涂布介入器械的人血管内皮生长因子真核表达载体的构建

目的：构建可涂布于介入器械的人血管内皮生长因子（VEGF）真核表达载体。 方法：根据人VEGFA（NM_001025366）目的序列设计引物制备目的基因及载体,双酶切载体pIRES2-ZsGreen1和目的基因homo VEGFA进行连接后转化入大肠杆菌,构建质粒pIRES2-ZsGreen1-homo-VEGFA并测序鉴定。 结果：目的基因VEGFA已连接到载体pIRES2-ZsGreen1,大小约1400 bp,与人VEGFA（NM_001025366）目的序列比对结果一致,未见变异。质粒pIRES2-ZsGreen1-homo-VEGFA构建成功。 结论：成功构建重组人血管内皮生长因子真核表达载体,可用于涂布介入器械表面进行下一步实验。     

串联siRNA对SW480细胞中增殖诱导配体基因表达的影响

目的分析串联siRNA在SW480细胞中对增殖诱导配体(APRIL)基因的作用效果,探讨串联siRNA对APRIL基因表达的应用价值。方法设计筛选4条针对于APRIL基因的shRNA片段(即sh644、sh1938、sh1451、sh2231),分别将其与pGenesil-1.1质粒表达载体连接,形成4个单一表达载体(pGsh644、pGsh1938、pGsh1451、pGsh2231),同时将4条shRNA与pGenesil4-T质粒连接,共同构成pG4串联siRNA表达载体。应用阳离子脂质体法对结直肠癌细胞株SW480进行转染。采用实时荧光定量PCR以及Western blot法对SW480细胞的APRIL mRNA和蛋白表达进行检测。结果酶切及测序证实串联siRNA质粒载体构建成功。siRNA能够抑制SW480细胞APRIL基因表达,pG4组APRIL mRNA抑制率为77.72%,蛋白质表达抑制率为84.74%,显著高于其他质粒,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论串联siRNA表达载体能够抑制结直肠癌SW480细胞株的APRIL基因表达,为结直肠癌APRIL基因治疗提供基础。     

重组腺病毒介导的血管内皮生长因子165在大鼠骨髓基质细胞中的表达

目的 利用AdEasy腺病毒载体系统构建携带血管内皮生长因子165(VEGF165)的重组腺病毒(Ad-VEGF165),并观察Ad-VEGF165转染大鼠骨髓基质细胞(bMSCs)后VEGF165的表达情况. 方法 将PCR获取的VEGF165目的 基因插入到pAATrackCMV中,构建腺病毒穿梭质粒pAdTrack-VEGF165,经Pme I酶切线性化后,采用电穿孔法转化到含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌感受态细胞中,挑选同源重组菌落.提取质粒并用Pac I酶切鉴定.线性化重组质粒pAdEasy-VEGF165转染293T细胞,包装成重组腺病毒颗粒.并扩增收集重组腺病毒,测定病毒滴度.体外培养大鼠骨髓基质细胞,Ad-VEGF165转染骨髓基质细胞,转染后在荧光显微镜下观察.转染的骨髓基质细胞采用RT-PCR和ELISA法检测VFGF165的表达水平. 结果 经酶切鉴定,基因测序及绿色荧光观察证实成功构建了携带VEGF165基因的重组腺病毒,并扩增出109pfu/ml的高滴度重组腺病毒.Ad-VEGF165转染骨髓基质细胞后,RT PCR证明转染的骨髓基质细胞内有VEGF165mRNA表达.ELISA检测发现转染组上清液中VEGF165蛋白分泌量明显高于对照组(P＜0.01). 结论 pAdEasy-VEGF165转染对骨髓基质细胞的增殖能力无明显影响,而且骨髓基质细胞能够表达并分泌VFGF165为研究骨组织工程血管化局部基因治疗奠定了基础.     

神经特异性转录因子DAT1绿荧光蛋白表达载体的构建及其在C8细胞中的表达定位

目的：构建神经特异性转录因子DAT1与绿荧光蛋白融合表达的表达载体，并检测其在C8星形胶质细胞中的表达。方法：采用基因重组技术将DAT1基因和绿色荧光蛋白基因融合，构建绿荧光蛋白表达载体pEGFP—C1-DAT1，测序验证序列无误后。用脂质体法将重组质粒转入C8细胞，荧光显微镜观察DAT1的表达及定位。结果：测序验证结果表明，重组质粒含有DAT1全长编码序列，转染实验表明EGFP—DAT1能在C8细胞中正确表达，且：DAT1蛋白主要定位于细胞核中。结论：DAT1全长cDNA基因绿色荧光蛋白表达载体构建成功，在C8细胞中可以正确表达，为进一步研究DAT1的功能奠定了基础。     

