JNK和Caspase-3在夏枯草引起人淋巴瘤细胞凋亡中的作用

目的 研究夏枯草对淋巴瘤细胞生长的影响及其可能的机制.方法 参考临床常用剂量,采用50 g/L夏枯草(夏枯草组)、50 g/L夏枯草及20 μmol/L c-Jun氨基末端激酶(JNK)特异抑制剂SP600125(SP600125组)处理Raji细胞,以加入同体积生理盐水处理的Raji细胞作对照,应用噻唑蓝比色法(MTT法)检测各处理方式下细胞增殖率,通过Western印迹检测JNK、c-Jun磷酸化水平和半胱氨酰天门冬氨酸(Caspase-3)的表达,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率.结果 夏枯草细胞增殖率(67.32±1.96)%低于其余各组(P<0.05);JNK磷酸化水平(0.48 ±0.03)和c-Jun磷酸化水平(0.46±0.04)在夏枯草组均明显增高(P<0.05),SP600125可抑制c-Jun磷酸化(0.43±0.01);夏枯草组的Caspase-3表达(1.35±0.07)高于其他各组,SP600125使其表达减少(0.79±0.06,P<0.05);细胞凋亡率在夏枯草组中最高(25.32±5.27)%(P<0.05).结论 夏枯草可以明显抑制Raji细胞的生长,这种抑制作用可能是通过激活JNK信号转导通路和Caspase途径导致细胞凋亡实现的.     

夏枯草提取物体内外对小鼠T淋巴瘤EL-4细胞生长的影响

目的:观察夏枯草提取物体内外对小鼠T淋巴瘤EL-4细胞生长的影响.探讨夏枯草提取物的抗肿瘤作用机制.方法:用MTT法、DNA琼脂糖凝胶电泳、TUNEL等方法检测夏枯草提取物体外对小鼠T淋巴瘤EL-4细胞生长的影响.建立C57BL/6小鼠EL-4细胞移植瘤模型,分别给予500、300、100 mg,/(kg·d)夏枯草提取物,10 d后.计算抑瘤率,对肿瘤组织进行形态学观察,并测定其中bcl-2和Bax蛋白的表达情况.结果:夏枯草提取物体外能抑制EL-4细胞生长,半数抑制浓度(IC50)为(23.67±3.05)mg/L;夏枯草提取物能诱导EL-4细胞凋亡.夏枯草提取物能抑制EL-4细胞在C57BL/6小鼠体内的生长,500、300、100 mg/(kg·d)剂量组的抑瘤率分别为(39.54±1.83)%、(65.26±1.31)%、(22.30±3.7)%,平均生存时间分别为(25.50±1.87)、(28.50±2.62)、(24.86±2.19)d,均大于空白对照组(P<0.05),移植瘤bcl-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达增加.结论:夏枯草提取物在体内外均能抑制EL-4细胞的生长,诱导凋亡可能是其抗肿瘤的主要机制之一.     

夏枯草提取物对人Burkitt淋巴瘤Raji细胞增殖的影响

目的:观察夏枯草提取物对人Burkitt淋巴瘤Raji细胞增殖的影响.方法:①取对数生长期Raji细胞,分6组,分别加入终浓度为80、40、20、10、5 mg/L和0 mg/L(空白对照组)的夏枯草提取物培养48 h,MTT法测定增殖抑制率,求出半数抑制浓度(IC50).②取对数生长期Raji细胞,用浓度为IC50的夏枯草提取物处理24、48、72 h,采用碘化丙啶(PI)一步插入法DNA定量荧光染色,上流式细胞仪检测细胞周期;Annexin V/FITC和PI染色,上流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot法观察Bcl-2、Bax蛋白表达变化,RT-PCR检测bcl-2、bax mRNA.结果:不同浓度的夏枯草提取物对Raji细胞有明显的增殖抑制作用,并呈剂量依赖性,IC50为(18.01±0.92) mg/L.随夏枯草提取物作用时间的延长,G1期细胞减少,S期细胞增多,大部分细胞受阻于S期;细胞凋亡率升高;同时Bcl-2蛋白及mRNA表达下调, Bax蛋白及mRNA表达上调.结论:夏枯草提取物可抑制Raji细胞增殖,其机制可能与下调Bcl-2和上调Bax表达,诱导细胞凋亡有关.     

