纳他霉素产生菌基因组重排育种

Streptomyces gilvosporeus SG-1原生质体经紫外线诱变并筛选链霉素抗性菌株，获得纳他霉素高产菌株。在上述高产突变株中选择4株作为亲本进行基因组重排育种，筛选得到了高产重排菌株，其中一株重排菌株S．gilvosporeus GS-74的纳他霉素产量为3574mg／L。为产量最高的亲本菌株的153％，比原始出发菌株SG-1提高1.17倍。     

他克莫司高产菌株选育及发酵配方优化

目的 选育他克莫司高产菌株,优化培养基配方,提高发酵产量。方法 采用原生质体融合技术对2株筑波链霉菌进行基因组重排,并经响应面设计对发酵培养基配方进行优化。结果 以紫外灭活作为遗传标记经过4轮基因组重排育种后,摇瓶筛选获得3株高产菌株,其中菌株FK22-71菌丝球松散、椭圆状,发酵浸泡液颗粒状。该菌株稳定高产,采用响应面设计优化后的配方在50 L罐发酵产量平均达1684 mg/L。结论 基因组重排技术应用于他克莫司高产菌株选育,可大幅提高发酵产量,为其工业化发酵生产奠定了基础。     

双亲灭活原生质体融合法选育阿维菌素高产菌株

目的选育高产阿维菌素产生菌。方法分别以紫外线和加热灭活阿维菌素产生菌Strepto-myces avermitilis620和Streptomyces avermitilis632原生质体,并将2种灭活的原生质体用PEG4000融合,从融合株中筛选阿维菌素高产菌种。结果获得高产阿维菌素融合株StreptomycesavermitilisF32,总发酵单位达3 904 mg.L-1,其中B1a组分产量较高,达1 016 mg.L-1,分别较出发菌株S.avermitilis 620、S.avermitilis 632提高117.1%和103.6%。结论双亲灭活原生质体融合法选育阿维菌素高产菌株是值得推广的一种选育方法。     

原生质体诱变选育阿霉素高产菌株及发酵产品质量的初步分析

目的 利用原生质体诱变方法从一株链霉菌原始菌株Streptomyces sp.H-323 (CGMCC 4827)选育阿霉素高产突变菌株,以提高阿霉素的发酵单位,并对发酵产品的质量进行了初步研究.方法 通过研究不同甘氨酸浓度、溶菌酶酶解时间、酶解温度、酶浓度对H-323原生质体形成的影响,确定了原生质体的最佳制备和再生条件.通过阿霉素抗性选育,诱变原生质体筛选阿霉素高产突变菌株.最后通过高效液相、核磁等波谱分析法初步确定发酵法生产的阿霉素产品的质量.结果 制备Streptomyces sp.H-323原生质体的最佳条件:种子培养基中甘氨酸浓度0.5％、溶菌酶浓度3mg/mL、酶解时间60min、酶解温度30℃.通过原生质体诱变结合阿霉素抗性选育,得到一株高产突变株,阿霉素发酵单位由出发菌株的300mg/L提高到700mg/L.通过波谱分析,发酵产物达到国外注册标准.结论 通过原生质体诱变和抗性选育大大提高了阿霉素的产量,为高产阿霉素产业化提供方法支持.     

应用双亲株灭活原生质体融合法选育林可霉素高产菌株

目的：选育高产优质林可霉素产生菌。方法：将林可霉素产生菌S78－1^#,N65-2^#的原生质体分别热灭活和紫外灭活，并将两种灭活原生质体用PEG融合，从融合株中筛选高产优质菌种。结果：获得82－201^#融合株，其摇瓶效价分别较N65－2^#,S78-2^#提高17％和52％，且色素分泌少，传代稳定性强。结论：双亲株灭活原生质体融合选育林可霉素高产菌株是值得推广的一种选育方法。     

非对称灭活原生质体融合法选育头孢菌素C高产菌株

目的选育高产头孢菌素C产生菌。方法分别以紫外线和加热灭活头孢菌素C产生菌Cephalosporium acremonium 18-U5和Cephalosporium acremonium 18-M6原生质体,并将两种灭活的原生质体经PEG4000融合,从融合株中筛选头孢菌素C高产菌株。结果获得高产头孢菌素C的顶头孢霉融合株Cephalosporium acremonium F20,发酵单位达4 655 mg.L-1。与双亲菌株相比分别提高了42.4%和34.9%。结论非对称灭活原生质体融合法选育头孢菌素C高产菌株的方法值得推广。     