tTSF基因的酵母表达及其基因治疗研究

目的 选择PF4，TSP1的高活性片段及肿瘤细胞靶向肽，设计合成融合基因—tTSF，进行酵母表达及小鼠基因治疗研究。方法 根据PF4和TSP1的抑制血管生成高活性片段设计合成TSF基因，并在N-端接上肿瘤细胞靶向肽，设计合成了tTSF。将tTSF基因构建到pPIC9质粒，重组质粒pPIC9／tTSF转化GSll5酵母菌株进行表达，并检测表达产物对血管内皮细胞生长的抑制作用。将tTSF基因克隆到pcDNA3．1（＋）载体，重组质粒pcDNA3．1（＋）／tTSF通过皮下注射治疗C57BL／6小鼠移植肿瘤Lewis肺癌。结果 重组质粒pPIC9／tTSF转化GSll5酵母菌株后，获得了tTSF的高效表达，表达产物对血管内皮细胞生长产生明显的抑制作用；皮下注射重组质粒pcDNA3．1（＋）／tTSF后，C57BL／6小鼠移植肿瘤Lewis肺癌的生长受到明显抑制。结论 tTSF基因设计成功，其酵母表达产物对血管内皮细胞生长产生具有明显的抑制作用，tTSF基因的体内基因治疗也具有显著的抗肿瘤效应。     

重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-EGFP的构建与鉴定

目的人血管内皮生长因子（的hVEGF165）为靶基因,增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因构建体的复制缺陷型腺病毒载体,为基因治疗牙周进一步再生奠定了基础。方法质粒的pDC316-的VEGF165为模板,PCR扩增基因片段进行消化,获得的hVEGF165用于连接到含有绿色荧光蛋白标记基因重组质粒的消化方法的pDC316-MCMV-EGFP质粒载体,PCR鉴定和双酶切证实成功构建重组质粒;使用ADMAX包装系统,改造的质粒共转染用质粒骨架293包装细胞系和重组病毒的扩增;扩增病毒的离子交换纯化;TCID50测定病毒粒子和效价的数目;的荧光的荧光显微镜重组腺病毒表达。结果 PCR鉴定,酶切分析和测序证实成功构建人VEGF基因的携带绿色荧光蛋白标记（的hVEGF165）重组质粒的pDC316-的hVEGF165-MCMV-EGFP和同源重组腺病毒Ad5的-的hVEGF165-EGFP的成功。扩增和纯化后,腺病毒颗粒的数量测量5.4×1011VP/mL,约2.0,为1.8×1010CCID50/mL的滴度OD260/OD280值。结论成功构建携带hVEGF165基因重组腺病毒载体Ad5-hVEGF165-EGFP并获得高滴度病毒颗粒,为hVEGF165基因功能研究以及细胞移植、基因治疗提供有效的工具。     

靶向HBV C基因的siRNA在HepG2.2.15细胞中对HBV的抑制作用

目的研究靶向HBV C基因的短发夹状RNA(shRNA)表达质粒对HepG2.2.15细胞中HBV的抑制作用。方法设计构建两个靶向HBV C基因的shRNA表达质粒S1和S2,以及用于对照的非同源shRNA表达质粒S3。转染HepG2.2.15细胞后,通过RT-PCR和ELISA方法分别检测细胞中HBV C基因表达和细胞上清中HBV DNA、HBsAg和HBeAg表达。结果在转染后24 h时,HBV C基因mRNA表达量下降58%～83%,HBV DNA下降了2.44～3.36个log值,HBsAg和HBeAg的表达水平分别降低了51%～79%和50%～77%。S1、S2联合运用可以提高对HBV的抑制作用,而S3无抑制效果。结论靶向HBV C基因的shRNA表达质粒S1、S2及其联合运用,均能有效地抑制HepG2.2.15细胞中HBV的复制和表达。     

