RNA干扰抑制神经母细胞瘤细胞α7神经型尼古丁受体基因的表达

目的:利用小分子干扰RNA(RNAi)技术抑制神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中α7 神经型尼古丁受体(nAChR)基因的表达,并研究α7 nAChR基因表达受抑制后对细胞存活率及脂质过氧化水平的影响.方法:设计并通过分子生物学方法合成α7 nAChR基因特异性小分子干扰RNA(siRNA),转染SH-SY5Y细胞,培养48 h后收集细胞,分别应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和西印迹方法(Western-blotting)检测转染细胞中α7 nAChR mRNA及蛋白表达水平的变化,并用1 μmol/L β淀粉样肽25-35(Aβ25-35)处理siRNA转染细胞,比色法测定脂质过氧化产物含量.四氮基偶氮唑蓝(MTT)方法测定细胞活力.结果:转染siRNA后,与对照组相比,实验组α7 nAChR mRNA及蛋白表达量降低,抑制率分别为52%和36%,脂质过氧化产物丙二醛含量明显增加,MTT法表明实验组细胞活力明显低于对照组,且能增强Aβ的细胞毒性作用.结论:特异性siRNA能有效抑制α7 nAChR基因的表达,α7 nAChR基因的表达的抑制能增加Aβ的神经毒性作用,间接说明α7 nAChR有一定的神经保护作用,其表达减少与阿尔茨海默病的发生有一定关系.     

灯盏细辛活性部位对神经细胞α7尼古丁受体表达的影响

目的：研究灯盏细辛活性部位对SH-SY5Y神经细胞中α7神经型尼古丁受体（nAChR）亚单位在蛋白质水平的表达以及对抗β-淀粉样蛋白的毒性作用。方法：灯盏细辛经乙醇提取、乙酸乙酯及正丁醇萃取、再以反相硅胶柱分离等方式得到极性部位,选取一定浓度的灯盏细辛提取物处理神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）后,用Western blotting方法测定α7 nAChR蛋白水平的变化;再将能明显上调α7 nAChR蛋白水平的灯盏细辛提取物预处理SH-SY5Y细胞后,加入Aβ25-35处理,用比色法测定MTT还原率,观察灯盏细辛活性部位对细胞毒性的影响。结果：灯盏细辛醇提乙酸乙酯及正丁醇部位、以及该部位经反相硅胶柱分离的低极性部位均能显著上调α7 nAChR蛋白水平,并减弱β-淀粉样蛋白引起的细胞损伤。结论：灯盏细辛活性部位具有一定的神经保护作用,其机制之一可能与上调α7 nAChR有关。     

RNA干扰抑制α3神经型尼古丁受体的表达对SH-SY5Y神经细胞抗氧化能力的影响

目的：探讨通过RNA干扰技术抑制α3神经型尼古丁受体（nAChR）基因表达后该受体对神经细胞抗氧化能力的影响,了解α3nAChR的神经保护作用。方法：设计并体外合成α3nAChR的特异性编码siRNA序列的寡核苷酸,退火后克隆至pSilencer 3.1-H1neo质粒中,构建重组质粒α3nAChR pSilencer3.1-H1neo。将α3nAChR pSilencer 3.1-H1neo转染SH-SY5Y细胞,用含G418的培养液筛选,挑选阳性克隆后采用即时荧光定量PCR和Western blot方法检测转染细胞中α3nAChR mRNA及蛋白表达水平的变化。用1μmol/Lβ-淀粉样肽1-42（Aβ1-42）处理转染细胞后,用四甲基偶氮唑盐（MTT）方法测定细胞活力;用比色法测定其指质过氧化产物含量、超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性。结果：成功构建α3nAChR siRNA表达质粒,转染后经G418筛选获得稳定转染重组质粒的细胞克隆株,与对照组相比,α3nAChR mRNA及蛋白表达量均降低（抑制率分别为98%和66%）;经转染处理的细胞活力明显低于对照组,细胞中脂质过氧化产物丙二醛含量明显增加,超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性不同程度的降低;抑制α3nAChR基因表达后能增强Aβ的神经细胞毒性作用。结论：成功构建的α3nAChR siRNA表达质粒能特异性抑制α3nAChR基因表达,α3nAChR基因表达抑制后可引起氧化应激水平升高,并增加Aβ的神经毒性,表明α3nAChR具有一定的抗氧化能力和神经保护作用。     

