补肾化痰法影响骨髓间充质干细胞成脂分化的实验研究

目的研究补肾法、化痰法、补肾化痰法对BMSCs成脂分化的影响,探讨补肾化痰法治疗骨质疏松症的可能作用机制。方法运用全骨髓贴壁法分离培养纯化Wistar大鼠BMSCs,诱导BMSCs成脂分化,观察补肾中药、化痰中药和补肾化痰中药分别对BMSCs成脂分化后细胞形态学、油红O染色及定量和用RT-PCR检测脂蛋白脂酶(LPL)mRNA表达的影响。结果化痰中药能使BMSCs诱导形成的脂肪细胞减少,并下调成脂相关基因LPL-mRNA表达。结论化痰法可以抑制BMSCs向脂肪细胞分化。     

补肾活血汤调控Runx2及Osterix促进BMSCs成骨分化的作用研究

目的:探讨补肾活血汤提高骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal cells,BMSCs)Runx2及Osterix基因表达,促进成骨分化的作用。方法:从双侧股骨和胫骨分离大鼠BMSCs并使用腺病毒载体转染BMSCs细胞,构建过表达Runx2细胞株,Q-PCR法对转染细胞株进行鉴定,CCK8法评价补肾活血汤对BMSCs活性的影响,ALP半定量活性检测法评价补肾活血汤对BMSCs成骨分化的影响,RT-PCR、Western Blot法检测补肾活血汤对成骨相关标志物Runx2和Osterix表达量的影响。结果:成功构建过表达Runx2的BMSCs细胞,补肾活血汤组在25μg/m-200μg/ml之内对细胞活性没有影响,与正常培养组比较补肾活血汤100μg/ml组ALP活性显著提高,与正常培养组比较补肾活血汤50μg/ml、100μg/ml组Runx2和Osterix的mRNA和蛋白相对表达量显著增加。结论:补肾活血汤能提高BMSCs中Runx2和Osterix的表达,促进成骨分化。     

左、右归丸对大鼠骨髓间充质干细胞成骨及成脂诱导的研究

目的:研究体外左、右归丸诱导大鼠骨髓充质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs)成骨及成脂的影响。方法:以左、右归丸水煎液和阳性对照药补佳乐、蒸馏水分别给予SD大鼠灌胃取血制备含药血清,分别加成骨和成脂诱导剂干预BMSCs,成骨诱导后采用改良钙钴法检测碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)表达,成脂诱导第10天油红O染色。结果:左、右归丸组与空白组比较,可显著提高细胞中ALP活性,促进钙化结节形成;左、右归丸可减少脂滴形成,降低细胞中甘油三酯含量。结论:左、右归丸对BMSCs分化的调节具有双向性,既促进BMSCs成骨分化同时又抑制BMSCs成脂分化。     

刘氏正骨方2号对过表达Sclerostin腺病毒转染后BMSCs促成骨分化的影响

目的探究刘氏正骨方2号对过表达Sclerostin腺病毒转染后BMSCs中Wnt信号通路及成骨相关因子的影响。方法分别用刘氏正骨方2号含药血清、BMP-2干预BMSCs,并分为对照组、中药组、BMP-2组,采用CCK-8法检测细胞活性,ALP染色、茜素红染色检测成骨诱导28 d后各组细胞ALP活性和矿化情况,荧光定量PCR、Western Blot法检测各组细胞中Col1A2、OCN、OPN、Sclerostin表达。采用腺病毒转染技术过表达BMSCs中Sclerostin基因,分为空白对照组、过表达Sclerostin组,再分别用空白血清、中药血清体外干预3 d后,检测Wnt信号通路相关分子(LRP5、β-catenin)和成骨相关因子Runx2的表达情况。结果与空白对照组比较,中药组BMSCs细胞活性及成骨分化程度增强,BMP-2组成骨分化程度高于中药组,但BMP-2组细胞活性最低(P0.05);在Sclerostin基因表达方面,中药组出现表达抑制,而BMP-2组呈上调趋势(P0.05)。腺病毒转染BMSCs可抑制BMSCs细胞活性,上调Sclerostin mRNA和蛋白表达。与NT比较,Ad-SOST组细胞活性降低,LRP5、β-catenin、Runx2表达下调(P0.05);与空白血清比较,中药血清干预后NT组、Ad-SOST组细胞活性不同程度增强,而LRP5、β-catenin、Runx2表达上调(P0.05)。结论刘氏正骨方2号具有增强BMSCs细胞活性、促进成骨分化作用,可影响过表达Sclerostin腺病毒转染后BMSCs的LRP5、β-catenin、Runx2表达。     