JNK通路及HSP70在热化疗抑制人小细胞肺癌细胞生长中的作用

目的:研究热化疗对小细胞肺癌生长的影响及其可能的机制.方法:参考临床常用剂量,采用43℃加热联合120μg/L紫杉醇(热化联合组)、43℃加热联合120 μg/L紫杉醇及20μmol/L JNK特异抑制剂SP600125(热化联合 SP600125组)、单纯43℃加热(单纯热疗组)、单纯使用120μg/L紫杉醇(单纯化疗组)处理H446细胞,以未处理的H446细胞作对照.应用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测各处理方式下细胞增殖率的变化,通过Western印迹法检测JNK、磷酸化JNK(pJNK)和HSP70的表达并对数据进行统计学分析.结果:热化联合组细胞增殖率低于对照组、单纯化疗、单纯热疗及热化联合 SP600125组(P＜0.05);p-JNK表达水平在热化联合组中表达明显增高(P＜0.05),但SP600125可抑制其表达,使热化联合 SP600125组细胞的增殖率相应增高(P ＜0.05);HSP70在热化联合组的表达低于单纯热疗组(P<0.05),细胞增殖率也发生了相应变化.结论:热疗可以明显增加紫杉醇对H446细胞生长的抑制作用,且这种作用可能是通过激活JNK信号转导通路或抑制HSP70的表达完成的.     

基于网络药理学的夏枯草-半夏治疗弥漫大B细胞淋巴瘤的作用机制研究

目的 通过网络药理学方法研究夏枯草-半夏治疗弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lym-phoma,DLBCL)的潜在分子机制.方法 首先利用中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese medi-cine system platform,TCMSP)筛选夏枯草-半夏...     

BAFF受体在人B淋巴瘤细胞中的作用研究

目的测定B 细胞活化因子（BAFF）受体在人B 淋巴瘤细胞中的表达水平,探讨B 细胞活化因子受体（BAFF-R）信号转导在人淋巴瘤细胞中的作用。方法选取3 种人B 淋巴瘤细胞系Raji、Daudi、BALL-1,通过流式细胞术、实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）及Western blot检测BAFF 的表达。结果流式细胞术结果显示,在3 种人B 淋巴瘤细胞系中均检出BAFF-R 阳性表达,qRT-PCR和Western blot检测显示,在3 种人B淋巴瘤细胞系中, BAFF-R 基因与蛋白表达水平上调。结论人B 淋巴瘤细胞系Raji、Daudi、BALL-1呈阳性表达,BAFF-R 与B淋巴瘤细胞的生长、增殖关系密切。     

热化疗对Raji细胞生长、JNK通路及热休克蛋白70表达的影响

目的:观察热化疗对淋巴瘤Raji细胞生长的影响及其可能机制.方法:Raji细胞随机分为单纯化疗组(采用3.00 mg/L阿霉素处理细胞)、单纯热疗组(采用43℃加热处理细胞)、热化疗组(采用43℃加热联合阿霉素处理细胞)和对照组(细胞不作任何处理).应用MTT法检测各组细胞增殖率的变化,采用Western Blot检测磷酸化JNK(p-JNK)和热休克蛋白70(HSP70)的表达.结果:对照组、单纯化疗组、单纯热疗组及热化疗组细胞增殖率分别为(100.00 ± 0.00)96、(66.19 ± 2.67)%、(63.44 4 ± 2.43)%和(58.93 ± 3.66)%,p-JNK的表达量分别为(0.45 ± 0.05)、(0.49 ± 0.04)、(0.48 ± 0.03)和(0.67 4 ± 0.13),HSP70的表达量分别为(0.55 ± 0.09)、(1.06 ±0.84)、(8.23 ± 2.12)和(6.46 ± 2.22),化疗(a)和热疗(b)及热化疗(a × b)均对以上指标有影响(Fa分别为83.294、17.586和25.176,Fb分别为62.351、14.411和18.553,F(a×b),分别为94.178,25.153和32.189,P均<0.05).结论:热化疗联合可抑制Raji细胞增殖,这种抑制作用可能是通过激活JNK信号转导通路或部分抑制HSP70蛋白的表达完成的.     

