基染料木素对3T3-L1细胞增殖与分化的影响及其机制

目的探讨3′-羟基染料木素对3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化的影响及其机制。方法培养3T3-L1细胞,用3′-羟基染料木素干预,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和细胞计数法检测其对细胞增殖的影响,用5-溴脱氧尿嘧啶(bromodeoxyuridine,BrdU)掺入法检测其对前脂肪细胞内DNA合成的影响;用油红O染色法检测其对前脂肪细胞分化过程中脂质的堆积的影响;采用RT-PCR和蛋白免疫印迹技术检测过氧化物酶体增殖子活化受体γ(peroxisome proliferator acti-vated receptorγ,PPARγ)和CAAT/增强子结合蛋白α(CAAT/enhancer binding proteinα,C/EBPα)的mRNA以及蛋白的表达情况。结果用10～50μmol/L 3′-羟基染料木素分别处理前脂肪细胞24、48和72h,能促进前脂肪细胞增殖(P<0.05或P<0.01),且呈一定的量效关系;3′-羟基染料木素能浓度依赖性地促进前脂肪细胞内DNA合成(P<0.05);3′-羟基染料木素与噻唑烷二酮类药物罗格列酮(rosiglitazone,ROZ)相似,在10和50μmol/L浓度下能使前脂肪细胞的胞浆中出现较大量的脂滴(P<0.05或P<0.01);3′-羟基染料木素处理组中PPARγ和C/EBPα的mRNA与蛋白的表达增加(P<0.01)。结论 3′-羟基染料木素能够促进前脂肪细胞的增殖与分化,增加脂肪细胞分化过程中脂质的堆积,其机制可能与其促进PPARγ、和C/EBPα的mRNA与蛋白表达有关。     

3'-羟基染料木素对3T3-L1细胞增殖与分化的影响及其机制

目的 探讨3'-羟基染料木素对3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化的影响及其机制.方法 培养3T3-L1细胞,用3 '-羟基染料木素干预,用四甲基偶氮唑盐(MTT)法和细胞计数法检测其对细胞增殖的影响,用5-溴脱氧尿嘧啶(bromodeoxyuridine,BrdU)掺入法检测其对前脂肪细胞内DNA合成的影响；用油红O染色...     

KCTD15基因调控3T3-L1脂肪前体细胞分化的研究

目的 探讨含钾通道四聚化结构域15(KCTD15)基因在3T3-L1脂肪前体细胞分化过程中的作用.方法 ①采用半定量逆转录PCR检测在3T3-L1脂肪前体细胞分化过程中KCTD15 mRNA表达变化.②在3T3-L1脂肪前体细胞增殖早期通过RNA干扰技术靶向敲低KCTD15基因的表达,在靶向敲低KCTD15基因后的转染KCTD15 siRNA 48 h后通过半定量逆转录PCR验证KCTD15基因的敲低效果.用油红O染色法观察KCTD15敲低后3T3-L1细胞第0天和第10天的细胞形态学改变.③采用半定量逆转录PCR检测KCTD15基因敲低后PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPδ成脂基因的变化.结果 在3T3-L1脂肪前体细胞分化过程中,KCTD15 mRNA表达水平逐渐降低(P＜0.05);KCTD15敲低能显著抑制3T3-L1脂肪前体细胞分化;KCTD15敲低后PPARγ、C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPδ成脂基因无明显变化.结论 在分化早期阶段敲低KCTD15基因能抑制3T3-L1脂肪前体细胞分化.     

3T3-L1前脂肪细胞分化过程中miRNAs表达谱的变化

目的探讨3T3-L1前脂肪细胞分化过程中微小RNA(miRNAs)表达谱的变化。方法3T3-Ll前脂肪细胞培养和诱导分化,通过形态学观察和RT-PCR方法,判断3T3-Ll前脂肪细胞是否分化成脂肪细胞。运用miRNAs芯片技术检测3T3-Ll前脂肪细胞和脂肪细胞中差异表达miRNAs。结果3T3-L1前脂肪细胞呈现成纤维状,诱导分化的第9天,细胞变成球形,内含许多脂滴;过氧化物酶体增殖物激活受体r2(PPARr2)和脂肪性脂肪酸结合蛋白(aP2)的表达显著增加。3T3-L1前脂肪细胞分化成脂肪细胞上调的miRNAs有26个,下调的miRNAs有2个。结论3T3-L1前脂肪细胞分化过程中存在miRNAs表达谱的变化。     

