雌激素对人牙周膜干细胞干性维持的影响

目的研究雌激素对人牙周膜干细胞（hPDLSC）干性维持的影响。 方法分离、培养原代hPDLSC并完成其干细胞鉴定;雌激素处理48 h,采用流式细胞术检测雌激素对hPDLSC细胞周期的影响;定量聚合酶链反应（q-PCR）检测人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因、干性相关基因Oct4、Sox2、c-Myc以及衰老相关基因p16和p53的变化;雌激素长期处理后观察细胞克隆形成能力及骨向分化能力的改变。应用SPSS 17.0软件,利用配对样本t检验对组间均数进行统计学分析,P<0.05为差异具有统计学意义。 结果实验获得的hPDLSC符合间充质干细胞鉴定标准。流式细胞术结果显示,雌激素处理48 h后hPDLSC增殖能力（29.730 ± 1.845）较对照组（23.587 ± 2.905）明显提高,差异有统计学意义（t= 9.913,P= 0.010）。q-PCR结果显示雌激素处理48 h后,hTERT表达量（1.958 ± 0.338）较对照组（1.000 ± 0.018）明显提高（t= 7.00,P= 0.001）;Oct4表达量（2.539 ± 0.493）较对照组（1.000 ± 0.011）明显提高（t= 6.26,P= 0.001）;Sox2表达量（2.234 ± 0.255）较对照组（1.016 ± 0.221）明显提高（t= 6.26,P= 0.003）;c-Myc表达量（1.328 ± 0.091）较对照组（1.003 ± 0.088）明显提高（t= 5.67,P= 0.002）;而衰老相关基因p16表达量（0.460 ± 0.085）较对照组（1.009 ± 0.163）明显降低（t= 12.24,P= 0.007）;p53表达量（0.301 ± 0.041）较对照组（1.004 ± 0.115）明显降低（t= 7.77,P= 0.016）。雌激素长期处理后,雌激素处理组的克隆形成率（0.058 ± 0.008）显著高于对照组（0.013 ± 0.008）,差异有统计学意义（t= 5.60,P= 0.028）,成骨能力显著强于对照组（A_对照组= 1.238 ± 0.084;A_E2=2.460 ± 0.182,t= 16.41,P<0.001）。 结论雌激素能提高hTERT和Oct4、Sox2、c-Myc的基因表达量,维持细胞增殖,抑制细胞衰老。雌激素长期处理能维持体外扩增时hPDLSC的干性。     

Mechanisms of the mechanically activated ion channel Piezo1 protein in mediating osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells via the Notch signaling pathway

目的 探究机械激活性离子通道压电蛋白Piezo1通过Notch信号通路介导人牙周膜干细胞（hPDLSC）成骨分化作用机制。方法 选取自2016年1月1日—2018年1月1日就诊于北京儿童医院正畸科的8~14岁儿童因阻生而拔出的年轻恒牙的牙周膜组织为细胞来源,采用酶消化法对hPDLSC进行提取。采用免疫组织化学染色法检测角蛋白、波形蛋白的表达和流式细胞术对hPDLSC的标志物CD146和STRO-1进行鉴定。构建和筛选siRNA-Piezo1基因干扰载体和Piezo1基因过表达质粒。应用Flexcell 4000T机械牵张应力仪器构建体外牵张力学hPDLSC细胞模型。实验分成5组：siRNA干扰组、过表达组、空白对照组、牵张应力组和阴性对照组。荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测Piezo1、Notch1和成骨基因碱性磷酸酶（ALP）、Runt相关基因2（Runx2）、骨钙素（OCN）和骨涎蛋白（BSP）的表达。Western blot检测成骨标志蛋白ALP和Runx2的表达。Fluo-3 AM探针检测细胞内钙离子含量。结果 hPDLSC波形蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性。流式细胞仪检测hPDLSC标志物STRO-1表达阳性,CD146表达阳性。空病毒载体、siRNA-Piezo1干扰序列和Piezo1过表达载体序列均可以通过慢病毒转染hPDLSC,而且转染效率较高,均在90%。逆转录聚合酶链反应结果显示,siRNA干扰组、过表达组、空白对照组、牵张应力组和阴性对照组Piezo1 mRNA的表达水平差异有统计学意义（F=9.573,P<0.05）;过表达组Piezo1 mRNA的表达水平明显高于siRNA干扰组,差异有统计学意义（q=3.893,P<0.05）;牵张应力组Piezo1 mRNA的表达水平明显高于空白对照组,差异有统计学意义（q=2.006,P<0.05）。Notch1和成骨基因ALP、Runx2、OCN和BSP的mRNA表达具有同样的趋势。Western blot检测结果显示siRNA干扰组、过表达组、空白对照组、牵张应力组和阴性对照组成骨标志蛋白ALP蛋白表达差异有统计学意义（F=11.207,P<0.001）;过表达组ALP蛋白的表达水平明显高于siRNA干扰组,差异有统计学意义（q=2.991,P<0.05）;牵张应力组ALP蛋白的表达水平明显高于空白对照组,差异有统计学意义（q=3.007,P<0.05）。Runx2蛋白表达具有同样趋势。细胞内钙离子检测结果显示,过表达组和牵张应力组细胞内钙离子荧光强度明显高于siRNA干扰组。结论 机械牵张应力可以促进Piezo1蛋白的表达,以Ca²⁺为第二信使,激活Notch1信号通路,激活ALP、Runx2、OCN和BSP的表达,促进hPDLSC成骨分化。而siRNA-Piezo1干扰质粒可以阻断这一进程,反之,Piezo1的过表达质粒可以促进hPDLSC成骨分化进程。     