SH-SY5Y神经细胞中α3尼古丁受体基因表达沉默对β分泌酶蛋白表达的影响

目的:研究α3神经型尼古丁受体(nAChR)基因沉默对β分泌酶(BACE)蛋白表达的影响。方法:稳定转染α3 nAChR siRNA表达质粒及空质粒的SH-SY5Y神经细胞与正常对照组细胞,用Real time-PCR和Western印迹法检测α3 nAChR mRNA表达和蛋白水平表达,评价RNA的干扰效率;用蛋白质印迹方法分别检测细胞中β分泌酶2个亚型(BACE1和BACE2)蛋白表达水平的变化。结果:稳定转染α3 nAChR siRNA表达质粒的细胞克隆株,与空质粒和正常对照组相比BACE1蛋白表达水平增加,BACE2蛋白表达水平减少。结论:α3 nAChR可以通过增加BACE2蛋白表达水平及减少BACE1蛋白表达水平,影响Aβ生成从而减少Aβ的神经毒性作用,发挥神经保护作用。     

β淀粉样肽对神经母细胞瘤细胞Notch信号通路的影响

目的：研究β淀粉样肽（Aβ）处理SH-SY5Y细胞以及α3神经型尼古丁受体（α3nAChR）沉默细胞后细胞Notch信号通路的变化.方法：2μmol/L Aβ处理SH-SY5Y细胞以及α3nAChR沉默细胞,用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real Time PCR）和蛋白印迹（western blot）方法分别检测细胞中Notch信号通路中Notch1和Hes1的mRNA及蛋白水平的变化,评价Aβ对细胞Notch信号通路的影响.结果：Aβ处理的SH-SY5Y细胞以及α3 nAChR沉默细胞中Notch1和Hes1的mRNA及蛋白水平表达均增加,且在α3 nAChR沉默细胞中增加更为明显,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论：Aβ可增加细胞Notch信号通路基因表达,αα3 nAChR沉默会增强Aβ对Notch信号通路基因表达的影响,这可能与阿尔茨海默氏病（AD）的发病有一定的关系.     

MAPKs阻断剂U0126对神经细胞α7尼古丁受体表达的影响

目的：研究老年性痴呆发病中α7尼古丁受体（nAChR）与ERK MAPK信号转导通路之间的关系。方法：用MEK阻断剂U0126阻断SH-SY5Y细胞ERK蛋白的活化及表达,实时荧光定量PCR（Real-time PCR）及Western blotting方法测定α7 nAChR mRNA及蛋白表达水平。结果：细胞经U0126处理后p-MEK和p-ERK1/2的水平明显降低,提示MEK和ERK 1/2的磷酸化被阻断,同时U0126处理组α7 nAChR mRNA及蛋白的表达量降低。结论：U0126能抑制SH-SY5Y细胞ERK MAPK信号转导通路,ERK MAPK信号转导通路的活化可能与神经细胞α7尼古丁受体的正常分泌及胆碱能信号传递密切相关。     

辛伐他汀对SH-SY5Y神经细胞中胆碱能神经系统的刺激作用

目的:研究胆固醇降解药辛伐他汀(Simivastatin)对SH-SY5Y神经细胞中胆碱能神经的刺激作用,探讨史他汀类药物在神经退变性疾病中的神经性保护机制.方法:体外培养SH-SY5Y神经细胞(源于人神经母细胞瘤细胞),在培养液中加入辛伐他汀培养48 h,然后用比色法测定细胞MTT还原率及胆碱酯酶活性,用蛋白印迹方法测定尼古丁受体α7和α3蛋白水平,RT-PCR方法测定该类受体mRNA表达水平.结果:辛伐他汀能降低培养细胞中乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶活性(分别降低41.9%和18.1%);增强尼古丁受体α7亚单位的蛋白和mRNA表达水平(分别升高23%和32%),但对α3无明显影响.结论:辛伐他汀可以刺激胆碱能神经系统,可能具有神经性保护作用.     