中药调控3T3-L1脂肪细胞增殖、分化和糖脂代谢的研究进展

脂肪细胞的增殖、分化与肥胖和胰岛素抵抗等代谢性疾病有密切的关系,而传统中药在治疗各种疾病方面积累了丰富的实践经验。近年来许多研究以证明传统中药可通过调控脂肪细胞数量以及大小来改善某些代谢性疾病。脂肪细胞的形成是成纤维细胞样前脂肪细胞向成熟脂肪细胞转变的过程,脂肪的生成即是脂质的积累,需要依次激活众多转录因子。3T3-L1前脂肪细胞系是建立成熟脂肪细胞模型最为常用的细胞系之一,转变为成熟的脂肪细胞需要经历有丝分裂克隆扩增（MCE）阶段、终末分化阶段和分化为成熟脂肪细胞阶段。脂质代谢紊乱是引起肥胖和胰岛素抵抗等疾病的原因,许多中药通过抑制前脂肪细胞的增殖和分化,减少脂质的积累,改善或预防肥胖。胰岛素抵抗是2型糖尿病的早期症状、核心特征和主要发病机制之一。中药通过调控糖脂代谢,促进胰岛素信号转导,提高胰岛素敏感性,从而改善胰岛素抵抗。现总结近年来各种中药单体、单方或复方对3T3-L1细胞分化和代谢影响的研究,以及中药治疗肥胖和胰岛素抵抗等代谢性疾病机制的研究进展,旨在为传统中药治疗此类疾病提供参考。     

Effects of ghrelin on the proliferation and differentiation of 3T3-L1 preadipocytes

The effects of ghrelin on the proliferation and differentiation of 3T3-L1 preadipocytes and the possible mechanisms were investigated in this study. 3T3-L1 preadipocytes were cultured in vitro and treated with different concentrations of ghrelin. Proliferation of 3T3-L1 preadipocytes was evaluated by MTT method and mRNA levels of c-myc and thymidine kinase were detected by RT-PCR. Morphological changes of 3T3-L1 preadipocytes were observed and cell differentiation was measured by oil red O staining. The mRNA levels of peroxisome proliferator-activated receptor γ （PPARγ） and CAAT/enhancer binding protein （C/EBPa） in the cells at different differentiation stages were detected by RT-PCR. The results showed that ghrelin at concentrations of 10^-7 to 10^-15 mol/L could significantly promote preadipocyte proliferation （P〈0.05）, with the most pronounced effect observed at 10^-11 mol/L （P〈0.01）. Treatment of 3T3-L1 preadipocytes with ghrelin significantly increased the mRNA levels of c-myc and thymidine kinase （P〈0.01）. Morphological findings demonstrated that the great amount of lipid droplets appeared in the 3T3-L1 preadipocytes treated with ghrelin. Ghrelin could morphologically induce the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes into mature adipocytes. Ghrelin significantly increased the mRNA levels of PPAR7 and C/EBPα during the differentiation, when compared with control group （P〈0.05）. The mRNA levels of PPARγ and C/EBPα were obviously up-regulated with the differentiation of preadipocytes after the treatment of ghrelin. There were significant difference in the mRNA levels of PPARγ and C/EBPu on day 2 and day 8 of the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes （P〈0.01）. In conclusion, ghrelin could promote the proliferation and differentiation of 3T3-L1 preadipocytes by increasing the mRNA levels of PPARγ and C/EBPα and therefore enhance the sensitivity of adipocytes against insulin.     