不同浓度γ-分泌酶抑制剂对人牙周膜干细胞骨向分化的影响

目的研究不同浓度的γ-分泌酶抑制剂（DAPT）对人牙周膜干细胞（hPDLSC）骨向分化的影响。 方法将体外培养的hPDLSC随机分为5组：（1）2个对照组,即hPDLSC组和二甲基亚砜（DMSO）组（加入0.173 25 μL/L DMSO）;（2）3个实验组,分别加入25、50和75 μmol/L的DAPT,即DAPT25组、DAPT50组及DAPT75组。通过细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测不同浓度DAPT对hPDLSC的增殖情况的影响;通过茜素红染色、实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）以及蛋白免疫印记法（Western blot）检测不同浓度DAPT对hPDLSC的Notch信号抑制能力及成骨能力的影响。使用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。 结果CCK-8结果显示,DMSO浓度为0.173 25 μL/L时对hPDLSC的增殖没有明显影响,同时不同浓度的DAPT均会抑制hPDLSC增殖,且DAPT浓度为50 μmol/L时对细胞的抑制能力最强（P<0.001）;茜素红染色结果显示,hPDLSC组及DMSO组染色明显,矿化结节面积大且颜色深,两组间无明显差异,而3个实验组形成的矿化结节均有所减少,其中DAPT浓度为50 μmol/L时较浓度为25及75 μmol/L时形成的矿化结节数量更少且矿化结节面积更小;实时荧光定量PCR结果显示,DAPT浓度为50 μmol/L时,其成骨标志基因牙骨质附着蛋白（CAP,0.574 ± 0.182）、骨钙蛋白（OCN,0.269 ± 0.100）、Runt相关转录因子2（Runx2,0.470 ± 0.080）的表达量均明显减少,Notch信号通路相关分子Notch1及Hes-1的表达水平分别为0.467 ± 0.118及0.318 ± 0.015,较其余组也有所减少,且DAPT浓度为50 μmol/L时的相关成骨标志基因表达量最低（P<0.05）,Notch信号通路相关分子Notch1及Hes-1的表达水平也最低（P<0.05）;Western blot结果显示,与对照组相比3个实验组Notch、Hes-1及Runx2的蛋白表达量均有减少,其中50 μmol/L的DAPT组Runx2的蛋白表达量（0.116 ± 0.006）明显比其它组少,差异有统计学意义（P<0.001）。 结论DMSO浓度为0.173 25 μL/L时对hPDLSC增殖及骨向分化没有明显影响;DAPT可抑制Notch信号通路的传递,从而抑制hPDLSC增殖及骨向分化,同时DAPT浓度为50 μmol/L时抑制能力最强。     

