抗nestin多克隆抗体的制备

目的: 在大肠杆菌中融合表达编码小鼠nestin 肽链C段的cDNA序列,制备特异性多克隆抗体;方法: 采用RT-PCR的方法获得编码小鼠nestin 肽链C段的cDNA序列,将测序正确的片段克隆入pET-32 a,构建pET-32 a-nestin-C表达载体.在大肠杆菌BL-21中IPTG诱导下表达6×His-nestin-C融合蛋白,纯化后免疫新西兰兔,制备兔抗鼠nestin血清,以Western Blotting和免疫组化方法分析其特异性.结果: 6×His -nestin-C融合蛋白免疫新西兰兔成功获得多克隆抗体,Western Blotting和免疫组化结果显示制备的抗体具有较高的特异性.结论: 构建了pET-32 a-nestin-C表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达.该多克隆抗体效价高、特异性好.     

PAK6基因的克隆、抗体制备及在前列腺癌中的表达

目的 在克隆P21相关激酶6(PAK6)全长cDNA的基础上,进一步克隆PAK6-N端基因并使其在大肠杆菌中高效表达,纯化基因产物并进行多克隆抗体制备,为研究PAK6与疾病的关系奠定基础.同时研究PAK6在前列腺癌中的表达.方法 根据人全长PAK6 cDNA序列,设计PCR引物,以人前列腺癌cDNA文库为模板利用PCR技术克隆PAK6全长cDNA.在此基础上,以PAK6全长cDNA为模板克隆PAK6-N端基因,将扩增产物克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1中,经EcoRI/XhoI双酶切鉴定后,进行DAN序列测定.GST-PAK6-N融合蛋白在硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下在大肠杆菌BL21中得到表达.利用G1utothione亲和层析纯化融合蛋白,用纯化的GST-PAK6-N融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并用纯化的抗PAK6多克隆抗体在3例前列腺癌病人标本中进行了免疫组化表达的初步研究.结果 成功克隆了PAK6全长cDNA和PAK6-N端基因片断,在E.coli中表达了PAK6-NT,纯化了GST-PAK6-N融合蛋白,并制备了PAK6特异性抗体.免疫组织化学研究表明:3例前列腺癌患者石蜡包埋病理组织切片免疫组化染色全部表现为间质阳性,PAK6在前列腺癌间质中呈现表达,而前列腺癌细胞则不染色.结论 首次克隆了PAK6全长cDNA和PAK6-N端基因片断并成功制备了PAK6特异性抗体,为深入探讨PAK6在前列腺癌中的作用奠定了基础.初步揭示PAK6在前列腺癌的表达     

癌症转移相关基因Syntenin1多克隆抗体的制备与鉴定

目的 获得原核表达GST-Syntenin1融合蛋白,制备高效价的抗Syntenin1多克隆抗体.方法 RT-PCR扩增Syntenin1 cDNA开放阅读框(CDS)序列,亚克隆到编码GST的pGEX-4T-2原核表达载体上,将编码Syntenin1的pGEX-4T-2-Syntenin1重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-Syntenin1融合蛋白表达,对融合蛋白亲和纯化.SDS-PAGE鉴定后,将纯化的融合蛋白辅以弗氏佐剂,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体效价及特异性.结果 成功制备GST-Syntenin1融合蛋白及多克隆抗体.Western blot结果表明Syntenin1兔多克隆抗体效价可达到1∶20 000,且与Syntenin1蛋白特异结合.结论 成功制备Syntenin1多克隆抗体,为进一步研究Syntenin1基因的功能奠定了基础.     

粘附结构蛋白migfilin基因N末端的克隆和抗体制备

目的 克隆migfilin-N末端基因并使其在大肠杆菌中高效表达,纯化基因表达产物并进行多克隆抗体制备,为研究migfilin与大肠癌的关系奠定基础.方法 根据人migfilin全长cDNA系列,设计PCR引物,以人大肠癌cDNA文库为模板克隆migfilin-N末端基凶,将扩增产物克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1中,经EcoRI/XhoI双酶切鉴定后,进行DNA序列测定.GST-migfilin-N融合蛋白在硫代半乳糖苷诱导下在大肠杆菌BL21中得到表达.利用谷胱甘肽亲和层析纯化融合蛋白,用纯化的GST-migfilin-N融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体.并用纯化的抗migfilin多克隆抗体在不同的细胞株中用Western blotting检测migfilin的表达.结果 成功克隆了migfilin-N端基因片段,表达并纯化了GST-migfilin-N融合蛋白,制备了migfilin特异性抗体.Western blotting检测migfilin在不同细胞株中的表达,结果显示migfilin在肺癌及大肠癌细胞株中高表达.结论 migfilin特异性抗体制备成功,为深入探讨migfilin在大肠癌中的作用奠定了基础.     