黄芪多糖对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响

目的:探讨黄芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)对前脂肪细胞增殖、分化的影响及其机制。方法:以XTT法检测3T3-Ll前脂肪细胞的增殖;油红O染色并通过比色定量分析检测3T3-L1前脂肪细胞分化过程中胞浆脂质的堆积;采用实时聚合酶链式反应和蛋白质免疫印迹(Western blotting)技术检测前脂肪细胞分化相关基因过氧化物体增殖剂活化受体γ(peroxi some proliferator activated receptorγ,PPARγ)、CAAT/增强子结合蛋白α(CAAT/enhancer binding proteinα,C/EBPα) mRNA以及蛋白质的表达。结果:APS浓度从0.025到0.8g/L,在24、48和72h各时间段对前脂肪细胞的生长均表现为增殖趋势,且呈一定的量效关系;0.4g/L APS处理的前脂肪细胞,胞浆中出现较大量脂滴,其作用与噻唑烷二酮(thiazo-lidinedione,TZD)类药物罗格列酮(rosiglitazone,ROS)相似;APS使前脂肪细胞分化相关基因PPARγ和C/EBPα mRNA与蛋白的表达明显增加,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论:APS能够促进前脂肪细胞的增殖和分化,增加脂肪细胞分化过程中脂质的堆积,其机制可能与其促进PPARγ和C/EBPα mRNA与蛋白质表达有关。     

Verapamil inhibits 3T3-L1 preadipocyte differentiation

Objective: To investigate the effect of the calcium channel blocker verapamil on adipocyte differentiation and its mechanism of action. Methods: Preadipocytes from 3T3-L1 strain mouse embryos were cultured and differentiated into matured adipocytes in vitro. Verapamil was added to the culture medium in the concentration of 30 μmol/L on Day 0. Cell differentiation was determined by Oil Red O staining and marker gene mRNA expression was evaluated and compared by RT-PCR. The fluo-3/AM probe and laser scanning confocal microscopy were used to measure intracellular calcium concentrations. Results: ①The differentiation rate of 3T3-L1 preadipocytes exposed to verapamil was lower than that of untreated cells. ②Verapamil promoted the retention of pref-1 gene expression. Lipoprotein lipase expression in the verapamil group was significantly lower than that in the control group on Day 4, Day 6 and Day 8 (P < 0.05) and resistin expression was significantly lower than that in the control group on Day 6, Day 8 and Day 10 (P < 0.05). Fatty acid synthase expression in the verapamil group was significantly lower than that in the control group from Day 2 (P < 0.05). ③ Intracellular concentrations of calcium [Ca2+]i in the verapamil group were significantly decreased compared with those in the control group on Day 2, Day 4 and Day 6 (P < 0.05), while there was no obvious difference between the two groups on Day 0 (P > 0.05). Conclusion: In 3T3-L1 preadipocytes verapamil significantly reduced adipocyte differentiation, down-regulated the mRNA expression of three marker genes for adipocytes differentiation, and prolonged the mRNA expression of an inhibitor of differentiation. The inhibitory effect of verapamil on differentiation may involve its role as a blocker of calcium influx in adipocytes.     

脂联素基因在3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化中表达水平变化的研究

目的:观察脂联素基因mRNA在3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化过程中表达水平的变化。方法:体外培养3T3-L1脂肪前体细胞,应用MIX、地塞米松、胰岛素诱导其分化,采用RT-PCR技术检测诱导分化不同时间(0～10天)脂肪细胞中脂联素基因mRNA的表达水平。结果:脂联素基因低表达于3T3-L1脂肪前体细胞中,并随脂肪前体细胞分化成熟,该基因表达水平呈逐渐上调趋势,除在诱导剂作用后第0天与第2天、第1～2天、第3～4天、第6天与第8～10天、第7～10天各时段内差异无显著性(P>0.05)外,其余各时段之间表达水平差异均有显著性(P<0.05)。结论:在3T3-L1脂肪前体细胞分化过程中脂联素基因表达逐渐上调,可能有利于脂肪细胞的分化成熟。     