程序性坏死特异性抑制剂-1对高糖环境下牙周膜干细胞增殖和成骨分化的影响

目的探讨程序性坏死特异性抑制剂-1（Nec-1）对高糖环境下牙周膜干细胞（PDLSC）的增殖和成骨分化的影响。 方法体外克隆培养的PDLSC，按照如下处理方法分为3组：对照组（5 mmol/L葡萄糖）、高糖组（25 mmol/L葡萄糖）和高糖+Nec-1组（25 mmol/L葡萄糖+30 μmol/L Nec-1）。通过蛋白免疫印迹（Western blot）检测细胞坏死性凋亡相关分子RIP1、RIP3的表达，噻唑蓝（MTT）比色法检测各组细胞增殖活力，通过茜素红染色、碱性磷酸酶（ALP）定量检测和实时荧光定量PCR等方法分析PDLSC的成骨分化情况。使用SPSS 26.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析比较各组间细胞增殖活力（MTT吸光度A值）、ALP表达含量及成骨相关基因（COL1、RUNX2、OCN）相对表达水平，并用LSD-t检验进行组间多重比较。 结果Western blot结果显示，高糖组PDLSC的RIP1和RIP3的表达较对照组明显增加，而高糖+Nec-1组的RIP1和RIP3的表达明显弱于高糖组。PDLSC培养7 d后，高糖组增殖活力较对照组明显降低，其吸光度A值（0.67 ± 0.06）显著低于对照组（1.23 ± 0.12），差异有统计学意义（t = 9.652，P<0.001）；而Nec-1抑制后，PDLSC的增殖活力明显增加，高糖+Nec-1组吸光度A值（1.12 ± 0.11）显著高于高糖组（0.67 ± 0.06），差异有统计学意义（t = 8.185，P<0.001）。经矿化诱导后，高糖组PDLSC 14 d时形成的矿化结节、7 d时ALP表达含量（3.42 ± 0.37）和成骨相关基因COL1（1.86 ± 0.16）、RUNX2（1.55 ± 0.23）、OCN（1.08 ± 0.20）的相对表达量均较对照组均显著减少，差异均有统计学意义（t_ALP = 13.149，t_COL1 = 14.257，t_RUNX2 = 7.593，t_OCN = 8.606，P均<0.001）；而Nec-1抑制后，PDLSC的成骨分化增加，高糖+Nec-1组PDLSC 14 d时形成的矿化结节、7 d时ALP表达含量（6.06 ± 0.26）和成骨相关基因COL1（3.64 ± 0.30）、RUNX2（2.53 ± 0.26）、OCN（2.14 ± 0.30）的相对表达量较高糖组均显著升高，差异均有统计学意义（t_ALP = 13.033，t_COL1 = 11.636，t_RUNX2 = 6.332，t_OCN = 6.573，P均<0.001）。 结论体外培养条件下，高糖环境抑制了PDLSC的增殖和成骨分化，而Nec-1明显改善了高糖环境下PDLSC的增殖和成骨分化。     

