体外诱导骨髓间充质干细胞分化为上皮细胞的初步实验研究

目的:探讨表皮生长因子(EGF)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为上皮细胞的可行性.方法:抽取小型香猪的骨髓,经密度梯度离心分离纯化MSCs,培养扩增后,用含EGF不同介质诱导,观察细胞形态的变化,免疫组织化学染色和流式细胞仪鉴定角蛋白的表达.结果:免疫组织化学染色显示EGF诱导后3dMSCs角蛋白表达较弱,7d角蛋白表达增强.流式细胞仪检测发现EGF诱导后3d表达角蛋白的MSCs较少,7d表达角蛋白的细胞数量明显增加.结论:MSCs在体外EGF诱导下可能分化为上皮细胞.     

体外诱导骨髓间充质干细胞分化为上皮细胞的研究

目的探讨表皮生长因子(EGF)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为上皮细胞的可行性。方法抽取小型香猪的骨髓，经密度梯度离心分离纯化MSCs，培养扩增后。用含EGF的不同介质诱导，观察细胞形态的变化，免疫组织化学染色和流式细胞仪鉴定角蛋白的表达。结果免疫组织化学染色显示EGF诱导后3d MSCs角蛋白表达较弱，7d角蛋白表达增强。流式细胞仪检测发现EGF诱导后3d表达角蛋白的MSCs较少(3％)，7d表达角蛋白的细胞数量明显增加(13％)。结论MSCs在体外EGF诱导下可能分化为上皮细胞。     

犬骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞定向分化的研究

目的：研究犬骨髓间充质干细胞（MSCs）在体外定向诱导,向血管内皮细胞（ECs）方向分化,探讨其作为组织工程血管种子细胞的可行性。方法：获取犬骨髓单个核细胞,体外分离出MSCs。将分离的MSCs接种于含EBM-2完全培养液的培养瓶,向内皮样细胞定向诱导分化;LG-DMEM完全培养液培养的MSCs作为对照组。对MSCs表型进行流式细胞仪鉴定;诱导的内皮样细胞进行CD31、Ⅷ因子免疫细胞化学鉴定和摄取Dil-Ac-LDL、结合FITC-UEA的双染色功能鉴定。结果：流式细胞术检测培养的原代MSCs表面标志CD44表达呈阳性,而CD34表达则呈阴性;诱导分化的内皮样细胞具有内皮细胞形态特征,与成体内皮细胞相似;诱导的内皮样细胞Ⅷ因子染色和CD31免疫荧光染色均呈明显阳性,对照组细胞为阴性;诱导的内皮样细胞Dil-Ac-LDL摄取实验和FITC-UEA结合实验,细胞呈阳性表现。结论：在体外用骨髓MSCs能够成功诱导分化为血管内皮样细胞,为组织工程血管内皮化提供了一种可行的种子细胞来源。     

脐带间充质干细胞向汗腺样细胞分化后的表型变化

目的：比较人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）向汗腺样细胞诱导前后表型特征的变化.方法：对hUC-MSCs进行分离、培养、鉴定,通过显微镜观察、免疫细胞化学、流式细胞术等方法比较hUC-MSCs经汗腺分化诱导培养液培养前后细胞形态变化及癌胚抗原（CEA）、角蛋白7（CK7）、CK8、CK14、CK18、CK19表达的差异.结果：hUC-MSCs向汗腺样细胞诱导前呈梭形,呈成纤维细胞样;流式细胞仪检测发现CD29、CD90表达阳性;而CD34、CEA、CK14、CK19表达阴性.经汗腺诱导培养基诱导后hUC-MSCs分化为外形肥大、不规则、类似铺路石样的细胞,聚集性增殖;免疫细胞化学检测显示CK7、CK8、CK18抗原表达阳性;流式细胞仪检测结果显示CEA、CK14、CK19的阳性表达率分别为77.98%,48.47%,20.85%.结论：hUC-MSCs经过汗腺分化诱导培养基培养后能够分化为表达汗腺细胞标记物抗原的汗腺样细胞.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化的研究