RNA干扰血管紧张素原基因表达对前脂肪细胞3T3-L1分化的影响

目的:构建靶向血管紧张素原(AGT)基因的RNA干扰质粒,研究AGT基因对鼠前脂肪3T3-L1分化的影响。方法:设计靶向AGT的小分子RNA干扰片段(AGT-shRNA),以未靶向任何DNA的小分子RNA(Non-shRNA)为对照,利用载体psiRNA-U6.1/Neo构建重组表达质粒,转染鼠前脂肪细胞3T3-L1并筛选到稳定转染细胞株,RT-PCR和SDS-PAGE法分别检测AGT基因沉默效果,通过显微镜观察和脂肪细胞分化标志物检测来确定AGT基因干扰对3T3-L1细胞分化的影响。结果:成功构建AGT干扰质粒,与对照组比较,AGT基因转录水平受到显著抑制(P<0.05),AGT蛋白表达水平也仅为对照的43.86%。AGT基因干扰后3T3-L1细胞脂质水平和甘油-3-磷酸脱氢酶(GPDH)活性仍随分化时间延长呈上升趋势,但增长量明显低于对照组(P<0.05)。结论:RNA干扰AGT基因可明显抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化,提示脂肪组织中的肾素-血管紧张素系统(RAS)与脂肪代谢有重要关联。     

蛋白酪氨酸磷酸酶1B在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中表达的变化

目的:观察在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)mRNA表达及其蛋白水平的变化,探讨PTP1B与脂肪细胞分化的关系.方法:体外培养3T3-L1前脂肪细胞,在3T3-L1前脂肪细胞分化成熟过程中(第1～10日),采用油红O染色及RT-PCR法检测过氧化物酶体增殖物活化受体γ2(PPARγ2)基因表达评价脂肪细胞分化成熟情况,RT-PCR法及Western印迹法检测脂肪细胞分化过程中PTP1B mRNA表达及其蛋白水平的变化.结果:随着脂肪细胞诱导分化逐步深入,油红O染色显示其中脂滴形成逐渐增多,至占全视野90%以上;同时PPARγ2基因表达逐步增多,均提示脂肪细胞分化逐步成熟,至最终分化为成熟脂肪细胞.PTP1B mRNA和蛋白水平在前脂肪细胞中表达较高,随着脂肪细胞的逐步成熟,其表达逐渐降低,至分化成熟时表达水平降至最低.结论:在3T3-L1前脂肪细胞分化成熟过程中,PTP1B mRNA及其蛋白表达水平逐渐减低,PTP1B可能参与了脂肪细胞分化.     

硒对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响

目的:研究硒对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响。方法:培养3T3-L1前脂肪细胞,分为对照组、低硒组、中硒组和高硒组(亚硒酸钠浓度分别为0、0.01、0.1和1μmol/L),采用四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法检测硒对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响,利用油红O染色法测定硒对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响。结果:在增殖实验中,与对照组相比,各处理组的OD值降低,并具有剂量依赖性(P<0.05);在分化实验中,各处理组的OD值与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:硒能抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖,而对其分化无影响。     

全反式维甲酸调控BMP9诱导3T3-L1前脂肪细胞成骨和成脂分化

目的 研究全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)调控骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导前脂肪细胞成骨和成脂分化的作用及相关机制.方法 首先用RTPCR检测维甲酸受体在3T3-L1前脂肪细胞中的表达;用BMP9编码序列的重组腺病毒感染3T3-L1细胞,再以1 μmol/L的ATRA干预不同时间后,利用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性测定和染色、Western blot检测骨桥素(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OC)和脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty acid binding protein,aP2)表达,茜素红染色检测钙盐沉积水平,油红O染色检测脂质积聚研究BMP9和ATRA对前脂肪细胞成骨和成脂分化的作用;利用荧光素酶报告质粒和Western blot检测ATRA对BMP9介导的BMPR-Smad信号通路活性的影响.结果 前脂肪细胞中,除视黄醇受体γ外其余5种维甲酸受体均有表达;BMP9能增加前脂肪细胞ALP活性(P＜0.01),并促进OPN及OC蛋白表达和钙盐沉积,ATRA能进一步增强该作用(P＜0.01);BMP9能促进前脂肪细胞中脂质积聚,并诱导aP2表达,但该作用被ATRA抑制;ATRA还能够上调细胞中BMP9的mRNA和蛋白表达,BMP9合并ATRA组的Samd1/5/8磷酸化水平明显强于BMP9组,BMPR-Smad报告质粒荧光素酶活性也呈相同变化趋势(P＜0.01).结论 在前脂肪细胞中,ATRA能增强BMP9的成骨诱导活性,并抑制其诱导的成脂分化;ATRA的作用可能与进一步激活BMP9介导的BMPR-Smad信号有关.