问号钩体鞭毛蛋白相关基因分析

目的 分析问号钩体黄疸出血群赖型赖株鞭毛蛋白相关基因。为进一步实验研究提供信息和线索。方法 使用在线数据库和分析软件NCBI／Blast，ProDom／Blast等对问号钩体全基因组ORF基因进行诠释，对编码蛋白进行在线分析。并将问号钩体的鞭毛蛋白基因与E．coliK-12、伯氏疏螺旋体(BBU)和苍白密螺旋体(TPA)的鞭毛蛋白基因进行了比较。结果 确定了问号钩体黄疸出血群赖型赖株染色体上约55个与鞭毛相关蛋白的基因，同其他3个细菌的鞭毛相关基因进行比较分析，推测出了钩体鞭毛结构模型图及其装配过程。结论 通过比较，不同螺旋体的内生鞭毛形成机制存在差别．但是FlgF蛋白缺失可能是其一个共同机制；尽管为内生鞭毛，问号钩体鞭毛在结构组成和鞭毛装配过程上却与E．coli相似；问号钩体的钩形成调控和鞭毛丝结构与E．coli不同；在鞭毛形成过程中的转录调控机制也存在差异。     

重组钩端螺旋体基因疫苗与不同毒力钩体交叉免疫研究

目的　欲了解赖型钩端螺旋体 (简称钩体 )基因多肽疫苗与我国主要 7群不同毒力致病钩体间的交叉免疫情况。方法　常规制备不同毒力钩体超声变性抗原及钩体基因疫苗兔抗血清和全钩死疫苗 (WCV)兔抗血清。以WCV抗血清与各株钩体反应为阳性对照 ,以非致病钩体、PT7- 7(多肽疫苗保护性抗原基因DNA片段质粒载体 )与WCV抗血清反应为阴性对照 ,进行EIA测定。结果　 (1)多肽基因疫苗抗血清与强毒力钩体 (黄疸出血型、秋季热型、澳洲型、巴叶赞型 )具良好的免疫交叉反应(效价为 1/ 5 2 42 88～ 1/ 12 80 0 ;WCV抗血清效价为 1/ 2 6 2 144～ 1/ 6 40 0 )。 (2 )多肽基因疫苗抗血清与弱毒力钩体 (犬型、流感伤寒型、七日热型、波摩拿型 )也具良好的免疫交叉反应 (效价为 1/ 2 5 6 0 0～ 1/ 12 80 0 ;WCV抗血清效价为 1/ 2 5 6 0 0～ 1/ 6 40 0 )。 (3)多肽基因疫苗抗血清与非致病钩体 (PatocI)、PT7— 7质粒载体阴性对照无明显免疫交叉反应 (效价分别为 1/ 16 0 0 ,1/ 2 5 6 ;WCV抗血清效价分别为 1/ 32 0 0 ,1/ 5 12 )。结论　赖型钩体基因重组疫苗抗血清与不同毒力致病钩体具良好的免疫交叉反应。提示 :该基因重组多肽疫苗有可能对我国主要流行之 7群钩体感染具完全交叉保护 ,从而弥补了全钩死疫苗仅对部分钩体有     

螺旋体传染病：问号钩端螺旋体胶原酶在钩体病豚鼠模型的肺组织中的表达

[目的：通过克隆、表达问号钩端螺旋体赖型赖株的胶原酶基因colA（LA0872），以及制备抗胶原酶的多克隆抗体，观察胶原酶在钩体病豚鼠模型的组织中的表达，为研究其致病机制奠定基础。方法：以问号钩端螺旋体赖型赖株基因组DNA为模板，用PCR扩增colA，产物克隆到表达载体pET-28b（＋）中，构建含coLA的重组质粒；将重组质粒转入E．coli Rosetta（DE3）菌株内，IPTG诱导表达后用Ni—NTA His-Bjnd寨和屡析梓绅化雷绢蛋白;[编者按]     

问号钩端螺旋体赖株基因组中一个新溶血基因的表达及功能鉴定

目的对问号钩端螺旋体赖株基因组中LA0202基因进行克隆表达并对重组蛋白的溶血活性进行初步鉴定。方法以问号钩端螺旋体赖株基因组DNA为模板,PCR扩增LA0202基因并重组到原核表达载体pET28b(+),重组质粒经限制性核酸内切酶酶切并经测序鉴定后,在大肠埃希菌BL21中诱导表达重组蛋白。制备绵羊血平板对表达的重组蛋白进行溶血活性鉴定。RT-PCR检测钩端螺旋体赖株体外培养时LA0202基因的转录。结果在大肠埃希菌中成功表达LA0202基因,表达的重组蛋白具有溶血活性。RT-PCR结果显示钩端螺旋体赖株体外培养时LA0202基因发生了转录。结论问号钩端螺旋体赖株体外培养时LA0202基因发生了转录,LA0202可能为一个新的溶血素基因。     