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养方法和向血管内皮细胞分化的能力.方法:利用淋巴细胞分离液分离出MSCs,体外扩增,流式细胞仪检测MSCs表面抗原表达,以含VEGF、bFGF的诱导分化培养液定向诱导传代使细胞向血管内皮细胞分化,流式细胞仪进行内皮细胞特异性标志物鉴定,测定内皮细胞NO的释放量,电镜观测W-P小体.结果:MSCs在体外传代扩增后流式细胞仪检测结果显示CD29表达阳性,CD34、CD45为阴性,分化后的细胞具有内皮细胞的形态学特征并具特异性W-P小体,可表达CD34,而不表达CD45,能释放NO.结论:骨髓间充质干细胞可在体外诱导向内皮细胞方向分化.     

促红细胞生成素对人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化的影响

目的探讨促红细胞生成素(EPO)对人骨髓间充质干细胞(MSCs)向血管内皮细胞诱导分化的影响。方法从正常人骨髓中分离获取MSCs,体外培养扩增、纯化后,分4组对其进行诱导分化:(1)EPO组;(2)碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)+血管内皮细胞生长因子(VEGF)组;(3)EPO+bFGF+VEGF组;(4)DMEM培养液对照组。诱导前后行流式细胞仪检测细胞表面标记CD29、CD31、CD34、CD44,免疫细胞化学鉴定vWF抗体。结果 EPO组、bFGF+VEGF组及EPO+bFGF+VEGF组诱导MSCs后的细胞CD31、CD34表达率升高,CD29、CD44表达率降低,vWF抗体阳性。结论 EPO可以诱导MSCs向血管内皮细胞分化,但联合bFGF、VEGF并不能进一步促进MSCs向血管内皮细胞转化。     

肝细胞生长因子诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)在体外是否可定向诱导分化为肝细胞及其方法。方法采用梯度离心法,分离纯化SD大鼠的MSCs,流式细胞仪检测和碱性磷酸酶染色鉴定细胞类型。根据培养基中肝细胞生长因子(HGF)浓度不同,将MSCs分为4组进行诱导分化：A组0 ng／ml,B组10ng／ml,C组20ng／ml,D组40ng／ml。倒置显微镜连续观察细胞分化过程的形态学变化。于培养的1,3,7,14,21,28 d,分别以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和细胞免疫组化检测各组细胞甲胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白18(CK18)和白蛋白的基因和蛋白表达。结果分离纯化的SD大鼠MSCs的表面标志为CD29^ ,CD44^ ,CD34^-,CD45^-和CD90^ ,细胞的碱性磷酸酶染色阴性,细胞纯度达98％以上。C组与D组的MSCs,于培养第7天出现AFP基因表达,第14天表达增强,第28天表达减弱;第14天始出现白蛋白、CK18基因表达,而后持续。B组和A组在培养过程中,未出现AFP、CK18和白蛋白的表达。C组与D组MSCs的AFP细胞免疫组化染色培养第7天即出现阳性,第14天白蛋白和CK18免疫组化染色阳性。A组和B组的MSCs的AFP、白蛋白和CK18的免疫组化染色均阴性。结论成年大鼠MSCs在较高浓度的HGF的诱导下,可分化为肝细胞。     