老鹳草素对小鼠骨髓基质干细胞成骨分化相关基因表达的影响

目的:观察老鹳草素对小鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化的影响,并对成骨分化过程中相关基因表达进行检测。方法:分离、培养小鼠BMSCs,加入不同浓度老鹳草素(1×10-9,1×10-8,1×10-7mol·L-1)培养,另设空白组,分别于成骨诱导第7,14天采用碱性磷酸酶(ALP),骨钙素(OCN)试剂盒测定ALP活性及OCN含量,并进行ALP染色。于成骨诱导第21天时采用茜素红染色检测成骨分化过程中钙结节形成数量,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)检测BMSCs成骨分化过程中OCN,ALP,骨涎蛋白(BSP),Runt相关转录因子2(Runx2)mRNA和蛋白表达的变化。结果:与空白组比较,成骨诱导后第7,14天时,老鹳草素各剂量组ALP活性,OCN含量及ALP染色强度均明显升高(P0.05),成骨诱导第21天时,老鹳草素各剂量组矿化结节数量及OCN,ALP,BSP,Runx2 mRNA和蛋白表达均明显升高(P0.05)。结论:老鹳草素能够明显促进BMSCs向成骨方向分化,成骨相关基因OCN,ALP,BSP,Runx2均参与这一过程。     

刘氏正骨方对BMSCs成骨分化中Wnt信号通路及Sclerostin基因的影响

目的探究刘氏正骨方对骨髓间充质干细胞成骨分化中Wnt信号通路的影响。方法使用刘氏正骨方含药血清或BMP-2对骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行28 d成骨诱导后,检测BMSCs的细胞活性、ALP活性及细胞矿化情况;采用RT-PCR和Western blotting法检测细胞中Col 1A2、OCN、OPN和Sclerostin基因表达情况。使用含2.5%、5%、10%中药血清对BMSCs进行14 d体外干预,检测Wnt信号通路关键因子LRP5、Sclerostin及成骨关键转录因子Runx2的表达情况。结果1)中药组和BMP-2组中BMSCs中ALP活性及细胞矿化现象明显强于对照组,且中药组明显高于BMP-2组(P<0.05);Col1A2、OCN、OPN的表达也呈现相同趋势改变(P<0.05),但Sclerostin基因呈现明显表达下调(P<0.05)。2)高浓度中药血清可上调LRP5和Runx2表达(P<0.05),下调Sclerostin基因表达(P<0.05)。结论刘氏正骨方可以促进BMSCs体外成骨分化,其作用机制可能与下调Sclerostin基因表达、激活Wnt信号通路有关。     

健骨益痹方含药血清对骨髓间充质干细胞体外增殖及成骨分化的影响

目的观察健骨益痹含药血清对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和成骨分化的影响。方法分离BMSCs分为空白对照组(A组)、低浓度组(B组)、中浓度组(C组)、高浓度组(D组)、阳性对照组(E组),通过MTT法检测健骨益痹含药血清对BMSCs活性的影响,于干预后的第3、6、9、12天分别测定细胞碱性磷酸酶(ALP)活性;茜素红染色法染色并观察钙结节密度;RT-PCR法检测ColⅠ、BGP、RUNX2mRNA转录表达。结果与对照组比较,实验组经定向成骨诱导后BMSCs增殖增强,ALP水平升高,钙结节密度显著增大,成骨相关转录因子ColⅠ、BGP、RUNX2的表达量亦增加(P0.05)。结论健骨益痹复方含药血清能促进BMSCs体外增殖并诱导其成骨分化。     