2005-2011年安岳县钩体病流行分析

目的 分析安岳县2005-2011年钩端螺旋体病(leptospirosis,钩体病)疫情流行病学特征,为钩体病防控工作提供科学有效依据.方法 对93例病例的三间分布特征和有关影响因素进行分析,找出发病原因,提出有效防治对策.结果 2005-2011年安岳县钩体病共报告93例,2005年报告病例最高(37例),2010年最低(5例),年均发病率约为0.84/10万;发病季节为6-10月,9月最高,占发病总数的83.87％ (78/93);发病人群以50 ～ 59岁年龄组为主,占病例总数的35.48％ (33/93);男性多于女性,构成比为2.32:1;职业以农民发病为主,占总发病数的81.72％.结论 来2005-2011年安岳县钩体发病率处于较低水平,逐年呈现下降趋势,主要发病人群为农民,农村是钩体病防治的重点地区.     

3株钩端螺旋体外膜蛋白基因的序列分析

目的 探讨钩端螺旋体外膜蛋白基因在钩体遗传分类中的作用。方法 对我国的2株问号钗体赖型56601株和爪哇型56602株的外膜蛋白基因Ompl1进行PCR扩增,得到外膜蛋白基因并进行了全基因序列分析,测序的2株钩体与流感伤寒型RH52株进行了核苷酸序列比较和推导的氨基酸序列比较。结果 赖型56601和爪哇型56602株钩体Ompl1基因核苷酸序列与流感伤塞型RH52株的同源性分别为89％和80％,的外膜蛋白氨基酸序列的同源性分别为92％和88％。由此可以看出56601株、56602株与RH52株分别属于不同的血清群,这与Yasuda的遗传分类相。结论 我国的赖型56601株和爪哇型56602株及流感伤寒型RH52株Ompl1基因的核苷酸序列存在一定差别,利用Ompl1基因可对钩端螺旋体进行分类和鉴定。     

洪涝灾区钩体病人血清抗体分析及其防治对策

湖北省是中国主要发生洪涝灾害的地区，近40年曾发生过5次规模较大的钩体病流行，均发生在内涝型洪涝灾害之年，多次因洪涝灾害造成钩体病暴发流行，给疫区人民生产生活带来了严重危害。钩体病临床容易误诊，常利用实验室诊断，本文利用钩体病人血清进行抗体分群分型，报告如下     

问号钩体lipL32/1-lipL41/2融合基因的构建及其表达产物免疫性的鉴定(英文)

目的构建问号钩端螺旋体(简称钩体)lipL32/1-lipL41/2融合基因及其原核表达系统并鉴定其表达产物的免疫性。方法采用连接引物PCR构建lipL32/1-lipL41/2融合基因,常规方法构建其原核表达系统。采用SDS-PAGE和BioRad凝胶图象分析系统检测目的重组蛋白rLipL32/1-LipL41/2表达情况。采用Western blot鉴定rLipL32/1-LipL41/2的免疫反应性。采用ELISA检测228例钩体病人血清中lipL32/1、lipL41/2基因和lipL32/1-lipL41/2融合基因表达产物的抗体。结果 lipL32/1-lipL41/2融合基因核苷酸和氨基酸序列与报道的相关序列相似性分别为99 .9 %和99 .8 %。rLi-pL32/1-LipL41/2表达量约为细菌总蛋白的10 %。rLipL32/1和rLipL41/2兔抗血清均能识别并与rLipL32/1-LipL41/2结合。97 .4 %、78 .5 %和99 .1 %病人血清rLipL32/1、rLipL41/2和rLipL32/1-LipL41/2抗体阳性。结论本研究成功地构建了问号钩体lipL32/1-lipL41/2融合基因及其原核表达系统,rLipL32/1-LipL41/2不仅同时具有两个单一重组抗原的免疫反应性,且能提高钩体病人血清中抗体检测阳性率,可作为研制钩体属特异性基因工程疫苗或检测试剂盒的候选抗原。     