血管紧张素Ⅱ对骨髓间充质干细胞定向诱导为角质形成细胞调控作用的实验研究

目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）分化为角质形成细胞的可能性及在此过程中血管紧张素Ⅱ （AngⅡ）对其的调控作用.方法：抽取Wistar大鼠的骨髓,经全骨髓法分离、纯化MSCs,鉴定后建立MSCs细胞模型,用成胶质细胞诱导培养基诱导其为角质形成细胞,显微镜下观察其形态学变化.以添加了AngⅡ 的成角质形成细胞诱导培养基组与单纯成角质形成细胞诱导培养基组在诱导MSCs 7天、10天后行角蛋白10（CKP10）免疫组织化学染色及流式细胞仪检测,并进行对比观察分析.结果：培养的MSCs具有成脂、成骨分化的能力.MSCs可以成功诱导为角质形成细胞,添加Ang Ⅱ的诱导组与对照诱导组CKP10免疫组化染色均有阳性表达,但添加AngⅡ组阳性细胞数高于对照组.流式细胞仪检测显示CKP10阳性细胞百分率,AngⅡ组为80.62％,对照组（32.46％）,两者相差显著（P＜0.05）.结论：MSCs可以诱导分化为角质形成细胞,ANGⅡ对MSC的成角质形成细胞分化有显著的促进作用,这一作用可能是AngⅡ 促进创面愈合的机制之一.     

大黄素诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的研究

目的:探讨大黄素对人骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化的影响.方法:体外分离、培养及扩增入骨髓MSCs,用流式细胞仪检测人骨髓MSCs表面抗原的表达,用倒置光学显微镜、透射电镜、四甲基偶氮唑盐比色、碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性测定等研究人骨髓MSCs增殖和分化规律.采用不同方法诱导第3代人骨髓MSCs向成骨细胞分化.结果:入骨髓MSCs贴壁生长,呈成纤维细胞外观.流式细胞仪检测显示CD29、CD44表达为阳性,CD34、CD45、HLA-DR表达为阴性.大黄素对入骨髓MSCs增殖的影响:对照组和DXM(地塞米松)组与大黄素 DXM组比较均具有显著差异(P＜0.05).大黄素对人骨髓MSCs分化的影响:对照组和DXM组与大黄素 DXM组比较均具有显著差异(P＜0.01).结论:大黄素能促进入骨髓MSCs向成骨细胞方向分化.     

大鼠MSCs体外分离培养及骨向分化的实验研究

目的:建立骨髓MSCs体外分离培养体系,并进行骨向分化诱导,以证实其多向分化潜能,为骨髓MSCs进一步的临床应用研究提供实验依据。方法:用密度梯度离心法分离大鼠骨髓MSCs,并对其形态学特征进行观察。用诱导剂对骨髓MSCs向成骨细胞进行诱导分化,并进行形态学观察和免疫细胞化学检测。结果:用密度梯度离心法成功分离获得了高纯度的骨髓MSCs。经骨向诱导后,ALP和矿化结节染色阳性。结论:采用密度梯度离心法成功建立了大鼠骨髓MSCs体外分离和培养体系,并能够向成骨细胞分化。     

体外人骨髓间充质干细胞向汗腺细胞表型转化的实验研究

目的:研究骨髓间充质干细胞(MSCs)向汗腺细胞分化的可行性.方法:体外分别分离培养、扩增并鉴定MSCs和汗腺细胞,将汗腺细胞置于47℃环境中1 h建立汗腺细胞体外休克模型,继续孵育3～5 d,收集上清液作为条件培养基对MSCs分化诱导,应用免疫组织化学和流式细胞仪法检测对比共培养10 d后MSCs细胞表型的改变.结果...     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养及表型鉴定

目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞分离及培养的方法,探讨体外培养骨髓间充质干细胞的生物学特性.方法 采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,传代扩增,测定生长曲线,镜下连续观察细胞的形态变化.流式细胞仪鉴定其表面抗原 CD29、CD34、CD44和CD45的表达情况.结果 原代骨髓间充质干细胞呈集落状生长,细胞呈梭形、纺锤形,呈放射状生长,传代后呈均一的成纤维细胞样.骨髓间充质干细胞生长性状相对稳定,1、3、5代细胞生长曲线基本一致.流式细胞仪鉴定表明,骨髓间充质干细胞CD44、CD29表达呈阳性,CD45、CD38表达呈阴性.结论 采用密度梯度离心法结合贴壁培养法能获得纯度较高的骨髓间充质干细胞,并且在体外培养条件下可大量增生,形成形态均一的细胞集落,可以作为组织工程中种子细胞的来源.     