补肾、健脾和补肾健脾3方对尾部悬吊大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的：观察补肾、健脾和补肾健脾3方对尾部悬吊模拟失重大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响。方法：大鼠随机分为正常组、模型组、补肾组、健脾组和补肾健脾组共5组。后4组大鼠头低位-30°尾部悬吊连续21天,补肾、健脾和补肾健脾组大鼠从实验第1天开始分别给予补肾、健脾和补肾健脾方灌胃,其余各组大鼠灌服等容积的生理盐水。实验第22天处死各组大鼠,全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,取第3代细胞进行成骨分化诱导实验,成骨分化诱导第4、7、10天采用p-NPP法检测碱性磷酸酶（ALP）活性,成骨分化诱导第7、14、21天采用ELISA法检测细胞上清液中骨钙素（OC）含量,成骨分化诱导第21天茜素红染色法检测钙结节形成情况。结果：与正常组比较,模型组大鼠BMSCs经成骨诱导4、7、10天ALP活性均显著降低（P<0.01）,经成骨诱导7、14、21天细胞上清OC含量显著降低（P<0.01）,经成骨诱导21天后钙结节形成显著减少（P<0.01）;与模型组比较,补肾组和补肾健脾组大鼠BMSCs经成骨诱导4、7、10天ALP活性均明显升高（P<0.05或P<0.01）,健脾组大鼠BMSCs经成骨诱导7、10天ALP活性均明显升高（P<0.05）,补肾、健脾和补肾健脾组大鼠BMSCs经成骨诱导7、14、21天细胞上清OC含量明显升高（P<0.05或P<0.01）,经成骨诱导21天后钙结节形成显著增多（P<0.01）;与补肾组比较,健脾组大鼠BMSCs经成骨诱导7天ALP活性降低、经成骨诱导21天细胞上清OC含量明显降低（P<0.05）,而补肾健脾组明显升高（P<0.05）,经成骨诱导21天后补肾健脾组钙结节形成明显增多（P<0.05）。结论：补肾、健脾和补肾健脾3方具有促进尾部悬吊模拟失重大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的作用,以补肾健脾方作用为优。     

健脾补肾方含药血清对体外培养的兔骨髓间充质干细胞定向分化的影响

目的:观察健脾补肾方含药血清对体外培养的兔骨髓间充质干细胞(rMSCs)定向分化的影响,揭示本方临床应用防治激素性股骨头坏死的药理机制。方法:以健脾补肾方含药血清作用于体外培养的rMSCs,通过对碱性磷酸酶(ALP)活性的的动态检测结果和四环素荧光标记的矿化结节的出现数量作为分析各组诱导液能否诱导rMSCs分化为成骨细胞以及促进骨向分化强度的指标。结果:rMSCs培养的第12天,健脾补肾组ALP活性高于空白对照组(P0.05);从第8天之后,健脾补肾加成骨组ALP活性高于成骨组(P0.05);更换相应培养液22d后,其余3组形成的钙结节数量明显多于空白对照组(P0.01);健脾补肾加成骨组钙结节数量多于成骨组(P0.05)。结论:健脾补肾方含药血清可以促进rMSCs的骨向分化,且与经典的成骨诱导剂合用具有协同作用。这可能揭示了临床应用该方防治激素性股骨头坏死(SINFH)的细胞学机制。     