雷帕霉素通过促进细胞自噬抑制大鼠血管平滑肌细胞增殖活性效应

目的探讨雷帕霉素（RAP）抑制表现异常增殖活性的大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）增殖活性的作用及其分子机制。 方法使用不同质量浓度的血小板衍生生长因子（PDGF）作为诱导剂处理大鼠主动脉VSMC，构建模拟脉管畸形的体外模型。实验分为对照组、PDGF组、PDGF+RAP组和PDGF+VEC（血管内皮细胞）组，观察对VSMC增殖活性的改变，检测不同处理方式对VSMC自噬水平的影响。两组间比较应用独立样本t检验，多组间比较应用重复测量方差分析，多组mRNA表达量、蛋白表达量比较应用单因素方差分析。 结果细胞增殖检测（CCK-8）和EdU实验结果显示：PDGF处理的VSMC活性呈时间依赖性上升。与PDGF组相比，在48和72 h，PDGF+RAP组细胞增殖活性分别降低了24.8%（0.129 ± 0.010比0.172 ± 0.012，t = 4.787，P = 0.009）和45.1%（0.170 ± 0.012比0.292 ± 0.046，t = 4.431，P = 0.011）；PDGF+VEC组细胞增殖活性分别降低了10.0%（0.155 ± 0.013比0.172 ± 0.012，t = 2.357，P = 0.076）和8.9%（0.266 ± 0.022比0.292 ± 0.046，t = 1.718，P = 0.161）。实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹（Western blot）结果显示，与对照组比较，PDGF可抑制平滑肌蛋白抗体-B（Smoothelin-B）表达（0.486 ± 0.057比1.005 ± 0.067，t = 10.192，P = 0.001），促进细胞视黄醇结合蛋白-1（CRBP-1）表达（3.185 ± 0.091比0.991 ± 0.056，t = 35.461，P<0.001）；而在PDGF+RAP组和PDGF+VEC组，Smoothelin-B表达增加（0.857 ± 0.091比0.486 ± 0.057，t = 5.943，P = 0.004；0.563 ± 0.067比0.486 ± 0.057，t = 1.501，P = 0.208），CRBP-1表达减少（1.579 ± 0.042比3.185 ± 0.091，t = 27.707，P<0.001；2.951 ± 0.144比3.185 ± 0.091，t = 2.382，P = 0.076）。与对照组比较，PDGF组LC3B（LC3-Ⅱ/Ⅰ比值）明显下降（0.175 ± 0.003比1.020 ± 0.020，t = 72.263，P<0.001），p62表达显著上升（2.632 ± 0.098比1.005 ± 0.007，t = 28.562，P = 0.001）。与PDGF组比较，PDGF+RAP组的LC3B明显升高（0.316 ± 0.037比0.175 ± 0.003，t = 6.529，P = 0.022），p62蛋白显著降低（1.396 ± 0.070比2.632 ± 0.098，t = 17.771，P<0.001）；PDGF+VEC组LC3B稍有上升（0.206 ± 0.014比0.175 ± 0.003，t = 3.687，P = 0.021），而p62蛋白表达降低（2.400 ± 0.076比2.632 ± 0.098，t = 3.220，P = 0.032）。透射电镜观察发现，PDGF+RAP组、PDGF+VEC组自噬小体较PDGF组上升。 结论高质量浓度PDGF可使VSMC增殖活性上升；雷帕霉素或VEC可通过激活自噬，抑制PI3K/AKT信号通路使细胞活性降低，并促使VSMC向收缩型转变，逆转PDGF的效应。     

牙髓干细胞对牙周炎中破骨细胞的作用

目的研究牙髓干细胞（DPSC）对牙周炎中破骨细胞形成及牙槽骨再生的影响,并初步探索DPSC对小鼠破骨细胞的作用机制。 方法体外诱导小鼠骨髓单核细胞破骨分化,观察破骨细胞组（OC组）及其与DPSC共培养组（OC+DPSC组）的抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色情况,实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测破骨分化相关基因包括活化T细胞核因子（NFATc1）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）及TRAP的表达差异。体内构建小鼠慢性牙周炎模型,通过微计算机体层摄影（micro-CT）扫描后三维重建,比较慢性牙周炎+0.9%氯化钠溶液注射组（NS组）和慢性牙周炎+DPSC注射组（DPSC组）釉牙骨质界至牙槽嵴顶（CEJ-ABC）距离,并对标本进行苏木精-伊红和TRAP染色,观察DPSC对小鼠破骨细胞及牙槽骨再生的影响。采用SPSS 20.0软件进行数据统计分析,采用独立样本t检验及校正t检验分析组间差异。 结果体外TRAP染色发现,与DPSC共培养明显抑制成熟破骨细胞形成,OC+DPSC组成熟破骨细胞均数（4.2 ± 0.2）少于OC组均数（6.8 ± 0.2）,差异有统计学意义（t= 15.922,P<0.001）;破骨细胞表面积均数（0.046 ± 0.007）mm²也明显小于OC组（0.763 ± 0.015）mm²,差异有统计学意义（t = 83.174,P<0.001）。相对OC组,OC+DPSC共培养组的MMP-9、NFATc1及TRAP的mRNA相对表达量明显降低,均值分别为0.38 ± 0.17（t = 6.217,P = 0.003）、0.24 ± 0.12（t = 10.569,P = 0.003）和0.55 ± 0.13（t = 6.077,P = 0.026）。micro-CT扫描结果显示,DPSC注射组CEJ-ABC的平均距离为（0.215 ± 0.017）mm,明显小于0.9%氯化钠溶液组（0.311 ± 0.022）mm,差异有统计学意义（t= 10.921,P<0.001）,组织学观察下DPSC组炎症反应较0.9%氯化钠溶液组轻,且破骨细胞更少。 结论DPSC可通过抑制牙周炎破骨细胞的形成从而促进牙槽骨再生,有望作为一种可局部注射的骨代谢双向调节生物制剂,治疗临床上包括牙周炎等因骨代谢失衡引起的炎症性骨吸收疾病。     