敲低SET7慢病毒载体的构建及对乳腺癌细胞生长的影响

目的：为了探讨组蛋白甲基转移酶SET7在乳腺癌发生发展中的功能,构建SET7基因的RNA干扰（ RNAi）慢病毒表达载体,研究其对乳腺癌细胞ZR75－1生长的影响。方法根据人SET7的cDNA序列,设计SET7基因短发夹RNA（shRNA）引物,并克隆到pSIH－H1－Puro载体上,包装成慢病毒,感染人乳腺癌细胞ZR75－1,通过实时定量（ real－time） PCR以及Western印迹检测干扰效果,并通过生长曲线研究敲低SET7对ZR75－1细胞生长的影响。结果 DNA测序结果表明,SET7 shRNA慢病毒表达载体构建成功。实时定量PCR和Western印迹结果显示, SET7 shRNA能有效抑制SET7基因的表达。生长曲线实验表明,敲低SET7可抑制人乳腺癌细胞ZR75－1的生长。结论成功构建了SET7 shRNA慢病毒表达载体,感染人乳腺癌细胞ZR75－1后,有效抑制了内源SET7基因的表达,敲低SET7能抑制ZR75－1细胞的生长,为进一步研究SET7在乳腺癌中的功能奠定了基础。     

载体介导的siRNA对SGC-7901胃癌细胞中hPOT1表达的抑制作用

目的构建人端粒保护蛋白（hPOT1）基因的短链干扰核糖核酸（siRNA）表达载体，观察其在胃癌细胞中抑制hPOT1基因表达的作用，为进一步研究hPOT1在胃癌细胞生长增殖中的作用打下基础。方法设计并化学合成64nt编码hPOT1 siRNA基因片段的寡核苷酸，退火成双链后将其连接到pSUPER质粒的H1 RNA启动子下游，构建psiRNA-hPOT1重组质粒。经酶切、测序鉴定后，用脂质体介导的基因转染方法，转人SGC-7901胃癌细胞，用半定量RT-PCR检测hPOT1表达水平的变化。结果测序结果表明重组质粒psiRNA-hPOT1 64个碱基成功插人到预定位置，并且序列完全一致。hPOT1 siRNA表达载体psiRNA-hPOT1转入胃癌细胞后，可明显抑制SGC-7901细胞hPOT1的表达。结论构建的hPOT1基因的siRNA表达载体psiRNA-hPOT1重组质粒能显著抑制hPOT1基因在SGC-7901胃癌细胞中的表达。     

shRNA抑制GC-C基因表达对人胃癌SGC-7901细胞生物学功能的影响

目的 研究靶向鸟苷酸环化酶C(GC-C)的短发夹RNA(shRNA)对人胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡和细胞周期等生物学功能的影响.方法 构建针对人GC-C基因的shRNA真核表达载体,将其转染人人胃癌SGC-7901细胞,采用半定量RT-PCR和Westem blotting法检测细胞中GC-C在mRNA和蛋白水平的变化.以CCK-8法、流式细胞术和原位末端标记法检测转染GC-CshRNA真核表达载体的SGC-7901细胞增殖、凋亡及细胞周期等生物学指标的变化.结果 经DNA测序鉴定,所得到的表达载体插入片段序列与GenBank中的序列一致.shRNA-GC-C真核表达载体转染能有效抑制GC-C基因的表达,以shRNA-GC-CⅢ序列的抑制效果最佳.转染GC-C shRNA真核表达载体后SGC-7901细胞的增殖能力受到抑制(P<0.05);细胞形态发生改变,细胞体积缩小,核固缩,染色质浓缩聚集于核膜;流式细胞术检测显示G7峰前出现亚二倍体峰,转染48、72h后凋亡率分别为5.47%和5.63%(P<0.05).结论 靶向GC-C基因的shRNA可有效抑制人胃癌SGC-7901细胞生长,并促进细胞凋亡,该作用与下调靶基因GC-C的表达有关;GC-C可能是胃癌治疗的一个潜在靶点.     

运动对自发性高血压大鼠心肌血管内皮生长因子及其基因表达的影响

为探讨血管内皮生长因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ,ＶＥＧＦ）是否参与运动改善高血压性心肌肥大机制,采用免疫组化和分子杂交方法,研究了自发性高血压大鼠（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ　ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ　ｒａｔｓ,ＳＨＲ）游泳运动后心肌细胞ＶＧＥＦ及其基因表达的改变。免疫组化结果表明,ＳＨＲ经１０周游泳后,心肌细胞浆内ＶＥＧＦ特异染色颗粒比安静ＳＨＲ明显增多。Ｎｏｒｔｈｅｍ分子杂交结果表明,ＳＨＲ运动后心肌ＶＥＧＦ　ｍＲＮＡ表达比安静ＳＨＲ降低。目前对这一结果的生理意义还不清楚,推测可能与改善高血压肥大心肌间质血管增生机制有关。     

紫外线通过诱导TNF-α胞内聚集间接调控VEGF分泌表达

目的 探讨紫外线(UVB)反应中TNF-α在介导VEGF诱导表达中的作用.方法 采用TNF-α特异性shRNA转染小鼠成纤维细胞(MEFs)并建立稳定细胞株;RT-PCR方法验证TNF-α shRNA的有效性;荧光素酶报道分析系统检测vegf基因启动子活性;ELISA方法检测VEGF的分泌表达水平.结果 本课题组构建的TNF-α shRNA能够有效抑制UVB刺激作用下TNF-α的诱导表达;同样条件下,UVB诱导vegf基因启动子活性上调趋势被TNF-α shRNA显著抑制;同时VEGF的胞外分泌表达水平明显下降.结论 UVB反应中TNF-α可间接介导VEGF的诱导表达.     