淫羊藿苷对骨髓间充质干细胞骨向诱导的实验研究

目的通过研究淫羊藿苷(icariin,ICA)对骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BM-SCs)增殖和骨向分化能力的影响,并观察其促BMSCs骨向分化过程中对细胞因子转化生长因子β1(TGF-β1)、骨形成蛋白-2(BMP-2)表达的影响,分析可能的作用途径,为阐释其防治骨质疏松(osteoporosis,OP)的作用机理提供实验依据,并为以TGF-β1、BMP-2作为筛选防治OP药物进行实验研究。方法以碱性磷酸酶(ALP)等指标确定干预药物不同浓度梯度中最佳促BMSCs骨向分化剂量;分组实验,通过检测诱导分化过程中ALP和钙化结节等指标的表达,来观察其对BMSCs骨向分化能力的影响;采用ELISA法检测骨向分化过程中TGF-β1、BMP-2的表达。结果(1)ICA最佳促BMSCs骨向分化浓度为1×10-9mol/L。ICA10-9组能促进成骨指标的表达和TGF-β1和BMP-2分泌增加;(2)能促BMSCs骨向分化能力的ICA各诱导组均伴随TGF-β1和BMP-2分泌增加。结论ICA能促进BMSCs骨向分化;在BMSCs骨向分化过程中,上调TGF-β、BMP-2的表达量可能是各干预药物促进BMSCs骨向分化的作用机制之一。     

补肾通络方通过抑制chemerin及炎性因子干预骨质疏松症的机制研究

目的评价补肾通络方对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨、成脂分化以及小鼠单核巨噬细胞RAW264.7破骨分化模型的干预作用,并探究其调节骨形成及骨吸收的相关机制。方法分别给予补肾方、通络方和补肾通络方进行干预,采用茜素红染色法鉴定BMSCs成骨分化后各组钙结节形成情况;采用油红O染色鉴定BMSCs成脂分化后各组脂滴形成情况;采用q RT-PCR法检测BMSCs成骨、成脂分化后各组成骨、成脂分化标志基因m RNA表达,成骨、成脂分化过程和炎症模型中chemerinm RNA表达;采用ELISA法检测BMSCs成骨、成脂分化过程和炎症模型中各组chemerin分泌量。采用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant alkaline phosphatase,TRAP)染色鉴定各组RAW264.7细胞破骨分化程度,并测定各组TRAP活性;采用Westernblotting法检测RAW264.7细胞破骨分化中各组TRAP蛋白表达情况;采用q RT-PCR法及ELISA法检测RAW264.7细胞破骨分化后各组chemerin、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)及肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)mRNA表达及分泌。结果与对照组比较,补肾通络方组钙结节显著增多(P0.01),脂滴显著减少(P0.01),成骨分化标志基因表达显著升高(P0.01),成脂分化标志基因表达显著下降(P0.05),chemerin分泌及基因表达在成骨分化第3天及成脂分化第3、7天显著下降(P0.05、0.01)。与对照组比较,BMSCs炎症模型chemerin分泌及基因表达显著升高(P0.01);与BMSCs炎症模型比较,补肾通络方组chemerin分泌及基因表达显著下降(P0.01)。与对照组比较,RAW264.7细胞破骨分化中TRAP阳性细胞、活力、蛋白表达以及IL-6、TNF-α分泌与基因表达均显著升高(P0.05、0.01);与模型组比较,补肾通络方组TRAP阳性细胞、活力、蛋白表达以及IL-6、TNF-α分泌与基因表达显著降低(P0.01)。结论补肾通络方可通过抑制chemerin及炎症因子来调节成骨、成脂分化及破骨细胞分化,从而促进骨形成、抑制骨吸收、改善骨质疏松症。     

