新生大鼠小脑颗粒神经元原代培养与鉴定

目的:建立一种较为理想的小脑颗粒神经元原代培养方法。方法:取新生5~7天SD大鼠,分离小脑皮质,胰酶消化后差速贴壁,种植在预先涂有左旋多聚赖氨酸的培养板内,第3天加入阿糖胞苷纯化神经元;采用神经元特异性烯醇化酶免疫细胞荧光技术鉴定神经元。结果:细胞存活率达(98±1.07)%;24 h内基本贴壁;第3天细胞突起增多、变长;培养6~8天,细胞突起交织成网,形成典型的神经细胞网络;神经元特异性烯醇化酶鉴定神经元细胞占90%左右。结论:实验获取神经元纯度较高,是小脑颗粒神经元体外培养的一种较理想的方法。     

新生大鼠大脑皮层神经元原代培养方法

目的：介绍一种简单、生长良好的大脑皮层神经元的培养方法。方法：急性分离新生鼠大脑皮层制作单细胞悬液进行原代培养,观察培养神经元的生长形态,并用免疫荧光化学法对其进行鉴定。结果：培养的神经元细胞清晰,光晕明显,生长良好,免疫荧光鉴定结果表明该方法培养的细胞纯度较高,能够达到实验研究的要求。结论：该培养方法简单、可靠,是神经元培养的良好方法。     

”微岛“原代培养新生大鼠中脑腹侧多巴胺能神经元

目的 探讨“微岛”原代培养中脑腹侧多巴胺能神经元的方法,研究不同培养液维持多巴胺能神经元存活和生长的效果,及多巴胺能神经元与其他神经元在“微岛”上的共培养,为多巴胺能神经元的相关研究提供一种新的细胞模型。方法 利用神经细胞不能粘附于琼脂糖上生长的原理,先用琼脂糖制成非粘附性底物,再将胶原喷洒其上形成粘附性的“岛”样底物,接种神经胶质细胞形成微岛样饲养层后,将大鼠中脑腹侧神经元接种于“微岛”上生长。结果 中脑腹侧多巴胺能神经元可在“微岛”上生长,即使单个神经元也生长良好。在共培养时,能与其他神经元形成突触联系。结论 确定适于“微岛”原代培养中脑腹侧多巴胺能神经元的培养条件,该培养法可为多巴胺能神经元的相关研究提供一种新的细胞模型。     

新生大鼠海马神经元原代培养及膜片钳全细胞记录

目的探讨一种适用于膜片钳全细胞记录的海马神经元培养方法。方法选择鼠龄在1d内的Wistar大鼠,迅速断头,取双侧海马,神经基础培养基添加B-27及L-谷氨酰胺进行神经元原代培养,培养至第10天时,使用免疫荧光技术配合神经元特异性核蛋白NeuN进行细胞鉴定;神经元的电生理特征由膜片钳全细胞记录。结果该方法所培养神经元状态良好,经鉴定发现纯度可高达100%,通过膜片钳全细胞法可记录到自发性动作电位及自发性兴奋性突触后电流。结论本方法操作简便、高效,所培养的海马神经元状态良好,适用于膜片钳全细胞记录。     

人胚大脑皮层神经元细胞体外培养方法的建立

目的 建立人胚大脑皮层神经元的培养体系,研究神经元细胞的生长发育过程。方法 取妊娠30余周合法流产死亡4h以内的胎儿之大脑皮层额部组织,用胰蛋白酶消化为单细胞悬液。以2×10~6/ml密度接种于96孔培养板,24h后加入DNA抑制剂阿糖胞苷,培养1～12d,用相差显微镜观察神经元生长情况。并以尼氏体染色鉴定神经元,以台盼蓝拒染法细胞计数估算细胞的存活率。结果 神经细胞生长良好,胞体折光性强,神经突起明显,细胞形态清晰。第5天形成较稠密的网络联系;细胞存活率逐步下降,第3至第5天显著下降。由92.3％降至76.9％,以后趋于稳定。第7天为74.26％。尼氏小体染色第7天阳性率为88.25％。结论 体外培养3～5d的神经细胞属发育期;第5天细胞稳定生长;第6天神经细胞基本发育成熟。     