利用PCR方法获得shRNA抑制内外源性基因的表达

目的探讨PCR法获得的shRNA对外源性基因和内源性基因表达的抑制效果。方法选择绿色荧光蛋白(GFP)和大鼠肾脏系膜细胞高丰度表达的纤维连接蛋白(FN)分别作为外源性和内源性基因的靶基因,设计特异性引物,利用PCR扩增获得shGFPRNA和shFNRNA。前者与pEGFP质粒共转染至293T细胞,48h后进行激光共聚焦检测细胞表达GFP阳性率;后者转染至大鼠系膜细胞(RMC)中,48h后提取总RNA逆转录成cDNA,经realtimeRTPCR检测FN的mRNA表达水平,提取细胞总蛋白进行Westernblot检测FN蛋白表达水平。结果PCR获得的shGFPRNA产物能有效抑制外源性基因GFP的表达,抑制效率可达70%±3.2%;shRNA转染组内源性基因FN的表达水平明显下降,与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。结论PCR方法可快速简单、廉价地获得shRNA,对内源性或外源性基因进行特异性抑制。     

人MCHR2基因shRNA真核表达载体构建及鉴定

目的 构建针对人黑色素浓集激素受体2(MCHR2)的shRNA真核表达载体,并在人胚肾293(HEK293)细胞中观察其对MCHR2基因表达的影响.方法 根据MCHR2基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,并将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定.用脂质体将重组质粒转染到HEK293细胞中,观察其在mRNA和蛋白水平对MCHR2的影响.结果 通过酶切鉴定和序列测定,成功构建四条表达短发夹RNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功转染到HEK293细胞株中.四条shRNA真核表达载体在mRNA水平对MCHR2抑制率分别为54.9%、66.4%、56.9%、45.8%;在蛋白水平对MCHR2抑制率分别为62.0%、81.0%、73.3%、44.2%.结论 针对人MCHR2的shRNA真核表达载体成功构建及鉴定为进一步研究MCHR2功能奠定了良好的基础.     

靶向生存素基因的RNAi对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响

目的 构建靶向生存素(survivin)基因的RNA干扰(RNAi)载体,观察对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响,并探讨其机制.方法 根据survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建干扰survivin的重组干扰质粒pGenesil2-survivin.酶切、测序鉴定正确后,经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞;应用反转录.聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法检测survivin的表达;流式细胞术检测细胞凋亡的变化;克隆形成实验检测细胞的放射敏感性.结果 酶切和测序结果显示,载体构建正确;将质粒pGenesil2-survivin转染肺腺癌A549细胞48 h,survivin蛋白水平及mRNA水平在正常组与pGenesil2组中无明显变化,5 Gy照射组增强,而转染pGenesil2-survivin后明显抑制;pGenesil2-survivin与5 Gy X射线照射都能诱导细胞凋亡增加(t1=10.63,P<0.001;t2=3.75,P<0.05),两者共同作用,凋亡增加更明显(t=4.83,P<0.05);克隆形成实验显示,pGenesil2与正常组D0、Dq无明显变化,而pGenesil2.survivin则明显降低,说明其可以提高A549细胞的放射敏感性.结论 靶向生存素基因的RNAi能够明显抑制survivin mRNA与蛋白的表达,促进凋亡,增强A549细胞的放射敏感性.     

靶向生存素基因的RNAi对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响

目的 构建靶向生存素(survivin)基因的RNA干扰(RNAi)载体,观察对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响,并探讨其机制.方法 根据survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建干扰survivin的重组干扰质粒pGenesil2-survivin.酶切、测序鉴定正确后,经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞;应用反转录.聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法检测survivin的表达;流式细胞术检测细胞凋亡的变化;克隆形成实验检测细胞的放射敏感性.结果 酶切和测序结果显示,载体构建正确;将质粒pGenesil2-survivin转染肺腺癌A549细胞48 h,survivin蛋白水平及mRNA水平在正常组与pGenesil2组中无明显变化,5 Gy照射组增强,而转染pGenesil2-survivin后明显抑制;pGenesil2-survivin与5 Gy X射线照射都能诱导细胞凋亡增加(t1=10.63,P<0.001;t2=3.75,P<0.05),两者共同作用,凋亡增加更明显(t=4.83,P<0.05);克隆形成实验显示,pGenesil2与正常组D0、Dq无明显变化,而pGenesil2.survivin则明显降低,说明其可以提高A549细胞的放射敏感性.结论 靶向生存素基因的RNAi能够明显抑制survivin mRNA与蛋白的表达,促进凋亡,增强A549细胞的放射敏感性.     