改良扩孔介孔硅介导大鼠骨髓间充质干细胞成骨向分化

目的探讨自制的扩孔介孔硅纳米粒子（LPMSNs）的材料性能,及其对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖和成骨向分化的影响。 方法溶胶凝胶法合成介孔硅纳米颗粒（MSNs）,使用扩孔剂1,3,5-三甲苯（TMB）对初始合成的小孔径高温扩孔。透射电镜（TEM）、N₂吸附解吸附、孔径分布、孔容及比表面积分析、傅里叶红外光谱（FTIR）、热重分析（TGA）检测其形貌结构和理化性能。体外分离培养BMSCs,并对其增殖能力和多向分化潜能进行鉴定,取第3代细胞用于实验。配置不同浓度LPMSNs培养液,采用细胞计数试剂盒（CCK-8）检测LPMSNs的细胞毒性。分为对照组、LPMSNs组（10 μg/mL）,培养21 d后,茜素红染色法检测各组细胞矿化结节。培养7、14 d后,实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）法检测成骨相关基因碱性磷酸酶（ALP）、Runx相关转录因子（Runx2）、骨钙素（OCN）表达。培养14 d后,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测成骨相关蛋白水平表达。使用SPSS 20.0对数据进行单因素方差分析（One-Way ANOVA）和t检验比较,以P<0.05认为差异有统计学意义。 结果TEM显示LPMSNs粒径约为200 nm,其N₂吸附解吸附曲线为Ⅳ型等温线,有吸附的迟滞环;LPMSNs的孔径分布图显示其孔径分布峰值为7.39 nm,BET比表面积图计算出来的BET比表面积为（340.5 ± 2.8）m²/g,BJH孔容为1.8 cm³/g。在LPMSNs的FTIR的数据中,可观察到位于460 cm^-1的Si-O-Si横向摇摆振动峰（TO1）;位于800 cm^-1的Si-O-Si对称伸缩振动峰（TO2）;位于1070 cm^-1的Si-O-Si非对称伸缩振动峰（TO3）,位于940 ~ 960 cm^-1的Si-OH键振动峰,位于3000 ~ 3700 cm^-1的-OH振动峰。TGA显示LPMSNs在28~1000 ℃之间整个失重所占百分比约为1.61%。CCK-8法结果显示低浓度（<20 μg/mL）的LPMSNs对细胞活力无明显影响。茜素红染色法显示与对照组相比,LPMSNs组的细胞矿化结节形成数量较多,体积较大。实时荧光定量PCR结果表明,LPMSNs组7 d时ALP表达量（6.2 ± 1.9）与对照组相比显著提高（t = 4.83,P = 0.0085）,Runx2表达量（4.3 ± 0.6）与对照组相比显著提高（t = 9.76,P = 0.0006）;14 d时ALP表达量（19.2 ± 1.4）与对照组相比显著提高（t = 4.86,P = 0.0083）、Runx2表达量（4.9 ± 0.7）与对照组相比显著提高（t = 7.73,P = 0.0203）、OCN表达量（17.2 ± 3.6）与对照组相比显著提高（t = 5.52,P = 0.0052）。Western blot的结果显示,成骨分化的第14天,LPMSNs组的Runx2相对表达量（1.7 ± 0.3）与对照组相比呈上升趋势（t = 3.48,P = 0.0254）;OCN相对表达量（1.69 ± 0.21）与对照组相比显著提高,差异有统计学意义（t = 5.71,P = 0.0047）。 结论本研究制备LPMSNs具有较大的比表面积、孔容和亲水性,适用于负载较大分子量的蛋白或细胞因子,细胞毒性小,可促进大鼠BMSCs成骨向分化,作为骨缺损的修复材料具备一定的应用价值。     