新生大鼠大脑皮层神经元原代培养与鉴定

目的建立一种简便的新生大鼠皮层神经元的体外原代培养方法。方法取新生24 h内的大鼠,分离大脑皮层,消化后接种于L-多聚赖氨酸包被的细胞培养瓶内,以含胎牛血清的DMEM高糖培养基为种植液,24 h后换用含有B27的Neurobasal的无血清培养基维持,倒置相差显微镜下观察细胞的生长状态;采用神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫荧光染色法鉴定皮层神经元纯度。结果接种后2 h,皮层神经元开始贴壁;随着时间延长,贴壁细胞增多,细胞长出突起,神经元突起间逐渐开始交织成网。接种后7 d神经元胞体丰满,突起明显延长,相互间形成了明显的神经网络。经NSE免疫荧光技术鉴定神经元纯度为(93.57±3.9)%。结论该方法简单易行,可获得高纯度的大鼠皮层神经元。     

大鼠皮层神经元原代培养方法的改进

目的:建立一种简单、较理想的新生大鼠皮层神经元体外原代培养方法.方法:采用低浓度、短时间胰酶消化和机械分离相结合的方法制备皮层神经元悬液,进行培养.结果:在体外培养条件下神经元结构特征明显,并能形成典型的神经元网络.结论:本方法适合普通实验室进行大鼠皮层神经元体外培养.     

大鼠脊髓神经元原代细胞的分散培养

目的　建立一种简单、易行、满足基本科研需要的脊髓神经元原代细胞分散培养法。方法　取Wistar大鼠胎鼠或新生鼠的脊髓 ,以胰蛋白酶消化和机械吹打相结合 ,将组织分散成细胞悬液 ,培养于含10 %胎牛血清和阿糖胞苷 (抑制胶质细胞的增殖 )DMEM培养基中 ,观察脊髓神经元细胞生长状况。结果　3～ 6h细胞开始贴壁 ,胞体周围渐有突起 ;2～ 3d胞体明显增大 ,突起生长旺盛 ,连接呈网络 ;10d时细胞形态最为丰满 ;3周后细胞开始退化 ,胞内出现空泡。结论　培养的脊髓神经元形态发育符合正常规律变化 ,适用于形态学、生化、遗传、药理等学科研究     

新生大鼠大脑皮层神经细胞的原代无血清培养

神经细胞原代培养是研究神经组织形态结构和功能及其在缺血缺氯等各种损伤条件下的病理变化的重要方法之一，体外神经细胞培养经历了有血清培养向无血清培养的发展过程．近年来，应用无血清培养神经细胞方法比较广泛，各个实验室都有自已的经验．我们实验室对大脑皮层神经细胞原代培养进行了较长时间摸索，有些体会值得交流。     

新生大鼠海马神经元的原代培养与鉴定

目的:探讨建立简便高效的大鼠海马神经元原代培养的纯化方法。方法:(1)离体培养新生24 h内SD乳鼠海马神经元,每天在倒置相差显微镜下进行神经元的形态学观察;(2)MTT法检测培养不同时间段神经元的活力变化,并绘制生长曲线;(3)纯化培养9 d神经元利用免疫荧光染色法检测β-微管蛋白Ⅲ(β-tublinⅢ)的表达率。结果:(1)倒置相差显微镜下观察原代培养的海马神经元,刚分离种植时可见神经细胞为圆形,24 h大多数细胞贴壁,3 d细胞突起增大、增粗,培养5~7 d神经元胞体丰满,突起交织成的网络更密集,培养14~16 d后,神经元开始退化;(2)生长曲线结果发现海马神经元体外培养经历了4个时期,即生长潜伏期、对数生长期、平台期、生长停滞期;(3)经β-tublinⅢ鉴定海马神经元纯度为(93.0%±2.5%)。结论:本实验方法步骤简便,可获得纯度较高的海马神经元,为研究与海马神经元相关的疾病提供了实验基础。     