尼古丁暴露和饮酒行为对大鼠腹侧被盖区烟碱型乙酰胆碱受体表达的影响

目的 探讨尼古丁暴露和饮酒行为对大鼠腹侧被盖区(VTA)烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)部分亚单位mRNA表达的影响.方法 39只出生35 d的雄性Wistar大鼠随机分为实验组(N组,n=20),和对照组(C组,n=19),N组大鼠进行为期10d的尼古丁(1.0mg·kg-1·d-1)皮下注射,C组大鼠以生理盐水对照处理10d.其后,在N组和C组大鼠中各随机抽取6只(分别为NE组,n=6,和CE组,n=6)大鼠断头取脑分离VTA区提取mRNA,实时定量检测nACh受体α4、α5、α7和β2亚单位表达.N组和C组其余大鼠(分别为NA组n=14,CA组n=13)在出生后60d以Samson糖水递减程序诱导建立双瓶自由选择饮酒行为模型,共计69d,之后以相同程序定量检测VTA区标本相同指标.结果 ①因素分析显示:两因素(尼古丁暴露、饮酒行为)对VTA区nAChRα4、α5亚单位表达水平均有调节作用(F值分别为6.13,5.407,5.186,7.132,P＜0.05);饮酒行为因素对β2亚单位表达水平有调节作用(F=5.896,P＜0.05);两因素对α7亚单位表达有极强的交互作用(F=13.894,P＜0.001),对α5、β2亚单位表达有交互作用(F值分别为6.149,4.222,P＜0.05).②NA组α4、α5、α7和β2亚单位mRNA表达不同程度的显著高于CA组(F值分别为7.941,13.517,17.438,9.272,分别P＜0.05、P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01),NA组的α4、α5、α7、β2亚单位表达水平显著高于NE组(F值分别为5.293,8.500,6.149,4.837,P＜0.05);CA组α7亚单位表达水平显著低于CE组(F=12.750,P＜0.01).结论 尼古丁和乙醇共同作用于VTA区包含有α4、α5、α7、β2亚单位的nAChR亚型.     

高浓度氟引起SH-SY5Y神经细胞中α7尼古丁受体水平降低

目的：观察氟中毒对神经细胞中α7尼古丁受体的影响。方法：体外培养SH-SY5Y神经细胞，在培养液中加人不同浓度的氟化物，培养48h后测定细胞MTT水平；用放射配体结合实验测定α7尼古丁受体亚型含量；用Westem Bloting方法测定α7尼古丁受体亚单位蛋白水平。结果：经氟处理的神经细胞中MTT水平降低，α7尼古丁受体最大结合容量降低，α7尼古丁受体亚单位蛋白含量减少。结论：氟中毒可引起SH—SY5Y神经细胞中α7尼古丁受体表达降低。     

精神分裂症患者大脑皮质尼古丁受体亚单位蛋白质水平的改变

目的：研究精神分裂症与尼古丁受体的关系。方法：用WesternBlotting方法测定患者大脑皮质组织中主要的尼古丁受体亚单位蛋白质水平，并与同龄对照组相比较。结果：精神分裂症患者大脑皮质前叶组织中α7亚单位蛋白质含量较对照组减少，但在大脑皮质顶叶组织中未见明显变化。在精神分裂症患者与同龄对照组之间没有发现尼古丁受体α3,α4和β2亚单位蛋白质表达有明显区别。结论：α7尼古丁受体亚型在精神分裂症发病机制中具有特殊意义和重要作用。     

六味地黄汤含药脑脊液对α7nAChR保护作用的实验研究

目的探讨六味地黄汤含药脑脊液对Aβ1-40诱导的α7nAChR缺失的保护作用,为六味地黄汤防治AD提供实验依据。方法观察细胞形态,以MTT法测定细胞活性、免疫细胞化学法测定α7nAChR的表达量。结果六味地黄汤含药脑脊液1天20% 1μMAβ1-40组和10天20% 1μMAβ1-40组能改善细胞生长状况,明显上调PC12细胞活性(P<0.05,P<0.01),增加α7nAChR的表达(P<0.05,P<0.01),但给药1天和10天其结果无显著性差异(P>0.05)。结论六味地黄汤含药脑脊液能抑制Aβ1-40的神经毒性作用,保护α7nAChR。     

芍药苷神经保护作用的实验研究

目的观察芍药苷（PF）的神经保护作用,为阿尔茨海默病（AD）的防治提供理论依据。方法体外培养PC12细胞,用Aβ1-40诱导α7nAChR缺失,建立AD早期细胞模型;用不同浓度（50、100和200μM）的芍药苷预处理,光镜观察细胞形态,MTT比色法测定细胞活性,MTB比色法测定细胞内Ca2＋含量,免疫细胞化学法观察α7nAChR的表达情况。结果芍药苷预处理组细胞活性、α7nAChR平均灰度值（AVG）均随芍药苷浓度的增加而增加,且Aβ1-40＋PF100μM组和Aβ1-40＋PF200μM组增加明显（P〈0.05）;芍药苷预处理组细胞内Ca2＋含量均降低（P〈0.05）。结论芍药苷抑制细胞内Ca2＋超载和Aβ1-4040的神经毒性作用,改善PC12细胞的活性,保护α7nAChR,是其防治AD的重要机制。     