小鼠TLR-2N末端基因的克隆表达和抗体制备

目的 克隆mTLR-2基因氨基端序列,并表达和纯化N端融合蛋白,制备抗mTLR-2 N末端的多克隆抗体.方法 采用PCR技术扩增编码mTLR-2N端1～153氨基酸的基因,并将其克隆到pET32A载体中,测序验证;用大肠杆菌表达融合蛋白,并以Probond树脂柱纯化;免疫家兔制备多克隆抗体,采用免疫组化、流式细胞术及间接ELISA检测抗体特异性及效价.结果 成功构建了融合表达载体pET-N,表达和纯化了相应的融合蛋白,所制备多克隆抗体可与pGEX-N表达的融合蛋白反应,并可结合表达TLR-2的RAW264.7及转染mTLR-2全长基因的CHO细胞.结论 获得了mTLR-2 N末端重组融合蛋白及其可与天然mTLR-2结合的多克隆抗体.     

德国小蠊细胞色素P450 CYP4G19基因的原核表达及多克隆抗体制备

目的 构建细胞色素P450 CYP4G19基因部分片段的原核表达载体并诱导其表达,纯化表达的融合蛋白并制备CYP4G19多克隆抗体.方法 应用RT-PCR扩增CYP4G19基因部分片段,产物经T-A克隆、测序鉴定,亚克隆入原核表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,镍离子亲和层析法纯化重组蛋白后,免疫小鼠,获得多克隆抗体,ELISA及Western.blot检测多抗的效价及特异性.结果 从德国小蠊cDNA中克隆出一段771bp的亲水性基因片段,在大肠杆菌中诱导表达出约32000 Mr、以包涵体形式存在的P450重组蛋白.将纯化、复性的重组蛋白免疫 9,得到了滴度高于1:10<'6>的高效价多克隆抗体.Western-blot显示此多抗能与32000 Mr的重组蛋白特异结合.并能识别天然的德国小蠊微粒体P450蛋白.结论 利用原核表达的CYP4G19融合蛋白具有良好的免疫原性.制备出效价高、特异性强的抗德国小蠊CYP4G19多克隆抗体,为下一步关于德国小蠊CYP4G19蛋白表达特性及其抗药性功能的深入研究提供了重要的实验工具.     

新基因ZNFD的克隆及其多克隆抗体的制备

目的:PCR扩增得到新基因ZNFD(Znf domain containing protein),构建pET32a-ZNFD原核表达载体,诱导蛋白表达及制备多克隆抗体。方法:通过PCR的方法克隆新基因ZNFD,选取部分抗原免疫原性较高的部分ORF序列,克隆到原核表达载体pET32a上,利用大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)表达系统表达ZNFD融合蛋白。纯化目的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过琼脂糖双向扩散实验和Western blot鉴定其效价和特异性。结果:经测序鉴定已成功克隆ZNFD基因。通过构建原核表达载体pET32a-ZNFD,在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中使用IPTG诱导表达,得到相对分子质量约为45 kD的融合蛋白。纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强的免疫特异性。结论:得到纯化的ZNFD蛋白,制备的多克隆抗体达到了一定的效价,且具有高特异性,为进一步研究ZNFD的功能奠定了实验基础。     

RSD-7的克隆及其在睾丸组织中的定位

目的 分离、克隆精子发生相关基因,深入了解精子发生的分子机制。方法 采用本组克隆的大鼠睾丸EST筛选cDNA文库、Northern blot、原核表达和纯化、抗体制备和免疫组化等技术。结果 (1)获得1个新的全长cDNA序列,命名为RSD-7。全长l238bp,编码232个氨基酸,GenBank接收号为AF315467。序列分析显示,RSD-7基因编码蛋白质含有1个Ubiquitin-like结构域。(2)Northern blot结果显示,在8种成鼠组织中,RSD-7基因仅在睾丸组织中有明显表达。不同发育天龄的大鼠睾丸组织Northern blot结果显示,出生后30d的大鼠RSD-7基因开始表达,一直到120d仍有表达。(3)RSD-7 cDNA在大肠杆菌中获得高效表达,并纯化了GST-RSD-7融合蛋白,以此为抗原制备了高效价的抗RSD-7蛋白的多克隆抗体。(4)通过免疫组织化学方法,RSD-7蛋白定位于Sertoli细胞胞浆和质膜上。结论 初步分析了RSD-7基因的表达特征并制备了抗RSD-7多克隆抗体,为进一步研究RSD-7蛋白在精子发生过程中的功能提供了条件。     