夏枯草对Raji细胞多药耐药基因表达影响的研究

目的探讨夏枯草（prunella vulgaris,PV）对Raji细胞多药耐药基因（mdr1）表达的影响。方法MTT法测定阿霉素（ADM）单用、PV与不同浓度梯度ADM联合应用对Raji细胞半数抑制率（IC50）的影响;运用逆转录多聚酶链式反应（RT—PCR）检测不同浓度的PV对Raji细胞mdr1基因表达水平的影响。结果①PV和ADM联用与ADM单用相比,可降低Raji细胞对ADM的,C50值（P〈0．05）。②Raji细胞有mdr1基因的表达。③不同浓度的PV（三个浓度）作用于Raji细胞后其mdr1基因的表达水平有不同程度下调,且随着PV浓度的增加,下调作用更加明显（P〈0．05）。结论PV能部分逆转Raji细胞对阿霉素的耐药性,其机制可能与调节mdr1基因表达水平有关。     

组蛋白甲基化酶抑制剂对人淋巴瘤Raji细胞生存、凋亡及细胞周期的影响

  目的  研究组蛋白甲基化酶Zeste基因增强子同源物2（enhancer of Zeste homolog 2,EZH2）的3种抑制剂（UNC1999、DZNep及GSK343）对人B细胞非霍奇金淋巴瘤Raji细胞的影响。  方法  PCR扩增EZH2基因16（Y641）和18（A677）外显子,Sanger测序检测其突变情况;蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测正常成年人淋巴细胞及Raji细胞EZH2的表达;使用不同浓度的UNC1999、DZNep及GSK343处理Raji细胞,CCK-8技术检测Raji细胞的生存情况;流式细胞术检测Raji细胞的凋亡情况和细胞周期变化;Western blot检测药物处理后EZH2及H3K27 me3的表达。  结果  Sanger测序显示Raji细胞不携带EZH2基因Y641和A677突变位点。Western blot显示,相比正常成年人淋巴细胞,Raji细胞EZH2蛋白高表达。CCK-8法结果显示UNC1999、DZNep及GSK343对Raji细胞均有抑制生存的作用,DZNep抑制能力最弱。流式细胞术凋亡检测显示UNC1999、DZNep及GSK343促进Raji细胞的凋亡,UNC1999作用强于GSK343与DZNep;3种抑制剂均阻滞Raji细胞于G₁/G₀期,UNC1999组细胞周期阻滞最显著。Western blot显示UNC1999和GSK343抑制EZH2组蛋白甲基化酶的活性,降低H3K27 me3的表达。  结论  EZH2抑制剂可通过降低H3K27 me3的表达抑制Raji细胞生存,促进细胞凋亡,改变细胞周期。UNC1999作用效果优于GSK343及DZNep,且EZH2抑制剂对Raji细胞的作用不依赖于EZH2的突变。     

人pre-miR-15a真核表达载体的构建及其对Raji细胞生长的抑制作用

目的 构建人pre-miR-15a真核表达载体,并研究其对Raii细胞的生长抑制作用.方法 将pre-miR-15a与目标载体(PGCSIL-GFP)定向连接,转化细菌感受念细胞,PCR鉴定阳性克隆,并测序.利用脂质体法将该载体转染Raji细胞,实验分为空白对照组、阴性对照质粒组和pre-miR-15a组(n=5).RT-PCR检测Bel-2 mRNA表达,间接免疫荧光法检测Bcl-2蛋白表达,台盼蓝细胞计数法检测细胞增殖活性.结果 PCR 阳性克隆鉴定及测序结果 均与日的序列一致.倒置荧光显微镜下见绿色荧光表达;RT-PCR法示各组间Bcl-2 mRNA表达差异无显著性(P>0.05);间接免疫荧光法示pre-miR-15a组的Bcl-2蛋白表达量较空白对照组和阴性对照质粒组显著降低(P<0.05);台盼蓝拒染法示pre-miR-15a组Raji细胞生长受抑.结论 本实验成功构建了per-miR-15a真核表达载体,且pre-miR-15a可以抑制Raji细胞生长.     