C57BL/6胎鼠大脑皮质神经元体外培养与鉴定

【摘要】目的探讨近交系C57BL／6胎鼠皮质神经元体外培养方法,观察其生长情况,并进行鉴定。方法分离孕17dC57BL／6胎鼠大脑皮质,剪碎吹打,静置取上清液,余组织块以木瓜酶和DNaseI消化,差速贴壁提纯,培养6h后以添加含谷氨酰胺和B27的Neurobasal培养基继续培养,观察其生长情况,并于体外培养3、5d时,以神经元特异性核蛋白（neuronspecificnuclearprotein,NeuN）和微管相关蛋白一2（microtubule-associatedprotein-2,MAP-2）为标志物,用免疫荧光双染法对分离培养的原代细胞进行鉴定。结果体外培养6h细胞已贴壁,少量细胞发出l～3个短小突起;此后神经元相继发出突起、并伸长,与邻近细胞突起互相接触,培养5d突起已互相交织成网;体外培养3、5d的NeuN阳性细胞率分别为（94．1±5．0）％、（95．0±5．6）％;MAP一2阳性细胞率分别为（96．7±2．9）％、（95．6±5．6）％,NeuN、MAP-2阳性细胞率差异无统计学意义（P〉0．05）,NeuN和MAP-2鉴定结果一致性好。结论本方法制备的C57BL／6胎鼠皮质原代神经元纯度高,损伤小,生长发育状态良好,无明显增殖性,可作为神经元体外研究的良好实验材料。     

新生大鼠皮层神经元体外无血清原代培养

目的：探讨建立较为简便的新生大鼠皮层神经元细胞体外无血清原代培养方法。方法取新生大鼠（24 h ）大脑皮层组织,消化后种植在有多聚-L-赖氨酸包被的六孔培养板中,以含10％胎牛血清DEM E-HG培养液种植,4～8 h后换用含B27的Neurobasal培养基维持饲养。于不同时间在倒置相差显微镜下观察形态变化,分别采用RT-PCR、Western blot、免疫组织化学对神经元特异性标记物神经元特异性烯醇化酶（NSE）基因及蛋白进行鉴定。结果2～8 h神经元细胞贴壁,随着时间延长,形态多变,突起逐渐增多,神经元突起间相互接触形成网络,培养7～10 d神经元胞体最为丰满,通过RT-PCR、Western blot和免疫组织化学证明所分离培养的是神经元细胞。结论该方法简单易行,神经元纯度较高,可作为神经元体外培养的良好模型用于以后的研究。     

大鼠大脑皮质向脊髓与红核投射的比较

目的 比较大脑皮质向脊髓与红核发出投射的区域并探讨是否有分支投射存在。方法 将。TB及NY分别注入大白鼠的脊髓与红核内，在大脑皮质观察比较标记细胞出现的部位。结果 FB标记细胞出现在24，10，8，6，4，3，1，2，23，29b，29c，18，7，13，39区。NY标记细胞出现于6，4，3，1区，10区的尾侧部及7，18区的颅饲部亦有少量存在。无发现双标记细胞。结论 大脑皮质向脊髓发出投射的区域非常广泛，向红核发出投射的区域全部重叠于皮质脊髓神经元分布的区域内，皮质脊髓神经元无分支投射到红核。     

神经激肽-NK4受体在小鼠大脑皮层神经元的定位分布

目的:探讨神经激肽-NK4受体(NK-4R)在大脑皮层的表达分布特征. 方法:正常成年C57/BL小鼠脑组织冰冻切片,进行Nissl染色,NK-4R免疫酶组织化学染色,NK-4R/NeuN, NK-4R/GFAP免疫荧光双标染色,采用内对照的半定量分析方法研究NK-4R在大脑皮层各层的分布表达情况. 结果:NK-4R免疫阳性产物在皮层的锥体细胞层分布最多(Ⅲ,Ⅴ层),在皮层内、外颗粒层、多形层(Ⅱ,Ⅳ, Ⅵ层)也广泛分布,其阳性产物表达于神经元胞体和突起上,免疫荧光双标结果观察到NK-4R与神经元胞核特异性标记物NeuN共存(100%,146/146,双标细胞数目/NK-4R阳性细胞数目),且不与星形胶质细胞标记物GFAP共存. 结论:NK-4R免疫阳性产物在大脑皮层神经元的分布表达,提示NK-4R可能参与了哺乳类动物大脑皮层神经元功能调节和病变过程.     