携带抑胃多肽序列的HBc 病毒样颗粒蛋白疫苗的制备及其免疫效果

目的:设计及制备携带抑胃多肽(GIP)抗原序列的HBc病毒样颗粒(VLP)蛋白疫苗,并研究其免疫效果,为肥胖免疫干预治疗提供新的策略。方法:克隆GIP cDNA序列,并与HBc VLP(1~144aa)cDNA序列进行融合,通过原核表达及纯化,制备携带GIP序列的HBc VLP疫苗(HBc-GIP);同时将该融合基因的cDNA序列克隆入pVAX1真核表达载体,制备GIP核酸疫苗。用2种疫苗免疫大鼠并进行免疫学指标评价。结果:成功制备了携带GIP抗原序列的HBc-GIP,并同时制备了编码该融合蛋白序列的核酸疫苗pVAX1-HBc-GIP。经过两种疫苗的联合免疫,可以获得高滴度的GIP特异性抗体IgG,显示了良好的免疫效果。结论:采用HBc(1~144aa)作为GIP的载体,制备VLP蛋白疫苗,联合核酸疫苗免疫可以有效地诱导靶向大鼠GIP的特异性体液免疫反应,打破大鼠自身抗原耐受。该疫苗可以作为一种新的控制肥胖的免疫干预药物来进一步深入研究。     

抗Granulysin多克隆抗体的制备及鉴定

目的构建人颗粒溶素(granulysin,GNLY)质粒并在大肠杆菌中表达,纯化得到9kD目的蛋白片段,免疫新西兰大白兔制备兔抗颗粒溶素多克隆抗体。方法采用RT-PCR的方法获得编码人颗粒溶素的cDNA序列,将测序正确的片段克隆入pET-28a(+),构建pET28a(+)-GNLY表达载体。在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中IPTG诱导下表达6×His-融合蛋白,纯化后免疫新西兰兔,制备兔抗人颗粒溶素血清,以Western Blotting和ELISA方法分析其特异性和效价。结果6×His融合蛋白免疫新西兰兔成功获得多克隆抗体,Western Blotting结果显示制备的抗体具有较高的特异性,ELISA显示效价为1∶6000。结论获得了纯化的颗粒溶素9kD蛋白和anti-GNLY多抗血清,为今后对疾病中CTL和NK细胞活性的研究打下了基础。     

EXPRESSION AND SUBCELLULAR LOCALIZATION OF P9-ZFD PROTEIN IN PATIENTS WITH MYASTHENIA GRAVIS

Objective To express and purify the protein coded by the TRAF-type zinc finger domain of myasthenia gravis (MG)-related gene P9 ( P9-ZFD ) and to prepare P9-ZFD antiserum for detecting expression and subcellular distribution of P9-ZFD protein in the skeletal muscles of patient with MG. Methods The cDNA encoding P9-ZFD was amplified by RT-PCR. The cloned P9-ZFD cDNA was ligated into pET24a, and the P9-ZFD recombinant protein was induced via E.coli. BL21 (DE3) and purified by histidine affinity chromatography. P9-ZFD antiserum was prepared and its titer and specificity were determined by ELISA and Western blot. Expression and subcellular distribution of P9-ZFD protein in the skeletal muscles of MG and control were studied. Results The molecular weight of purified P9-ZFD protein was about 30kD. Its purity was more than 95%. Antiserum specific for P9-ZFD was excellent. P9-ZFD protein is fully confined to the cytoplasm membrane of skeletal muscle cell of MG, obvious immunostaining was absent in the A, I, and Z bands of cytoplasm and no immunoreactivity was observed in the skeletal muscle cell of control. Conclusion P9-ZFD protein is expressed as a cytoplasm membrane-bound protein and has obvious distribution difference in the skeletal muscle cells of patient with MG and normal control.     