生米卡链霉菌原生质体电融合重组研究

采用电融合新技术可提高生米卡链霉菌原生质体融合频率,并且在原生质体稳定液中加入2.5mol/L的MgCl_2,比使用PEG助融方法的融合频率高10倍。经过UV灭活高产菌株和另一脯氨酸缺陷型菌株的原生质体的电融合,其融合子的抗生素产量变异幅度大,发酵产物的各组份比例改变,经过选择获得了一新的高产菌株,麦迪霉素产量提高77％,其有效组份A_1比例增加。     

黑暗链霉菌原生质体融合

报道了黑暗链霉菌原生质体制备和融合的方法。将一原养型亲株原生质体经紫外线灭活2分钟,与另一苯丙氨酸缺陷型突变株原生质体等量混合,40％PEG处理,32℃保温3分钟,获得了重组后代,经分析,融合子的代谢产物中次组分的含量有所降低。     

应用基因组重排育种新方法筛选替考拉宁高产菌

本文以稀有放线菌替考游动放线菌SIIA 01-11-25为研究对象，探索稀有放线菌次级代谢产物产生菌的基因组重排育种的基本规律，重点研究四种产量标记亲本的筛选、稀有放线菌原生质体制备、融合、再生的方法、重组子筛选模型等关键技术，并运用建立的基因组重排方法，在1年内对替考游动放线菌进行了三轮基因组重排育种，共筛选了648株。结果表明SIIA05-3-136菌株为0．3％的乙酸钠＋0．8％的甘氨酸＋0．5％二甲胺的三重产量性状的融合菌株，其替考拉宁产量从原始株的1825u／ml提高到3016u／ml，增长65．3％，而传统的诱变育种方法达到此目标，通常需耗时3～4年筛选25000—30000株菌才能实现。目前SIIA05-3-136菌株已应用于中试生产。     

基因组重组技术选育埃博霉素B高产菌株

目的 用基因重组技术选育埃博霉素高产菌株.方法 本研究首先从不同生境中分离筛选到4株能产生埃博霉素B的纤维堆囊菌,以这些野生菌株作为Genome shuffling递归原生质体融合出发菌株.结果 通过五轮基因组重组成功选育到了3株遗传稳定的高产埃博霉素B重组菌株,其中一株重组菌株So F5-09的埃博霉素B产量达到了15.8mg/L,比原始出发菌株So 07-9埃博霉素B产量提高了35.1倍.结论 本研究证明使用野生菌株作为Genome shuffling递归原生质体融合出发菌株也能有效提高目标代谢产物的产量.     

诺西肽产生菌活跃链霉菌的原生质体制备与再生

目的研究诺西肽产生菌活跃链霉菌的原生质体制备与再生的最适条件。方法使用溶菌酶脱去细胞壁制备原生质体,并考察原生质体制备和再生的各种影响因素。结果确定了原生质体制备的条件:一级培养采用种子培养基,培养30 h,转种量的体积分数为5%;二级培养采用R2YE培养基,培养时间为32 h,最适甘氨酸质量浓度为6.0 g.L-1,最佳溶菌酶质量浓度为1.5 g.L-1,酶解时间为60 min,原生质体再生率达到5.3%。结论上述条件为活跃链霉菌原生质体制备与再生的最适条件,该条件的建立为活跃链霉菌原生质体的诱变育种奠定了基础。     

Protoplast fusion and gene recombination in the uncommon Actinomycete Planobispora rosea producing GE2270

An efficient method for protoplast generation for the uncommon actinomycete Planobispora rosea, the producer of the thiazolylpeptide antibiotic GE2270, was developed using a combination of hen egg white lysozyme and Streptomyces globisporus mutanolysin. This method converted more than 70% of vegetative mycelium to protoplasts, which were then regenerated with 50% efficiency in an optimized medium. When P. rosea protoplasts were efficiently fused, recombination between different antibiotic (streptomycin and gentamicin) resistance markers originated sensitive strains (str(s)gen(s)) at frequencies as high as 18% and double resistant fusants (str(r)gen(r)) at frequencies as high as 29%. Double resistant fusants showed GE2270 productivity intermediate between the productivity of the parental strains. Protoplast generation and fusion in P. rosea makes whole genome shuffling feasible as an approach to be used alternately with classical random mutagenesis in industrial strain improvement programs.     