大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性和示踪标记

目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离和培养方法,观察绿色荧光蛋白(GFP)基因通过慢病毒载体感染MSCs的表达.方法 采用原代贴壁法获得骨髓MSCs,观察细胞形态和生长变化,流式细胞仪鉴定细胞表面标志,体外诱导MSCs向脂肪细胞和成骨细胞分化.采用含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因慢病毒载体感染培养的MSCs,比较细胞感染前后生物学特性.结果 原代贴壁筛选结合差异传代培养的MSCs表面标志阳性率分别为CD44 94.81%,CD90 99.53%,CD106 76.34%,MSCs在pH值稳定于7.2～7.4的环境可传20代.体外MSCs诱导分化后特异性染色显示脂质沉淀和骨结节,表达脂肪细胞和成骨细胞特异基因.慢病毒载体可有效感染大鼠MSCs,加入聚凝胺感染效率达到80%,EGFP在MSCs感染后1个月仍持续表达.结论 骨髓MSCs可长期培养,具有良好的多向分化能力.携带EGFP基因慢病毒载体能高效感染MSCs,EGFP可作为MSCs体内研究的示踪标记.     

VEGF基因体外转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的:探讨脂质体介导血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCS)应用于基因治疗的可行性、安全性。方法:体外分离、培养、鉴定MSCs,PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染MSCs,转染后用免疫荧光和ELISA检测MSCs表达VEGF蛋白的情况,MTT检测MSCs对VEGF质粒转染的敏感性。结果:骨髓中分离得到MSCs,流式细胞检测显示MSCs不表达CD34和CD45,但表达CD90。透射电镜观察可见细胞浆中含大量粗面内质网和分泌颗粒。VEGF基因转染MSCs后第5天抗VEGF免疫荧光染色约90%的MSCs呈阳性,ELISA检测结果显示PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染组细胞培养上清液中VEGF含量明显高于对照组,并于转染后第5天达到峰值。MTT检测结果显示VEGF质粒转染对MSCs增殖无影响。结论:MSC可作为VEGF基因转染的靶细胞用于基因治疗。     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

目的建立一种兔骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cell，MSC）体外分离培养、扩增及鉴定的方法。方法骨髓穿刺法抽取新西兰白兔髂骨骨髓5ml，应用密度梯度离心法分离纯化MSC并进行体外扩增，倒置显微镜下观察原代及传代细胞的形态、生长情况，计数细胞数目，绘制细胞乍长曲线。HE染色光镜观察细胞形态，采用CD44及CD34抗体进行间接免疫荧光标记鉴定培养的干细胞。结果成功建立了兔MSC体外分离及培养扩增的方法。生长动力学分析发现，传代细胞随传代次数的增加其增殖能力逐渐下降，第3～5代细胞增殖能力强，生长旺盛。所分离培养的细胞均表达CD44，不表达CD34。结论在体外采用密度梯度离心及贴壁培养法可获得高纯度的兔骨髓间充质干细胞，第3～5代细胞增殖能力强，可用于进一步的研究工作。     

冠心病病人骨髓间充质干细胞的生物学特征评价

目的　确立胸骨骨髓间充质干细胞分离和培养的方法 ,评价其生物学特征。方法　骨髓取自行冠状动脉旁路移植术的冠心病病人胸骨切口 ,用Percoll液分离骨髓MSCs,体外培养扩增 ,观察细胞生长特性 ,流式细胞仪检测骨髓MSCs表型特征、细胞周期。结果　贴壁的骨髓MSCs多数呈梭形。骨髓MSCs能连续传 15代以上 ,但是第 5代以后或老年病人的细胞增殖速度减慢。骨髓MSCs的表型特征为CD2 9、CD4 4阳性 ,CD34、CD4 5阴性。多数骨髓MSCs在细胞周期的G0 /G1期。结论　冠心病病人手术时从胸骨切口取骨髓并分离培养骨髓MSCs的方法可行 ,骨髓MSCs具有较好的增殖更新潜能 ,是细胞心肌成形术中理想的细胞来源。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向肾小管上皮样细胞分化