问号钩端螺旋体胶原酶在钩体病豚鼠模型的肺组织中的表达

目的通过克隆、表达问号钩端螺旋体赖型赖株的胶原酶基因colA(LA0872),以及制备抗胶原酶的多克隆抗体,观察胶原酶在钩体病豚鼠模型的组织中的表达,为研究其致病机制奠定基础。方法以问号钩端螺旋体赖型赖株基因组DNA为模板,用PCR扩增colA,产物克隆到表达载体pET-28b(+)中,构建含colA的重组质粒;将重组质粒转入E.coli Rosetta(DE3)菌株内,IPTG诱导表达后用Ni-NTA His-Bind亲和层析柱纯化重组蛋白;用纯化的重组蛋白免疫家兔制备抗胶原酶的多克隆抗体;Max Vision二步法染色检测胶原酶在感染钩端螺旋体的豚鼠肺组织中的分布。结果克隆表达目的基因,并成功制备了抗胶原酶的多克隆抗体。免疫组化显示在出血的肺组织中存在胶原酶。结论钩体病豚鼠模型的肺组织中有胶原酶的表达,并且存在于有钩端螺旋体分布的部位。本研究为进一步探讨胶原酶在钩端螺旋体侵袭和宿主组织出血中所起的作用奠定了基础。     

我国新型钩端螺旋体参考菌株的国际复核结果

本文报道了由美国CDC和荷兰RTI对我国分离发现的36株新型钧端螺旋体（钩体）参考菌株的国际复核检定结果。有24株钩体各实验室检定结果相一致,各自代表一个新的国际血清型,分属14个血清群24个血清型。有12株钩体检定结果互有差异,对此进行了分析,并提出了建议。因此,目前我国至少存在有14个血清群26个国际新血清型钩体存在。     

问号钩端螺旋体检测基因芯片的研制

目的　制备一种用于快速检测、鉴定问号钩端螺旋体的DNA微阵列芯片。方法　从Genbank中选取钩体 2 3SrDNA序列 ,设计一对种特异性引物和DNA探针 ,通过Blast的基因同源性比较 ,验证引物和探针的通用性与特异性。将合成的探针点样到玻片上制备成基因芯片。用Cy3标记引物 ,通过不对称PCR反应获取荧光素标记的靶序列 ,然后与制备的芯片杂交。结果　设计的引物与探针仅同时与问号钩体 2 3srDNA完全同源。该引物可扩增我国 18个血清群的 2 5株钩体 ,均出现单一 4 82bp的扩增产物 ,而双曲钩体及其他螺旋体、病原、空白对照均无任何DNA扩增条带。芯片杂交结果与常规PCR方法结果一致 ,敏感性高于PCR。结论　基因芯片可以快速、灵敏、特异地检测问号钩端螺旋体。     

LA0202为钩端螺旋体中一孔形成溶血素蛋白(英文)

目的研究LA0202为孔形成溶血素。方法体外克隆表达LA0202蛋白。纯化的LA0202蛋白作用绵羊血细胞观察LA0202的溶血活性并用渗透压保护剂PEG6000添加到作用体系研究渗透压保护剂对LA0202溶血活性的影响。透射电镜及扫描电镜观察LA0202作用于体外培养的肝细胞后对细胞的毒性。结果渗透压保护剂PEG6000能够抑制LA0202的溶血活性。LA0202作用于肝细胞后引起肝细胞的毒性损伤。结论LA0202为一孔形成溶血素。     

两株不同毒力株钩端螺旋体37℃培养条件表达谱的差异

目的 钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株毒力株56601（中赖）与钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株减毒株（法赖）在遗传背景上具有很大的相似性，但毒力却差别很大。本研究利用钩端螺旋体的cDNA芯片在全基因组水平上研究毒力差别的机制。方法 利用钩端螺旋体的cDNA芯片，在37℃培养条件下以钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株毒力株56601（中赖）为测试株，以钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株减毒株（法赖）为对照株，测试了芯片表达谱的变化。结果 在37℃培养条件下，毒力株和减毒株的表达谱具有明显的差别。毒力株上调表达的基因有101个，下调表达的有71个。这些差异表达的基因在功能上可分为12类。结论 这些差异表达的基因可能在钩端螺旋体毒力株致病力方面发挥一定的作用。     