Epstein-Barr病毒LMP1蛋白羧基端的克隆与原核表达

目的　构建PGEX 6P 3 CCT原核表达载体 ,获得大量纯化的LMP1羧基端蛋白。方法　通过RT PCR技术从B95 8细胞中扩增EBVLMP1CCTcDNA ,克隆至PGEM Teasy载体上并测序。利用引物上的BamHI与EcoRI酶切位点将CCT基因插入PGEX 6P 3,转化大肠杆菌BL2 1 ,限制性内切酶消化鉴定。IPTG诱导重组菌株表达 ,用SDS PAGE与Westernblot对表达产物进行鉴定 ,并用Sepharose 4B亲和层析柱对表达产物进行纯化 ,PreScissionProteas酶对融合蛋白进行解离。结果　扩增的LMP1CCT长度为 5 97bp ,测序结果与已知序列吻合。重组子经酶切鉴定 ,获得PGEX 6P 3 CCT原核表达菌株 ,Westernblot表明重组蛋白能被LMP1单克隆抗体特异结合。获得约5 1kDa的PGEX 6P 3 CCT融合蛋白 ,分离纯化出约 2 1kDa的LMP1CCT蛋白。结论　成功获得EBVLM1CCT蛋白 ,为研究LMP1致瘤机制 ,研制生物抗癌药物奠定基础     

人精脒/精胺N1乙酰基转移酶基因的克隆、表达和纯化

目的构建人精脒/精胺N1乙酰基转移酶基因的原核表达载体，诱导该质粒在大肠杆菌中表达并纯化其表达的重组蛋白。方法从大肠癌组织中提取总RNA，采用RT-PCR法扩增人SSAT基因的cDNA片段，经TA克隆及亚克隆方法构建原核表达载体pTriEx-4-SSAT。将重组表达质粒转化入E.coli JM109 (DE3)中，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定表达蛋白，并通过6His-tag，利用亲和层析法纯化表达的融合蛋白。结果酶切鉴定和DNA测序显示，人SSAT的cDNA片段成功插入表达载体pTriEx-4中，而且方向正确，SDS-PAGE电泳显示表达出20?kD的外源蛋白。Western blot检测结果显示，表达出的蛋白为6His-tag的融合蛋白，而且用Ni-NTA亲和层析法纯化了该重组蛋白。结论成功构建、表达和纯化了重组SSAT蛋白，为制备其抗体及研究该基因与结直肠肿瘤的关系提供了有力的工具。     

人S-腺苷蛋氨酸脱羧酶α亚基的克隆、表达与纯化

目的：构建人S 腺苷蛋氨酸脱羧酶(SAMDC)的α亚基的原核表达载体，诱导该质粒在大肠杆菌中表达并纯化表达的重组蛋白。方法：从大肠癌细胞中提取总RNA，RT PCR方法扩增人SAMDCα亚基的cDNA片段801?bp，经TA克隆及亚克隆方法构建原核表达载体pTriEx 4 SAMDC α。将重组表达质粒转化入E.coli JM109(DE3)中，经IPTG诱导表达，SDS PAGE电泳和Western blot鉴定表达蛋白，并通过6×His•Tag，利用亲和层析法纯化表达的融合蛋白。结果：酶切鉴定和DNA测序显示，人SAMDC α亚基的cDNA片段成功插入表达载体pTriEx 4且方向正确，SDS PAGE电泳显示表达出32kD的外源蛋白。Western blot检测结果显示，表达出的蛋白为6×His•Tag的融合蛋白，且Ni NTA亲和层析法纯化了该重组蛋白。结论：成功构建、表达且纯化了重组SAMDC α亚基，为制备抗SAMDC抗体、研究SAMDC基因与结直肠肿瘤的关系提供了必要的工具。     

EB病毒LMP1蛋白CTAR23结构域的原核表达及纯化

目的 获得纯化的LMP1 CTAR23结构域蛋白。方法 用RT—PCR方法从B95—8细胞中扩增EBV LMP1 CTAR23结构域的cDNA，将其克隆至PGEM-T easy载体后进行测序鉴定。亚克隆至原核表达载体PGEX-6P-3，转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导重组菌株表达。用SDS—PAGE与Western blot对表达产物进行鉴定，用Sepharose 4B亲和层析柱对表达产物进行纯化，PreScission Proteas酶对融合蛋白进行解离。结果 扩增的LMP1 CTAR23长度为357bp，测序结果与已知序列吻合。获得PGEX-6P-3-CTAR23原核表达菌株，Western blot表明重组蛋白能被LMPI单克隆抗体特异结合。获得约42000u的PGEX-6P-3-CTAR23融合蛋白，分离纯化出约13000u的LMP1 CTAR23蛋白。结论 成功获得EBV LMP1 CTAR23蛋白，为研究LMP1致瘤机制，研制生物抗癌药物奠定基础。     