CXC受体4阳性表达骨髓间充质干细胞的分选及其骨向分化的能力

目的研究磁珠分选法分选表面CXC受体4（CXCR4）阳性表达的大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的分选效率,以及分选后BMSC的增殖、迁移和成骨能力是否受到影响。 方法全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSC,通过生长曲线、成骨成脂诱导分化和流式检测BMSC表面标记蛋白表达,鉴定大鼠BMSC。流式检测细胞表面CXCR4的阳性率,通过生长曲线及克隆形成实验检测细胞的增殖活性及克隆形成能力,Transwell体外趋化实验检测细胞迁移能力,通过检测成骨诱导早期细胞ALP活性和成骨相关基因的表达,分析细胞成骨能力,数据采用单因素方差分析处理。 结果通过全骨髓贴壁法获得具有自我更新和多向分化能力的大鼠BMSC。磁珠分选阳性细胞表面CXCR4表达[（55.13 ± 0.67）%]较未分选组[（6.49 ± 0.59）%]显著增加（LSD-t = 63.66,P<0.001）。分选阳性细胞的克隆形成能力[（16.22 ± 1.68）%]以及培养后期细胞增殖活性（A_{450（5 d）}= 1.40 ± 0.04;A_{450（7 d）}= 1.60 ± 0.01）较未分选细胞[CFU =（17.00 ± 1.76）%;A_{450（5 d）}= 1.49 ± 0.07;A_{450（7 d）}= 1.60 ± 0.12]均无明显变化;而培养早期（第1、3天）分选阳性细胞的增殖活性[A_{450（1 d）}= 0.50 ± 0.01;A_{450（3 d）}= 0.81 ± 0.05]较未分选细胞[A_{450（1 d）}= 0.57 ± 0.01;A_{450（3 d）}= 0.96 ± 0.06]稍低[LSD-t_{1 d} = 5.208,P_{1 d} = 0.002;LSD-t_{3 d} = 3.563,P_{3 d} =0.012]。分选阳性细胞的基质细胞衍生因子1α（SDF-1α）定向迁移能力（71.33 ± 5.69）较未分选细胞（23.33 ± 1.53）显著增强（LSD-t = 17.211,P<0.001）。在成骨诱导早期,分选阳性细胞的Runx2 mRNA（0.93 ± 0.12）较未分选组（0.51 ± 0.14）表达上调（LSD-t = 4.703,P = 0.003）,而ALP活性及ALP mRNA、OCN mRNA的表达均无明显变化（P>0.05）。 结论磁珠分选法可有效分选CXCR4⁺ BMSC,显著提高BMSC向SDF-1α的迁移效率,对细胞的增殖活性影响不大。     