JNK信号通路在小鼠术后肠麻痹发病机制中的作用

目的 探讨JNK信号通路在小鼠术后肠麻痹（POI）发病机制中的作用。方法 将野生型C57/BL6小鼠（WT）及同品系的JNK-/-小鼠均随机分成假手术组（Sham组,n=6）和肠麻痹组（POI组,n=6）。采用经典小肠操作方法诱导POI模型,术后24h给小鼠碳末灌胃,20min后麻醉小鼠,开腹取小肠评估肠动力,取回肠评估组织学改变,检测髓过氧化物酶（MPO）、IL-1β、IL-6水平及Claudin-2蛋白表达。结果 与Sham组小鼠相比,无论WT或JNK-/-小鼠其POI组的小肠排推率（分别为21%与33%）均明显降低（P=0.034及P=0.045,均P<0.05）,小肠组织MPO活性水平（分别为0.608U/g与0.433U/g）明显升高（均P<0.05）;与WT小鼠POI组比较,JNK-/-小鼠POI组的小肠运动功能及其组织病理变化有所改善,炎症介质如MPO、IL-1β及IL-6水平均有明显降低（均P<0.05）,小肠Claudin-2蛋白表达也降低（P<0.01）。结论 JNK基因敲除减轻小鼠肠道炎症反应、改善POI,表明JNK信号通路参与POI的发病过程。     

JNK通路促进乳化异氟烷引起的大鼠胚胎神经干细胞的增殖抑制

目的 探讨乳化异氟烷( EI)对原代培养的SD大鼠胚胎神经干细胞增殖的影响以及JNK通路在此影响中的作用. 方法 建立体外培养胚胎神经干细胞接受EI处理的模型,分为6组(n=8):正常组(N组)、脂肪乳组(F组)、EI处理组(8. 12 、9. 80 、12. 04 mmol/L EI)、9. 80 mmol/L EI组+20 μmol/L SP600125组( EISP组). 细胞处理12 h后,采用噻唑蓝( MTT)法分别检测6组胚胎神经干细胞的细胞活力;流式细胞术检测细胞的凋亡率;Western blot 法定量检测Caspase-3蛋白表达. 实验重复3次. 结果 与N组比较,F组各项指标无显著差异, EI组细胞增殖的抑制率明显升高(P<0. 01),EI组细胞的凋亡率明显升高(P<0. 01),EI 组明显上调Caspase-3的表达量( P<0. 05 );EI组内3 个浓度之间比较,细胞增殖的抑制率( P<0. 01 )、细胞的凋亡率以及Caspase-3 的表达量差异均有统计学意义( P<0. 05 );与EI组比较,EISP组细胞增殖的抑制率明显下降 ( P<0. 05 ) , EISP组细胞的凋亡率明显降低 ( P<0. 01 ) , EISP组明显下调Caspase-3的表达量( P<0. 05 ). 结论 EI引起的SD大鼠胚胎神经干细胞的增殖抑制具有一定的浓度依耐性,并且与JNK通路相关.     

内质网应激下肝癌细胞Akt和ERK通路间的cross-talk研究

目的 研究内质网应激介导的肝癌细胞PI3K/AKt和MEK/ERK途径间的信号交流。方法 采用PI3K抑制剂LY294002/Akt激活型突变载体myr-Akt和MEK抑制剂U0126分别阻断/激活内质网应激介导的Akt和ERK活化,并利用Western blot分析内质网应激条件下PI3K/Akt和MEK/ERK途径间的信号交流。结果 阻断PI3K/Akt明显促进内质网应激介导的MEK/ERK活化,而过度激活PI3K/Akt则抑制内质网应激介导的MEK/ERK活化。阻断MEK/ERK对内质网应激介导的PI3K/Akt活化无影响。结论 PI3K/Akt和MEK/ERK信号途径问在内质网应激肝癌细胞中存在信号交流。     