人L-ficolin基因重组蛋白的表达及功能研究

目的:构建人L-ficolin基因的原核表达载体并在大肠杆菌中表达。方法:用PCR方法从质粒pCDNA3-L-ficolin中扩增L-ficolin cDNA片断,并将该片断插入pGEX-KG原核表达载体中,以进行插入基因的融合表达,表达后再用Thrombin切除GST以得到单纯的L-ficolin蛋白,SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定,并以细菌侵袭试验检测所得蛋白的生物学活性。结果:酶切结果证实,成功地构建了pGEX-KG-L-ficolin原核表达载体,并使之在大肠杆菌中获得稳定的表达,表达产物的分子质量(Mr)与预期值相一致。原核表达的L-ficolin蛋白具有调理吞噬作用,促进吞噬细胞吞噬细菌的能力,L-ficolin调理吞噬能力呈剂量依赖关系,并显著高于对照蛋白。结论:成功地构建了重组表达载体pGEX-KG-L-ficolin,经过Thrombin作用后得到的L-ficolin蛋白具有生物学活性,为进一步研究人L-ficolin的功能奠定了基础。     

人源抗Met基因工程抗体scFv的改造与特性分析

目的:将已制备的抗Met单链抗体基因与人IgG Fc基因片段融合,表达有活性的融合蛋白分子,以增强单链抗体的可溶性.方法:从人淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增并制备人IgG的Fc基因片段,并克隆于已构建好的pBAD-scFv原核表达载体中,转化大肠杆菌Top10,经阿拉伯糖诱导表达融合蛋白scFv-Fc.所表达的可溶性蛋白经亲和层析纯化、SDS-PAGE、Western blot分析鉴定,并用ELISA检测抗体效价.结果:序列分析表明重组质粒pBAD-scFv-Fc基因序列正确;SDS-PAGE分析表明,scFv-Fc融合蛋白分子量为60 ku,且为可溶性蛋白;该蛋白经过His亲和层析纯化、ELISA检测,结果表明,该融合蛋白能够与抗原分子Met特异性结合.结论:改造后的抗体融合蛋白scFv-Fc能与人Met特异性结合,增加了抗体蛋白溶解度,有利于抗体的大量制备.     

人心肌肌钙蛋白I基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达

目的从人心肌组织中克隆出心肌肌钙蛋白Ⅰ（cardiac troponinⅠ，cTnI）的cDNA。构建成表达重组体导入特定宿主菌，以期大量表达并获得高纯度的心肌肌钙蛋白Ⅰ，为临床检测心肌损伤及预后提供诊断试剂材料。方法利用RT—PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人心肌肌钙蛋白Ⅰ的cDNA片段，将其插入原核表达载体形成重组体并导入宿主菌BL21（DE3）中，经异丙基硫代-β-半乳糖苷（IPTG）诱导，表达出带6个组氨酸标签的融合蛋白，Ni-NTA树脂纯化后行Western blot进行鉴定。结果成功获取了人cTnI的cDNA，并在大肠埃希菌中高效表达。经Ni—NTA树脂纯化后获得的产物可与其特异性单克隆抗体反应。结论成功克隆了cTnI基因，构建的重组体能够在大肠埃希菌中高效表达，经纯化可获得电泳单点纯的cTnI蛋白。     

人脂联素基因真核表达载体的构建及表达

目的 克隆人脂联素（hAPM）基因及构建真核表达重组体PGEX-4T-1／hAPM cDNA,诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶-hAPM（GST—hAPM）融合蛋白。方法 应用RT—PCR法从中国汉族人大网膜脂肪垫总RNA中扩增出APM cDNA全长基因,并在基因上下游分别克隆上EeoRl、Sail两个酶切位点,将其定向导入PGEX-4T-1多克隆位点,构建PGEX-4T-1／hAPM融合表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）后进行诱导表达。结果 从脂肪组织总RNA中扩增得到760bp片段APM基因,经双酶切鉴定及测序分析,证明hAPM cDNA已克隆到PGEX-4T-1载体中。免疫印迹证实,诱导表达的融合蛋白可被多克隆抗体Aerp30（N-20）-R识别。结论 成功诱导表达出融合蛋白GST—hAPM,为进一步获得大量可供实验研究和临床应用的重组hAPM创造条件。