原生质体ARTP诱变选育阿维拉霉素高产菌株

目的 筛选获得阿维拉霉素A含量高的菌株,进一步提高绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogene)发酵阿维拉霉素的水平。方法 对绿色产色链霉菌AVL4(S. viridochromogene AVL4)菌株原生质体制备及再生条件进行了优化,并在此基础上,采用ARTP诱变系统对其原生质体进行了诱变研究。结果 S. viridochromogene AVL4原生质体制备和再生的最佳条件为：以活化斜面转接至种子摇瓶培养24h的菌丝体为出发菌丝体,以SMM溶液作为渗透压稳定剂,采用12mg/mL的溶壁酶,30℃酶解反应60min。以原生质体为诱变对象,ARTP处理40s后的菌株经菌落形态初筛和摇瓶发酵复筛,获得一株编号S251的菌株,其摇瓶发酵阿维拉霉素的生物效价较出发菌株提高19.3%,其中,阿维拉霉素A占组分含量81%,较原始出发菌株AVL4含量提高6.4%,而且斜面连续转接五代遗传相对稳定。另外,成功实现变株S251的50L罐发酵验证,其产素水平最高达到4500U/mL,较对照菌株AVL4提高27.4%。结论 ARTP处理AVL4菌株原生质体,能够有效提高绿色产色链霉菌产阿维拉霉素的能力,获得的变株S251具有非常好的生产阿维拉霉素的工业化应用潜力。     

原生质体诱变及高通量筛选选育链霉素高产菌株

目的 通过诱变和筛选方法的研究，提高灰色链霉菌(Streptomyces griseus)生产链霉素的水平。方法 优化灰色链霉 菌的原生质体的生成和再生条件，并对得到的原生质体进行紫外诱变，然后利用微孔板高通量方式对获得菌株进行筛选。结果 经过诱变选育获得一株菌NP-11703，其链霉素产量在100L罐上比出发菌株提高了21.8%。结论 用紫外诱变原生质体，可以有 效提高灰色链霉菌产链霉素的能力。结合高通量筛选模型的应用，可大大加快高产菌株的筛选效率。     

活跃链霉菌nshA基因失活对那西肽发酵的影响

目的通过对活跃链霉菌那西肽生物合成基因簇中的nshA基因进行内部片段缺失,考察其对那西肽生物合成的影响。方法利用重叠延伸PCR(Gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)的方法失活nshA基因,并构建具有接合转移功能的大肠杆菌-链霉菌重组质粒pSH03,通过接合转移将重组质粒pSH03导入到活跃链霉菌细胞内,并通过同源交换形成活跃链霉菌基因组上的nshA基因失活。采用摇瓶进行发酵,采用HPLC的方法检测发酵液中诺西肽的含量。结果重组菌株的那西肽发酵产量较对照菌株有明显提高。结论 nshA基因对那西肽的生物合成有负调节作用,该基因的失活,有利于那西肽生物合成酶结构基因的表达,使诺西肽的产量有明显提高。     

Genetic transformation ofStreptomyces caespitosus

Genetic transformation ofStreptomyces caespitosus by plasmid pIj 702 was carried out. Optimal conditions for the protoplast preparation ofStreptomyces caespitosus, its regeneration, and its transformation by pIj 702 were evaluated. Addition of 2% glycine to the culture broth was optimal for protoplast yield. Formation and regeneration of protoplasts were most efficient when the mycelium were harvested at between late log and stationary growth phase. The regeneration frequency of the protoplasts was 15% when the protoplasts were regenerated on R2YE agar media containing 0.5M sucrose. Under the best condition for protoplats regeneration, the optimal transformation frequency was achieved with 40% polyethylene glycol (M.W. 4,000) treatment for 2 minutes.