LPS对小鼠肺组织及RAW264.7细胞Akt蛋白表达及磷酸化的调控

目的 探讨脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS)在体内外对Akt蛋白表达和磷酸化水平的影响.方法 用不同剂量LPS攻击RAW264.7细胞,检测不同时相点细胞Akt蛋白表达和磷酸化水平.小鼠腹腔注射LPS 6 h 后检测肺组织Akt蛋白表达和磷酸化水平.结果 不同剂量LPS攻击RAW264.7细胞,细胞Akt蛋白表达没有显著差异(P>0.05),磷酸化水平增加.而内毒素血症小鼠肺组织Akt蛋白表达没有显著变化(P>0.05),磷酸化水平减低.结论 LPS在体内外对Akt蛋白磷酸化作用不同,体外Akt蛋白磷酸化水平增高,但在内毒素血症小鼠体内出现Akt蛋白磷酸化水平异常减低.     

鱼藤素对乳腺癌细胞株MCF-7增殖和凋亡及PI3K/Akt信号通路的影响

目的：观察鱼藤素对MCF-7细胞株细胞增殖和凋亡及磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt）信号通路的影响,旨在研究其抗肿瘤机制。方法：细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8,CCK8）检测0、1、5、10、15和20μmol/L鱼藤素作用6、24、48和72h后对MCF-7细胞增殖的影响,膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶双染法检测细胞凋亡率,透射电子显微镜观察细胞凋亡形态,蛋白质印迹法检测细胞内PI3K/Akt通路相关分子的蛋白表达。结果：5、10、15和20μmol/L鱼藤素作用6、24、48和72h后能明显抑制MCF-7细胞增殖（P〈0.01）,抑制率随着浓度升高和时间延长而增加,各组间两两比较差异有统计学意义（P〈0.05）;而1μmol/L鱼藤素作用6、24、48和72h后对MCF-7细胞的增殖无明显影响（P〉0.05）。5、10、15和20μmol/L鱼藤素作用6h后能诱导MCF-7细胞凋亡,透射电子显微镜下可观察到典型的凋亡细胞形态,而相同条件下1μmol/L鱼藤素对MCF-7细胞的凋亡诱导作用不明显。5μmol/L鱼藤素作用6h后,MCF-7细胞内磷酸化Akt（p-Akt）（Thr308）、磷酸化糖原合成酶激酶-3β（phosphorylated glycogen synthase kinase-3β,p-GSK-3β）（Ser9）、磷酸化磷酸肌醇依赖性激酶1（phosphorylated 3-phosphoinositide-dependent protein kinase1,p-PDK1）（Ser241）和磷酸化人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因编码的蛋白（phosphorylated phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome10,p-PTEN）（Ser380）的表达量明显减少,而总Akt蛋白的表达量则无明显变化;1μmol/L鱼藤素作用6h后,细胞内上述所有蛋白的表达量均无明显变化。结论：鱼藤素可能通过抑制PTEN（Ser380）和PDK1（Ser241）蛋白的磷酸化,进而抑制Akt（Thr308）的磷酸化,间接抑制其下游GSK-3β（Ser9）的磷酸化,最终诱导MCF-7细胞凋亡和抑制其增殖。     

JNK/SAPK和p38信号转导通路在高渗透压介导的兔髓核细胞凋亡中的作用

 目的 观察高渗透压对兔髓核细胞活性的影响及JNK/SAPK(c-Jun N-terminal kinases/stress-activated protein kinases)和p38信号转导通路在此过程中的作用。方法 根据不同渗透压及时间段处理髓核细胞将实验分为对照组、刺激组和阻断组后采用流式细胞仪检测各组髓核细胞凋亡情况,同时利用免疫荧光和Western blot技术检测磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(phospho-p38 mitogen-activated protein kinases,P-p38 MAPK)、磷酸化JNK/SAPK激酶(phospho-JNK/SAPK, P-JNK/SAPK)的亚细胞定位及表达水平,观察其对髓核细胞凋亡的影响。结果 高渗透压［600 mOsm/kg H2O(mOsm)］可导致髓核细胞显著凋亡及P-p38 MAPK和P-JNK/SAPK蛋白表达水平改变。600 mOsm时各刺激组凋亡细胞与对照组相比,差异均有显著统计学意义(P<0.01),而阻断组凋亡细胞明显减少;而400 mOsm时各刺激组和阻断组凋亡细胞与对照组相比差异均无统计学意义;免疫荧光结果显示P-p38 MAPK和P-JNK/SAPK在髓核细胞质和细胞核中均有表达;经高渗透压(600 mOsm)刺激后P-p38 MAPK和P-JNK/SAPK表达均显著高于对照组(P<0.01),而相应阻断组P-p38 MAPK和P-JNK/SAPK表达均显著降低。结论 高渗透压通过激活JNK/SAPK和p38信号转导通路导致体外培养的兔髓核细胞凋亡,同时髓核细胞对轻度的渗透压升高具有一定的适应性。     