不同剂量健腰密骨片对骨形成和小鼠骨髓间充质干细胞中BMP-7表达的影响

目的探讨不同剂量健腰密骨片对小鼠椎体和骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSCs)成骨分化过程中骨形态发生蛋白-7(bone morphogenic protein-7,BMP-7)表达的影响。方法选取1月龄昆明小鼠48只,雌雄各半,按体质量随机分为健腰密骨片高、中、低剂量组及生理盐水4组,灌胃8周后取材。用Micro-CT扫描分析L4腰椎,免疫组化染色观察不同剂量健腰密骨片对椎体BMP-7表达的影响;分离培养获得各组小鼠原代骨髓间充质干细胞(BMSCs),利用碱性磷酸酶(ALP)染色、实时荧光定量RT-PCR法检测BMSCs成骨分化过程中BMP-7的表达情况。结果与生理盐水组比较,健腰密骨片高剂量组能够改善小鼠椎体三维结构,促进椎体BMP-7蛋白的表达;健腰密骨片高剂量组能够明显增加BMSCs中ALP活性,上调成骨基因BMP-7 mRNA的表达量(P0.05)。结论健腰密骨片高剂量组能够明显提高小鼠椎体骨量,促进BMSCs成骨分化,上调椎体和BMSCs成骨分化过程中BMP-7表达,从而促进骨形成。     

淫羊藿苷促SD大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化作用的实验研究

目的观察淫羊藿苷促SD大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)骨向分化的作用特点。方法 (1)采用机械分离及全骨髓贴壁法分离培养SD大鼠BMSCs,氨基安替吡啉测酚法检测不同浓度的淫羊藿苷在第3、6、9、12、15、18、21天对细胞上清液中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的影响,采用茜素红染色法检测各浓度组BMSCs矿化情况,观察不同浓度的淫羊藿苷促BMSCs骨向分化的作用。(2)将BMSCs细胞分为空白对照组、成骨诱导组及淫羊藿苷组(0.5μg/m L),在培养第7、14、21天检测各组细胞上清ALP活性,并于第14及21天分别检测各组细胞ALP阳性染色率与矿化结节数,同时采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)法检测3个不同时间点各组细胞中核心结合蛋白因子(Runt-related transcripition factor-2,Runx2)及骨钙素(Osteocalcin)mRNA的表达水平。结果 (1)0.05~5.0μg/m L淫羊藿苷均可明显提高细胞上清液中ALP活性,其中0.2~2.0μg/m L浓度组细胞结节数亦明显增加(P0.01)。(2)淫羊藿苷促BMSCs骨向分化时,Runx2 mRNA表达水平及ALP活性均先升后降;Osteocalcin mRNA表达水平则持续上升(P0.01);与成骨诱导组比较,作用14天后,淫羊藿苷组ALP活性及ALP阳性染色率均明显提高(P0.05,P0.01)。结论淫羊藿苷通过上调Runx2基因的表达,促使BMSCs向成骨细胞分化,并通过增加细胞ALP分泌及Osteocalcin基因的表达,促进细胞矿化的发生,从而促使新生成骨细胞的成熟。     

槲皮素通过抑制 lncRNA DANCR 的表达促进 骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化

〔摘 要〕 目的：前期研究发现槲皮素可促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖和成骨分化,但其调控机制尚不 完全清楚。长链非编码 RNA（lncRNA）分化拮抗非蛋白质编码 RNA（DANCR）能够抑制 BMSCs 的增殖和成骨分化。 本研究进一步研究槲皮素是否能通过调控 DANCR 的表达促进 BMSCs 的增殖和成骨分化。方法：BMSCs 在添加了 10 μmol·L-1 槲皮素的完全培养基中培养。细胞计数试剂 –8（CCK–8）试剂盒检测 BMSCs 的增殖;采用碱性磷酸酶 （ALP）分析试剂盒测定 ALP 活性;荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测 DANCR、骨形态发生蛋白 2（BMP–2）、 runt 相关转录因子 2（RUNX2）以及骨钙素（osteocalcin）的表达。结果：槲皮素处理能够增强 BMSCs 增殖、ALP 活性以及 BMP–2、RUNX2 和 osteocalcin 表达。与成骨分化培养基诱导组（阳性对照组）相比,槲皮素组能够更好的 维持 BMSCs 的增殖,但是诱导 BMSCs 成骨分化的效果显著降低。进一步研究表明槲皮素诱导的 BMSCs 成骨分化过 程中 DANCR 的表达显著降低。过表达 DANCR 能够逆转槲皮素对 BMSCs 增殖和成骨分化。结论：槲皮素通过抑制 DANCR 的表达促进 BMSCs 的增殖和成骨分化。     