低氧环境下Notch信号通路对人牙髓干细胞成牙本质向分化的影响

目的探讨低氧环境下通过低氧诱导因子-1α（HIF-1α）调控Notch信号通路对人牙髓干细胞（HDPSC）成牙本质向分化能力的影响。 方法组织块酶消化法培养HDPSC,给予氯化钴（CoCl₂）诱导的化学性低氧环境,Western blot检测HIF-1α蛋白表达,茜素红染色检测细胞矿化结节形成能力,反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Notch下游靶基因Hes1与成牙本质相关基因的表达;进一步加入Notch信号通路特异性阻断剂γ分泌酶抑制剂（GSI）,观察以上指标的变化。报告基因方法检测HIF-1α对Notch信号通路的调控作用。采用R version 3.5.3软件进行统计分析,计量资料进行正态检验,多组间比较采用单因素方差分析（方差齐）或Kruskal-Wallis H检验（方差不齐）,两两比较采用LSD-t检验（方差齐）或Mann-Whitney U检验（方差不齐）。 结果（1）CoCl₂诱导的低氧条件下HDPSC中的HIF-1α蛋白水平上调,Notch下游靶基因Hes1 mRNA相对表达量为1.46 ± 0.12,相比常氧组（1.06 ± 0.09）显著增高（t = -4.64,P = 0.012）;GSI处理阻断Notch信号通路后,低氧条件下HDPSC中HIF-1α蛋白水平下调,Hes1 mRNA相对表达量降低至0.82 ± 0.14,与处理前相比差异有统计学意义（t = 5.98,P = 0.004）;常氧条件下GSI处理后的HDPSC中HIF-1α蛋白水平也明显下调,Hes1 mRNA相对表达量（0.30 ± 0.09）相比处理前也显著降低（t = 10.08,P = 0.001）;（2）矿化诱导后的茜素红染色结果显示：低氧处理后,HDPSC细胞成牙本质分化能力下降;GSI处理后,成牙本质向分化能力增强。成骨/牙本质相关基因mRNA表达水平检测结果显示：低氧处理后,BSP、OCN和DSPP的mRNA相对表达量分别为0.53 ± 0.14、0.43 ± 0.20、0.48 ± 0.11,相比常氧组（1.21 ± 0.12、1.08 ± 0.19、1.03 ± 0.13）显著降低（t_BSP = 6.30,P_BSP = 0.003;t_OCN = 4.07,P_OCN = 0.015;t_DSPP = 5.67,P_DSPP = 0.005）;GSI处理后,低氧条件下BSP、OCN和DSPP mRNA相对表达量分别为0.99 ± 0.13、1.09 ± 0.13、0.95 ± 0.16,与处理前相比显著增高（t_BSP = -4.17,P_BSP = 0.014;t_OCN = -4.83,P_OCN = 0.012;t_DSPP = -4.30,P_DSPP = 0.017）,常氧条件下BSP、OCN和DSPP mRNA相对表达量分别为1.73 ± 0.20、1.55 ± 0.08、1.52 ± 0.14,与处理前相比显著增高（t_BSP = -3.84,P_BSP = 0.027;t_OCN = -3.99,P_OCN = 0.035;t_DSPP = -4.43,P_DSPP = 0.011）。（3）荧光素酶报告基因结果显示,HIF-1α可调控NICD启动子,使双荧光素酶相对表达活性为5.37 ± 0.12,与对照组（2.09 ± 0.15）相比显著增强（t = -28.92,P<0.001）,提示HIF-1α可能使Notch信号通路激活。 结论低氧引起HDPSC中HIF-1α升高并可能通过激活Notch信号通路抑制其成牙本质向分化能力。     

人脐带Wharton's Jelly来源间充质干细胞与人牙周膜干细胞成骨分化能力的对比研究

目的:比较人脐带Wharton's Jelly来源间充质干细胞(human umbilical cord Wharton's Jelly-derived mesechymal stem ceils,hUCWJMSCs)与人牙周膜干细胞(periodontal mesenchymal stem cells,hPDLSCs)成骨分化能力.方法:体外培养hUC-WJMSCs和hPDLSCs.MTT法检测细胞增殖情况;成骨诱导后测定细胞的ALP活性,茜素红染色检测细胞矿化能力,Real-timePCR分析OPN和Runx2基因的表达.结果:hUCWJMSCs增殖能力高于hPDLSCs;经矿化诱导后hPDLSCs ALP表达、矿化结节形成高于hUCWJMSCs(P＜0.05);Runx2在hPDLSCs中表达高于hUCWJMSCs(P ＜0.05);而hUCWJMSCs中OPN表达高于hPDLSCs(P＜0.05).结论:hUCWJMSCs、hPDLSCs均具有成骨分化能力,hPDLSCs成骨分化能力较强.     

GAS5靶向miR-222-3p对牙周膜干细胞成骨分化的影响机制

成骨诱导hPDLSCs后,茜素红染色显示矿化增强GAS5表达升高(P<0.05),Runx2、ALP和OCN mRNA表达降低,miR-222-3p表达升高(P<0.05);miR-222-3p抑制剂可逆转GAS5低表达对hPDLSCs的作用(P<0.05).提示hPDLSCs成骨分化后GAS5表达上调,下调GAS5可...     