大鼠脑皮质星形胶质细胞体外培养方法的改进

目的改进大鼠脑皮质星形胶质细胞体外培养方法,获得纯度较高的大鼠脑皮质星形胶质细胞。方法取出生后1d内SD大鼠大脑皮质,用机械吹打法使细胞分散制成初细胞悬液,10μm尼龙膜过滤除去成纤维细胞后接种。待7d细胞铺满瓶底后,"十"字形震荡培养液5min后传代接种。传代2次后行GFAP免疫组化染色鉴定。结果通过微孔尼龙膜过滤和传代前"十"字形震荡培养液等操作可以得到形态典型、纯度较高的星形胶质细胞。通过纯度计算可得离体培养的星形胶质细胞的纯度平均值为95.49%(n=6)。结论改进的星形胶质细胞体外培养方法,降低了实验操作难度,方法稳定有效,得到的星形胶质细胞纯度较高。     

大鼠鼠胚海马神经细胞原代培养及神经元鉴定

目的建立大鼠鼠胚海马神经元原代培养的方法。方法取孕龄17-18天的Wistar大鼠腹中胎鼠,血清培养法进行海马神经元的原代培养,然后用倒置显微镜进行形态学观察和神经元特异性烯醇化酶免疫组织化学方法进行神经元的鉴定。结果培养8天后的海马神经元经形态学和组织化学方法观察证实神经细胞发育成熟。结论大鼠鼠胚海马神经元原代培养是一种新型的培养方法,具有明显的优势。     

新生大鼠大脑皮质神经干细胞的分离培养与胆碱能神经元的鉴定

目的:体外分离和培养新生大鼠大脑皮质神经干细胞并进行鉴定,为用于脑梗死动物模型梗死区移植细胞作准备.方法:分离新生大鼠皮质神经干细胞,进行体外培养,使用免疫细胞荧光染色技术对细胞的特性进行鉴定,并对细胞的胆碱能特征进行鉴定.结果:获得了Nestin阳性的神经干细胞,其分化后可获得MAP-2、GFAP和 CNPase阳性的神经元、星形胶质细胞和寡突胶质细胞;通过胆碱能鉴定发现大脑皮质干细胞可分化为胆碱能神经元. 结论:体外分离和培养的大脑皮质神经干细胞具有增殖分化的能力,并可以分化为胆碱能神经元,有望应用于皮质损伤后认知障碍及运动障碍的细胞移植治疗.     

SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞的体外原代培养

目的：建立原代培养的SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞体系.方法：取新生24 ～48 h的SD大鼠,无菌操作取出大脑皮层,剪碎后用胰酶消化、机械吹打制成分散细胞悬液,网筛过滤,将细胞悬液接种培养7～9d;置于摇床（37℃、250 r/min振摇6h）,弃掉含脱离细胞的细胞悬液,去除小胶质细胞及少突胶质细胞,细胞传代,进行GFAP细胞免疫荧光鉴定.结果：成功分离和培养原代星形胶质细胞,GFAP免疫荧光鉴定星形胶质细胞比例在95％以上.结论：采用该培养方法能够成功的建立原代SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞体系,为研究神经系统疾病及其相关疾病提供了可靠的细胞模型.     

The observation on the levels of VIP in the cerebral cortex of rats with bilateral hemispheric ischemia

The rat vertebral and common carotid arteries were obstructed to cause bilateralhemispheric ischemia.Vasoactive intestinal peptide(VIP)in the rat cerebral cortex following 10～60min of ischemia was analysed by radioimmunoassay(RIA).The results showed that the levels ofVIP were significantly lower in the ischemic animals than controls(P<0.01).The distribution andmetabolism of VIP in the cerebral cortex and the probable mechanism during ischemia are dis-cussed.