目的 观察不同条件下骨髓间充质干细胞（MSC）体外诱导分化为肾小管上皮样细胞的差异。 方法 抽取SD大鼠的骨髓,经密度梯度离心分离,联合贴壁筛选法获取纯化的MSC。以流式细胞仪鉴定间充质干细胞表面标志。取扩增3代的MSC分组培养：（1）对照组：用含胎牛血清培养基;（2）全反式维甲酸（ATRA）组：胎牛血清+缺血再灌注肾脏匀浆上清+ATRA;（3）联合诱导组：胎牛血清+缺血再灌注肾脏匀浆上清+ATRA+表皮生长因子（EGF）+骨形成蛋白（BMP-7）。诱导7 d后,倒置显微镜下观察细胞形态变化;化学染色检测细胞碱性磷酸酶表达;免疫细胞化学法检测细胞角蛋白18（cytokeratin-18）、E钙黏蛋白(E-cadherin)的表达。 结果 流式细胞仪显示,体外分离培养的第3代MSC,CD44阳性细胞表达率为97.8%±0.9%;CD90阳性细胞表达率为96.8%±1.4%;CD29阳性细胞表达率为97.6%±2.4%;而CD11b/c阳性细胞表达率为13.2%±0.6%; CD34阳性细胞表达率为1.2%±0.5%。诱导7 d后,与对照组长梭形细胞相比,ATRA组部分细胞为圆形、短梭形单层排列;联合诱导组的大部分细胞为圆形、短梭形,细胞密集处呈鹅卵石样排列。碱性磷酸酶染色显示,对照组细胞为阴性;ATRA组部分细胞阳性;联合诱导组阳性细胞数明显增多。免疫细胞化学显示,ATRA组和联合诱导组细胞cytokeratin-18阳性表达率分别为29.47%±1.08%和47.52%±2.13%,显著高于对照组（P ＜ 0.05）;E-cadherin阳性表达率分别为14.88%±2.46%和36.15%±1.13%,也显著高于对照组（P ＜ 0.05）。 结论 在体外模拟的急性肾衰竭微环境中加入ATRA可诱导MSC部分分化为肾小管上皮样细胞。联合EGF、BMP-7共同诱导能进一步促进MSC向肾小管上皮样细胞分化。     

人碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的 观察人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因体外转染对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)bFGF表达的影响.方法 密度梯度离心、贴壁法培养分离SD雄性大鼠MSCs,体外扩增,流式细胞仪检测MSCs表面抗原表达.利用慢病毒载体系统介导将具有人源性bFGF基因转染至第2代MSCs,在倒置荧光显微镜下观察转染后细胞形态和生长的变化,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot法鉴定bFGF在MSCs中的表达.结果 密度梯度离心、贴壁法培养分离可获得MSCs,P3代大鼠细胞利用流式细胞仪检测CD11b/c阳性细胞表达率为(13.2±0.6)%,CD34阳性细胞表达率为(1.2±0.5)%,CD44阳性细胞表达率(97.8±0.9)%,CD90阳性细胞表达率(96.8±1.4)%.MSCs转染48 h后,绿色荧光蛋白的表达明显增强.RT-PCR证实转基因MSCs表达bFGF mRNA明显增强,Western blot检测证实转基因MSCs在49 KDr出现特异性条带,而空白和空载组的MSCs则未见阳性条带.结论 采用慢病毒介导的基因转染技术可以将bFGF基因转染至MSCs中,并有外源性bFGFmRNA和蛋白的有效表达,MSCs可作为bFGF基因治疗的载体.