P2X7受体在人牙周膜干细胞成骨分化中的作用

目的：探讨P2X7受体（P2X7 receptor,P2X7r）在人牙周膜干细胞成骨分化中的作用。方法：选取就诊于贵州中医药大学第一附属医院的健康青年患者因正畸需要而拔除的前磨牙为实验材料,分离、培养人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs）。取第4代hPDLSCs,分为A、B、C、D 4组,A组用常规培养液培养,B组用成骨诱导液培养,C组用成骨诱导液+100 nmol/L三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）溶液培养,D组用成骨诱导液+100 nmol/L P2X7受体特异性拮抗剂KN-62培养。7 d后,采用茜素红染色观察各组hPDLSCs成骨效果,采用实时荧光定量反转录PCR（RT-PCR）检测各组hPDLSCs成骨相关因子骨钙素（osteocalcin,OCN）、RUNX2 mRNA的表达量,采用RT-PCR检测各组hPDLSCs中P2X7r mRNA表达。采用SPSS 22.0软件包对结果进行统计学分析。结果：茜素红染色结果显示,B组和C组hPDLSCs细胞形态发生显著变化,逐渐由不规则形变为方形,出现灰白色钙化小结节。结节多呈板层状圆形或椭圆形团块,C组灰白色钙化小结节显著多于B组,而A组和D组钙结节量均很少。B、C组hPDLSCs中OCN、RUNX2、P2X7r mRNA表达量显著高于A组（P<0.05）,C组hPDLSCs中OCN、RUNX2、P2X7r mRNA表达量显著高于B组（P<0.05）,D组hPDLSCs中OCN、RUNX2、P2X7r mRNA表达量显著低于B、C组（P<0.05）,D组hPDLSCs中OCN、RUNX2、P2X7r mRNA表达量与A组相比,差异无统计学意义（P>0.05）。结论： P2X7受体在人牙周膜干细胞成骨分化中发挥正调节作用。P2X7受体被ATP激活后,可促进人牙周膜干细胞成骨分化,这为临床上治疗牙周炎提供了新的方向。     

低强度脉冲超声对不同钛表面骨髓间充干细胞成骨分化的影响

目的:观察低强度脉冲超声(LIPUS)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在钛片表面成骨分化的影响.方法:将体外培养的BMSCs分别接种于光滑钛表面和大颗粒喷砂酸蚀(SLA)钛表面,进行矿化诱导并实施超声干预和假刺激.于矿化诱导后3、7d进行碱性磷酸酶(ALP)定量检测,14 d进行ALP染色观察;矿化诱导21 d后行茜素红染色;于矿化诱导14、21 d检测成骨相关基因及蛋白表达.结果:矿化诱导后3、7d超声组ALP活性较对照组高(P＜0.05),14 d超声组与对照组相比钛片表面ALP染色明显深染;茜素红染色显示,21 d后超声组的染色更明显且形成更多的矿化结节;超声组的成骨相关蛋白成骨转录因子2、骨形成蛋白、骨桥蛋白表达增高;RT-PCR检测到成骨相关基因、ALP、成骨转录因子2、骨形成蛋白、骨桥蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白均有不同程度表达增高(P＜0.05).结论:LIPUS可以促进光滑及SLA钛表面BMSCs的成骨分化.     

CKIP-1对骨髓间充质干细胞体外增殖和分化能力的影响

目的：探讨CKIP-1基因对小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的增殖和分化能力的调控。方法：选择CKIP-1基因敲除型小鼠（KO）和野生型C57小鼠（WT）,采用全骨髓贴壁法培养BMSCs,取第3代BMSCs,分为KO组和WT组,分别采用成骨及成脂诱导液对细胞进行诱导培养,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测目的细胞表面标记分子,用ALP染色、茜素红染色、油红O染色分别对细胞成骨及成脂能力做定量分析。结果：2种细胞增殖和干细胞分子表达相似;成骨诱导后ALP染色显示,KO组的细胞染色的阳性率要大于WT组。茜素红染色观察显示KO组的矿化结节要多于WT组;油红O染色显示KO组细胞的脂质沉淀量大于WT组。结论：CKIP-1基因缺失可以使BMSCs成骨及成脂分化能力增强,对其增殖影响不明显。