靶向生存素基因的RNAi对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响

目的 构建靶向生存素(survivin)基因的RNA干扰(RNAi)载体,观察对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响,并探讨其机制.方法 根据survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建干扰survivin的重组干扰质粒pGenesil2-survivin.酶切、测序鉴定正确后,经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞;应用反转录.聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法检测survivin的表达;流式细胞术检测细胞凋亡的变化;克隆形成实验检测细胞的放射敏感性.结果 酶切和测序结果显示,载体构建正确;将质粒pGenesil2-survivin转染肺腺癌A549细胞48 h,survivin蛋白水平及mRNA水平在正常组与pGenesil2组中无明显变化,5 Gy照射组增强,而转染pGenesil2-survivin后明显抑制;pGenesil2-survivin与5 Gy X射线照射都能诱导细胞凋亡增加(t1=10.63,P<0.001;t2=3.75,P<0.05),两者共同作用,凋亡增加更明显(t=4.83,P<0.05);克隆形成实验显示,pGenesil2与正常组D0、Dq无明显变化,而pGenesil2.survivin则明显降低,说明其可以提高A549细胞的放射敏感性.结论 靶向生存素基因的RNAi能够明显抑制survivin mRNA与蛋白的表达,促进凋亡,增强A549细胞的放射敏感性.     

靶向生存素基因的RNAi对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响

目的 构建靶向生存素(survivin)基因的RNA干扰(RNAi)载体,观察对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响,并探讨其机制.方法 根据survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建干扰survivin的重组干扰质粒pGenesil2-survivin.酶切、测序鉴定正确后,经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞;应用反转录.聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法检测survivin的表达;流式细胞术检测细胞凋亡的变化;克隆形成实验检测细胞的放射敏感性.结果 酶切和测序结果显示,载体构建正确;将质粒pGenesil2-survivin转染肺腺癌A549细胞48 h,survivin蛋白水平及mRNA水平在正常组与pGenesil2组中无明显变化,5 Gy照射组增强,而转染pGenesil2-survivin后明显抑制;pGenesil2-survivin与5 Gy X射线照射都能诱导细胞凋亡增加(t1=10.63,P<0.001;t2=3.75,P<0.05),两者共同作用,凋亡增加更明显(t=4.83,P<0.05);克隆形成实验显示,pGenesil2与正常组D0、Dq无明显变化,而pGenesil2.survivin则明显降低,说明其可以提高A549细胞的放射敏感性.结论 靶向生存素基因的RNAi能够明显抑制survivin mRNA与蛋白的表达,促进凋亡,增强A549细胞的放射敏感性.     

靶向生存素基因的RNAi对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响

目的 构建靶向生存素(survivin)基因的RNA干扰(RNAi)载体,观察对肺腺癌A549细胞放射敏感性的影响,并探讨其机制.方法 根据survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建干扰survivin的重组干扰质粒pGenesil2-survivin.酶切、测序鉴定正确后,经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞;应用反转录.聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法检测survivin的表达;流式细胞术检测细胞凋亡的变化;克隆形成实验检测细胞的放射敏感性.结果 酶切和测序结果显示,载体构建正确;将质粒pGenesil2-survivin转染肺腺癌A549细胞48 h,survivin蛋白水平及mRNA水平在正常组与pGenesil2组中无明显变化,5 Gy照射组增强,而转染pGenesil2-survivin后明显抑制;pGenesil2-survivin与5 Gy X射线照射都能诱导细胞凋亡增加(t1=10.63,P<0.001;t2=3.75,P<0.05),两者共同作用,凋亡增加更明显(t=4.83,P<0.05);克隆形成实验显示,pGenesil2与正常组D0、Dq无明显变化,而pGenesil2.survivin则明显降低,说明其可以提高A549细胞的放射敏感性.结论 靶向生存素基因的RNAi能够明显抑制survivin mRNA与蛋白的表达,促进凋亡,增强A549细胞的放射敏感性.