多位点序列分型应用于致病性黄疸出血群钩端螺旋体分析

目的 初步探讨MLST(multilocus sequence typing)分型技术在致病性钩端螺旋体中的应用。方法 对我国3个省份的39株致病性钩端螺旋体黄疸出血群菌株提取DNA,采用7个位点进行PCR扩增、序列测定,应用eBURST和BioNumerics (Version5.10)软件进行分析。结果 39株菌株呈现5个ST型别, ST1为中国三省份中主要的基因型,占53.85%(21/39)。eBURST分析显示:39株菌株分为2个 Clonal complexes和1个singleton,其中Group1占66.67%(26/39),Group2占20.51%(8/39),一个singleton占12.82%(5/39);BioNumerics软件聚类分析显示:39株菌株分为3个Group,与eBURST分析中的分群结构一致。MLST基因型别具有明显的地域性特征。结论 MLST方法可初步应用于致病性钩端螺旋体分子流行病学、种群结构、亲缘进化关系等研究。     

问号钩端螺旋体fliN基因原核表达及其产物的鉴定

目的克隆问号钩端螺旋体(简称钩体)黄疸出血群赖型赖株鞭毛相关基因fliN并构建其原核表达系统,鉴定表达产物的免疫性。方法提取钩体株基因组DNA,高保真PCR扩增全长fliN基因片断,T-A克隆后测序。按常规方法构建fliN基因原核表达系统,并用IPTG诱导目的重组蛋白rFliN表达。采用SDS-PAGE结合Bio-Rad凝胶图象分析系统检测rFliN表达量,Ni-NTA亲和层析法提纯rFliN。采用兔抗问号钩体黄疸出血群赖株全菌抗血清的Western blot鉴定rFliN及其免疫反应性。结果与报道的相应序列比较,所克隆的fliN基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%。IPTG诱导原核表达系统pET32a-fliN-E.coliBL21DE3的rFliN表达量约占细菌总蛋白的30%,rFliN提纯后仅见单一的蛋白条带。rF-liN能与抗血清发生免疫结合反应。结论本研究成功地构建了高效表达目的重组蛋白的问号钩体fliN基因原核表达系统,RFliN有良好的免疫反应性,为深入研究FliN致病及免疫保护作用奠定了基础。     

我国4个钩端螺旋体血清群lipL21基因序列分析及其表达产物的鉴定

目的本文采用高保真PCR从我国主要流行的问号钩体黄疸出血群赖型56601株、波摩那群波摩那型56608株、流感伤寒群临型56609株及腐生性双曲钩体参考标准株三宝垄群patoc型PatocⅠ株基因组DNA中扩增了全长lipL21基因片段。序列分析结果表明,所克隆的4株钩体lipL21基因与已报道的相应序列(GenBankNo.:AY187271)比较,其核苷酸和氨基酸序列相似性分别高达99.64～99.82%和99.46～100%。所构建的问号钩体黄疸出血群赖型56601株lipL21基因原核表达系统在IPTG诱导下,能有效地表达目的重组蛋白rLipL21,其产量约为细菌总蛋白的10%。Westernblot结果证实,兔抗钩体TR/patocⅠ属特异性抗原血清能识别rLipL21并与之结合。上述实验结果提示,lipL21基因序列非常保守,其表达产物有良好免疫原性,可作为研制通用型钩体基因工程疫苗的候选抗原。     

问号钩端螺旋体colA基因产物胶原酶活性及其致病机制研究

目的了解不同问号钩端螺旋体(简称钩体)血清群colA基因分布和序列保守性、表达产物胶原酶活性以及感染细胞时colA基因表达水平变化和产物分泌情况。方法采用PCR及其产物测序法检测我国主要流行的7个问号钩体血清群代表株中colA基因并了解其序列保守性。构建问号钩体黄疸出血群赖型赖株colA基因原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提取表达的目的重组蛋白rColA。采用分光光度法检测rColA水解I~IV型天然胶原蛋白及Azocoll和Pz-肽合成底物能力并测定其Km和Kcat值。采用实时荧光定量RT-PCR和Western Blot分别检测问号钩体赖株感染HUVEC、BEAS-2B、L-02、HEK293细胞时colA-mRNA水平变化及ColA分泌情况。结果不同血清群问号钩体均能扩增出全长colA基因片段,其核苷酸和氨基酸序列相似性高达99.4%~100%。所构建的colA基因表达系统能有效表达rColA。rColA能不同程度地水解上述6种底物,但水解III型胶原蛋白能力最强(P0.05),其Km和Kcat值分别为2.16mg/mL和35.6h-1。问号钩体赖株感染各靶细胞时colA-mRNA水平显著升高(P0.01),问号钩体-细胞共培养物上清中可检出ColA。结论问号钩体colA基因为序列保守、分布广泛的胶原酶编码基因,感染细胞时该基因产物表达上调并外分泌,从而在问号钩体感染宿主过程中发挥实际作用。