异补骨脂素对体外培养骨髓间充质干细胞增殖与成骨性分化的研究

目的:研究异补骨脂素对体外培养大鼠骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs)增殖与成骨性分化的影响.方法:取大鼠股骨及胫骨全骨髓,利用全骨髓贴壁培养法培养单核层细胞,培养于含10% FBS的DMEM-F12培养液中,3d后首次换液,9d后成骨性诱导培养并用药物干预.异补骨脂素在培养基中终浓度分别为1×10-4,1×10-5,1×10-6,1×10-7 mol·L-1.增殖分析采用MTT法,于成骨性诱导培养第4,8,12,16天测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、钙盐沉积量、骨钙素分泌量,第15天进行ALP和钙化结节组织化学染色及计数.成骨性诱导后不同时间点提取总RNA,Real-time RT-PCR法检测bFGF,IGF-1,Osterix与Runx-2等成骨性相关的基因表达情况.结果:异补骨脂素剂量依赖性抑制BMSCs增殖,但能促进其成骨性分化,表现为提高BMSCs的ALP活性、促进骨钙素分泌、钙盐沉积量、增加钙化结节数量、提高bFGF,IGF-1,Osterix,Runx-2 mRNA表达水平.结论:终浓度为1×10-5 mol·L-1异补骨脂素能显著促进BMSCs的成骨性分化,证明异补骨脂素是中药补骨脂中抗骨质疏松的有效成分.     

复叶耳蕨总黄酮通过BMP信号通路促进MSC成骨分化

目的:研究复叶耳蕨总黄酮(total flavonoids from Arachniodes exilis,TFA)对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的作用及其分子机制。方法:通过茜素红染色、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性考查BMSCs成骨情况;RT-PCR检测Ⅰ型胶原酶α1(collagen typeⅠα1,COL1A1)、骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopotin,OPN)、BMP2、BMP4、Runx2、Osterix转录水平;ELISA检测骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)信号通路相关蛋白BMP2、BMP4、Runx2表达情况。结果:TFA能显著增加BMSCs碱钙结节的形成、ALP活性,上调COL1A1、OCN、OPN的表达,促进BMSCs成骨分化,而Noggin能抑制该作用;TFA能显著上调BMP2、BMP4、Runx2、Osterix的表达。结论:TFA可能通过BMP信号通路促进大鼠BMSCs成骨分化。     

中西医联合诱导大鼠BMSCs增殖、骨向分化能力的研究

目的:探讨补肾益髓中药含药血清、转化生长因子-β1(TGF-β1)、骨形态发生蛋白2(BMP-2)联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖、骨向分化能力的研究。方法:采用全骨髓贴壁法分离及培养大鼠BMSCs。补肾益髓中药含药血清、TGF-β1及BMP-2的制备并确定最佳促BMSCs增殖、骨向分化添加浓度。实验分组:空白组、血清组、TGF-β1组、血清+TGF-β1组、BMP-2组、血清+BMP-2组、TGF-β1+BMP-2组、综合诱导组,酶联免疫分析检测Coll、BGP浓度。结果:TGF-β1最佳促BMSCs增殖浓度为10 ng/m L,BMP-2最佳促BMSCs骨向分化浓度是40 ng/m L;综合诱导组能明显促进大鼠BMSCs的I型胶原(Coll)、骨钙素(BGP)的表达量。结论:中西医联合诱导能够显著提高大鼠BMSCs增殖、骨向分化能力。     