芍药苷神经保护作用的实验研究

目的观察芍药苷(PF)的神经保护作用,为阿尔茨海默病(AD)的防治提供理论依据。方法体外培养PC12细胞,用Aβ1-40诱导α7nAChR缺失,建立AD早期细胞模型;用不同浓度(50、100和200μM)的芍药苷预处理,光镜观察细胞形态,MTT比色法测定细胞活性,MTB比色法测定细胞内Ca2+含量,免疫细胞化学法观察α7nAChR的表达情况。结果芍药苷预处理组细胞活性、α7nAChR平均灰度值(AVG)均随芍药苷浓度的增加而增加,且Aβ1-40+PF100μM组和Aβ1-40+PF200μM组增加明显(P<0.05);芍药苷预处理组细胞内Ca2+含量均降低(P<0.05)。结论芍药苷抑制细胞内Ca2+超载和Aβ1-4040的神经毒性作用,改善PC12细胞的活性,保护α7nAChR,是其防治AD的重要机制。     

TLR-7对阿尔兹海默细胞模型β淀粉样蛋白表达及炎症反应的调控作用及机制李娟? 蔡萃 聂晶 吴宇婧 张东阳

[目的]? 探究TLR-7在阿尔兹海默症SH-SY5Y细胞模型中对β淀粉样蛋白表达及神经炎症反应的调控作用及机制。[方法] 构建稳定表达APPswe的阿尔兹海默症模型SH-SY5Y/APPswe细胞,将细胞分为SH-SY5Y组、SH-SY5Y/APPswe组、SH-SY5Y/APPswe+shNC组、SH-SY5Y/APPswe+shTLR7组、SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR7+miR-15binhibitor组和SH-SY5Y/APPswe+shTLR7+ inhibitor NC组。用蛋白质免疫印迹检测APP蛋白的表达,用实时荧光定量PCR实验检测TLR-7、miR-15b、BACE1、IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表达,用酶联免疫吸附实验检测β淀粉样蛋白以及IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌;用荧光素酶报告基因实验检测NF-κB活性。[结果] 与SH-SY5Y组相比,SH-SY5Y/APPswe细胞APP表达水平上调,β淀粉样蛋白分泌水平增加(P<0.001);与SH-SY5Y/APPswe+shNC组相比,SH-SY5Y/APPswe+shTLR7组miR-15b表达水平上调(P<0.001),BACE1 mRNA表达水平下降(P<0.01),β淀粉样蛋白分泌水平下降,IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达及蛋白分泌水平下降(均P<0.05),NF-κB活性下降(P<0.01)。与SH-SY5Y/APPswe+shTLR7+ inhibitor NC组相比,SH-SY5Y/APPswe+sh-TLR7+miR-15binhibitor组miR-15b表达水平下降(P<0.001),BACE1 mRNA表达水平升高(P<0.05),β淀粉样蛋白分泌水平升高(P<0.01),IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA表达及蛋白分泌水平升高(均P<0.05),NF-κB活性升高(P<0.01)。[结论] TLR-7通过miR-15b调控NF-κB信号通路,并影响阿尔兹海默症模型细胞β淀粉样蛋白的分泌及神经炎症反应。guan     

K562细胞7种珠蛋白基因mRNA水平的研究

目的：研究K562细胞α、β、Gγ、Aγ、ζ、ε、δ珠蛋白基因mRNA水平。方法：采用RT-PCR在相同条件下同时扩增成功7种珠蛋白mRNA，比较K562细胞内各珠蛋白mRNA水平。结果：α基因簇中α-mRNA水平明显高于ζ-mRNA,β基因簇mRNA表达水平依次为Gγ、Aγ、ε、δ，K562细胞不表达β-珠蛋白mRNA。结论：转录后水平的调控可能在K562细胞α基因簇的表达中起重要作用，β-基因簇各珠蛋白mRNA水平和蛋白质水平基本相符。     