夏枯草注射液诱导K562细胞凋亡的实验研究

目的探讨夏枯草注射液体外抗白血病作用,为临床应用夏枯草注射液治疗白血病提供实验依据。方法采用M TT法测定夏枯草注射液对K 562细胞的增殖抑制率,计算出IC50值;绘制夏枯草注射液(50、100 m g/mL)作用于K 562细胞的生长曲线。用倒置显微镜、姬姆萨染色法、M TT染色法光镜下观察细胞形态,台盼蓝拒染法、流式细胞仪P I染色观察夏枯草注射液对K 562细胞的促凋亡活性,用免疫细胞化学法检测夏枯草注射液对凋亡相关基因bcl-2和bax蛋白表达的影响,并用图文分析系统进行定量分析。结果夏枯草注射液对K 562细胞增殖具有明显的抑制作用,且在一定的剂量范围内抑制作用具有明显的剂量依赖性(r=0.985 0),IC50为0.113 m g/mL。夏枯草注射液(50 m g/mL)作用于K 562细胞后,倒置显微镜、姬姆萨染色、M TT染色光镜下观察,均可见典型的凋亡细胞的形态学特征。流式细胞仪检测结果显示,处理组细胞凋亡率[(37.15±1.46)%]明显高于对照组细胞凋亡率[(5.56±0.68)%](P<0.01)。夏枯草注射液(50 m g/mL)作用于K 562细胞48 h,bcl-2蛋白表达增强,而bax表达减弱,与对照组相比差异显著(P<0.01)。结论夏枯草注射液可明显抑制K 562细胞增殖,可望成为新的抗白血病药物,诱导K 562细胞凋亡可能是其发挥抗肿瘤作用的机制之一。     

Apelin通过Akt/eNOS机制促进肺血管内皮细胞一氧化氮释放

 目的 探讨Apelin对肺血管内皮细胞释放一氧化氮（NO)的影响及其机制。方法 培养新生鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）。 (1) 以1 x 10⁵ 个/孔密度接种至24孔板,80%融合后,无血清培养24 h。分为2组：Apelin组,加入Apelin至终浓度为10^-8 mol/L;对照组,加入等量无血清DMEM培养液。每组设立4个复孔。继续培养,并分别在0 min、2 min、5 min、15 min 、30 min时间点取培养液测NO浓度。(2) 以5 x 10⁵ 个/孔密度接种至6孔板,80%融合后,无血清培养24 h分为3组：Apelin组,加入Apelin至终浓度为10^-8 mol/L。Apelin + Akt抑制剂（Akt inhibitor）组,加入Apelin前用5 μmol/L浓度的Akt抑制剂预处理30 min。对照组加入等量DMEM培液。每组设立3复孔。继续培养5 min后立即提取总蛋白,用于Western blot检测磷酸化Akt和磷酸化内皮型一氧化氮合酶（eNOS）蛋白表达。结果 与0 min时间点比较,培养液中NO浓度分别在2 min、5 min、15 min时间点增加（P<0.01或P<0.05）,其中在5 min时间点达到高峰。与对照组比较,Apelin组磷酸化Akt和磷酸化eNOS表达增加（P<0.01）,与Apelin组比较,Apelin + Akt inhibitor组磷酸化eNOS表达降低（P<0.01）。结论 Apelin促进PMVECs释放NO,Akt/eNOS磷酸化参与Apelin促进NO释放机制。