左归丸调控miR34a对BMSCs成骨分化能力的影响

目的:探究左归丸调控miR34a对BMSCs成骨分化能力的影响。方法:培养BMSCs,分别用大鼠高、低剂量左归丸含药血清和对照血清干预BMSCs成骨分化过程。采用CCK8检测左归丸对BMSCs的增殖、毒性作用,AKP活性检测BMSCs成骨分化活性,ALP染色检测细胞成骨分化能力,反转录-实时荧光定量技术(RT-q PCR)检测miR34a、Tgif2、Runx2、PPARγmRNA表达;Western-blotting检测Tgif2、RUNX2蛋白表达。结果:CCK8检测发现:随着时间的增加,从第1天到第7天,BMSCs增殖呈上升趋势,各组间增加程度无统计学差异;7~14 d,BMSCs增殖呈下降趋势。AKP活性检测示,干预BMSCs 3 d后,左高组AKP活性显著高于其余两组(P0.05);7 d时,左低、左高组AKP活性均显著高于对照组(P0.001)。干预3 d时,ALP染色结果示,左高组ALP染色阳性率高于其余两组;干预7 d时,左高、左低组ALP染色阳性率显著高于对照组。干预3 d时,左高、左低组miR34a mRNA表达较对照组上调,Tgif2、PPARγ2 mRNA表达较对照组下调;干预7 d后,左高组miR34a mRNA表达较对照组显著上调(P0.05);左低、左高组Tgif2 mRNA表达均较对照组显著下调(P0.05);左高组PPARγ2 mRNA表达较对照组显著下调(P0.01);干预3 d后,左高组Tgif2蛋白水平较对照组显著降低(P0.01);而左低组Runx2蛋白水平较对照组显著升高(P0.01);干预7 d后,左低、左高组Tgif2蛋白水平较对照组显著降低(P0.001),而左低、左高组Runx2蛋白水平较对照组显著升高(P0.05)。结论:左归丸具有促进BMSCs增殖及成骨分化的作用,其机制可能是通过上调miR34a,抑制其靶基因Tgif2表达,同时下调成脂相关因子PPRAγ和上调成骨核转录因子Runx2。     

健脾活骨方不同提取部位对骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响

目的观察健脾活骨方不同提取部位对体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及成骨、成脂分化的影响,对其健脾作用的有效部位进行初步筛选。方法采用全骨髓贴壁筛选培养法分离BMSCs,给予健脾活骨方不同提取部位(水、氯仿、正丁醇和乙酸乙酯萃取部位)作用一定时间后,MTS法检测细胞增殖,碱性磷酸酶(ALP)染色检测ALP活性,茜素红(ARS)染色检测钙结节的形成,油红O染色检测脂肪细胞的形成。结果健脾活骨方不同提取部位均能不同程度促进BMSCs的增殖,其强度依次为水、氯仿、正丁醇和乙酸乙酯部位;ALP染色结果显示,促进ALP表达的强度依次为水、乙酸乙酯、氯仿和正丁醇部位;ARS染色结果显示,促进钙结节的形成作用强度依次为水、氯仿、正丁醇和乙酸乙酯部位;油红O染色结果显示,抑制脂肪细胞形成的作用强度依次为乙酸乙酯、水、氯仿和正丁醇部位。结论健脾活骨方不同提取部位对BMSCs增殖和分化的影响不同,水部位促进增殖和成骨分化作用最强,乙酸乙酯抑制脂肪细胞形成作用最佳。     

补肾活血汤含药血清对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

【目的】探讨补肾活血汤促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外成骨细胞分化的能力。【方法】用不同浓度的补肾活血汤含药血清干预BMSCs,7d后应用4-硝基苯基磷酸二钠盐（PNPP）偶氮法测定碱性磷酸酶（ALP）活性,21d后行茜素红染色（ARS）观察钙盐沉积情况判定成骨能力,实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）法检测Runx相关转录因子2（Runx2）、骨钙素（OCN）、骨桥蛋白（OPN）的基因表达以评估成骨能力。【结果】与空白血清组比较,补肾活血汤低、中、高剂量血清组BMSCs的ALP活性、茜素红染色面积及Runx2、OCN、OPN基因表达水平均升高（P<0.05或P<0.01）。【结论】补肾活血汤可促进BMSCs向成骨细胞分化,其机制可能与上调Runx-2、OCN、OPN表达有关。