α3、α7-nAChRs缺损AD模型的建立及茶多酚的干预

目的 建立β-Amyloidpepfides(Aβ)诱导α3、α7-烟碱型胆碱能受体nAChRs受体亚型缺失AD病理模型，探讨Aβ的毒性作用机理，并观察茶多酚(EGCG)的可能干预。方法 纳摩尔Aβ慢性处理PC12细胞建立ct3、唧亚单位缺失细胞模型。用MTT比色法、Annexin V-FITC、配体结合实验、Western Blot、RPA法深入探讨Aβ损伤α3、α7 nAChRs亚型的机制以及EGCG的保护作用。结果 用纳摩尔浓度Aβ1-40和Aβ25-35能明显降低PC12细胞[^125I]α—Bungarotoxin和[^3H]Epibatidine结合位点数量，α3、α7亚单位蛋白和mRNA水平，但不诱导凋亡，却明显抑制MTT。而预先加入10μM EGCG几乎完全抑制Aβ对[^3H]epibatidine和[^125I]α-BTX的结合力的影响，可显著抑制Aβ对α3、α7 nAChRs受体亚单位蛋白的损伤。结论 Aβ诱导nAChRs缺损神经细胞模型，是目前较理想研究AD的细胞模型；EGCG可干预Aβ对nAChRs的神经毒性作用。     

灯盏乙素对痴呆大鼠脑组织乙酰胆碱尼古丁受体蛋白及mRNA表达的作用

目的:观察灯盏乙素对痴呆模型大鼠乙酰胆碱尼古丁受体(nAChR)亚单位蛋白质和mRNA水平表达的影响,探讨其可能的作用机制。方法:Wistar大鼠42只,随机分为5组,正常对照组(6只)、假手术组(6只)、学习记忆损伤模型组(6只)、灯盏乙素处理组(10只)和脑复康处理组(10只)。用双侧脑室注射β淀粉样蛋白     

灯盏细辛活性部位对抗β-淀粉样蛋白引起的细胞凋亡

目的：研究灯盏细辛醇提物不同活性部位对β-淀粉样蛋白（Aβ）引起的神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）凋亡的拮抗作用,探讨其是否在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）治疗中有神经保护作用。方法：选用灯盏细辛醇提物不同活性部位及Aβ25-35处理SH-SY5Y细胞,用比色法测定MTT还原率,Annexin V-FITC试剂盒测定细胞凋亡水平。结果：安全浓度的灯盏细辛醇提物不同活性部位能对抗Aβ引起的MTT还原率降低和细胞凋亡。结论：灯盏细辛醇提物不同活性部位可对抗Aβ的神经毒性作用。     

甲状腺激素对大鼠脑海马发育期神经元烟碱受体α4亚单位表达的影响

目的探讨甲状腺激素(TH)对发育关键期大鼠脑海马区域神经元烟碱受体α4亚单位(nAChRα4)表达的作用和影响。方法实验分成正常对照组(n=42)和甲减组(n=36)。选用甲巯咪唑(MM)复制甲状腺机能减退大鼠模型,收集出生后第0,4,7,14,21,30,120天的正常、甲减仔鼠脑组织,每组6只。采用原位杂交组织化学法检测发育关键期仔鼠大脑海马区域神经元烟碱受体α4亚单位(nAChRα4)的表达变化情况。结果①正常对照组nAChRα4 mRNA在生后不同发育阶段的表达变化明显且具有层状分布的特点。生后第0天表达很低,在生后第14-21天nAChRα4 mRNA表达最高,然后下降,直至成年鼠水平(生后第120天)。②正常对照组nAChRα4 mRNA海马CA1区阳性信号表达高峰(生后第21天)是成年鼠的4-5倍,海马CA2、CA3区阳性信号表达高峰(生后第21天)是成年鼠的8倍左右,海马齿状回(DG)区阳性信号表达高峰(生后第14天)是成年鼠的5倍左右。③甲减组nAChRα4 mRNA表达在各时点均明显低于正常对照组(P<0.001)。甲减组表达的高峰时间与正常对照组的高峰时间相一致,无高峰延迟。结论在脑发育关键期,甲状腺激素水平的减少改变了大鼠脑海马神经元烟碱受体α4亚单位的表达,进一步影响了该区域突触的发生及相关神经回路的建立,出现神经元的旷置或错误神经通路,这可能阻碍了脑发育与其功能的成熟。     

K562细胞7种珠蛋白基因 mRNA水平的研究

目的研究K562细胞α、β、Gγ、Aγ、ζ、ε、δ珠蛋白基因mRNA水平。方法采用RT-PCR在相同条件下同时扩增成功7种珠蛋白mRNA,比较K562细胞内各珠蛋白mRNA水平。结果α基因簇中α-mRNA水平明显高于ζ-mRNA,B基因簇mRNA表达水平依次为Gγ、Aγ、ε、δ,K562细胞不表达B-珠蛋白mRNA。结论转录后水平的调控可能在k562细胞α基因簇的表达中起重要作用,B基因簇各珠蛋白mRNA水平和蛋白质水平基本相符。