长爪沙鼠小鼠肝炎病毒（MHV）RT-PCR检测方法

目的 建立长爪沙鼠小鼠肝炎病毒（MHV）RT-PCR检测方法,应用于长爪沙鼠、小鼠等实验动物MHV的检测。方法 根据已发表的小鼠肝炎病毒（MHV）S基因序列,设计合成引物。提取MHV细胞毒RNA,以其为模板,进行PCR扩增。优化反应条件,进行特异性、敏感性、稳定性、重复性试验。并对65只长爪沙鼠及12只小鼠进行检测。结果 建立的MHV RT-PCR检测方法特异、敏感、稳定。以MHV RNA逆转录产物为模板,所能检测RNA最小模板浓度为3.1pg/μl,可检测病毒最小滴度为10-3.ml-1。65只沙鼠经RT-PCR检测,均为阴性,12只小鼠经RT-PCR检测,有3只MHV阳性,测序结果与GenBank中MHV核酸序列同源性均为97%。结论 建立的长爪沙鼠小鼠肝炎病毒（MHV）RT-PCR检测方法可用于长爪沙鼠、小鼠等实验动物MHV的检测。     

长爪沙鼠小鼠肝炎病毒(MHV)RT-PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立长爪沙鼠小鼠肝炎病毒(MHV)RT-PCR检测方法,应用于长爪沙鼠、小鼠等实验动物MHV的检测。方法根据已发表的小鼠肝炎病毒(MHV)S基因序列,设计合成引物。提取MHV细胞毒RNA,以其为模板,进行PCR扩增。优化反应条件,进行特异性、敏感性、稳定性、重复性试验。并对65只长爪沙鼠及12只小鼠进行检测。结果建立的MHV RT-PCR检测方法特异、敏感、稳定。以MHV RNA逆转录产物为模板,所能检测RNA最小模板浓度为3.1 pg/μL,可检测病毒最小滴度为10-3/mL。65只沙鼠经RT-PCR检测,均为阴性,12只小鼠经RT-PCR检测,有3只MHV阳性,测序结果与Genbank中MHV核酸序列同源性均为97%。结论建立的长爪沙鼠小鼠肝炎病毒(MHV)RT-PCR检测方法可用于长爪沙鼠、小鼠等实验动物MHV的检测。     

脑心肌炎病毒（EMCV）RT-PCR检测方法的建立及初步应用

目的 建立脑心肌炎病毒（EMCV）RT-PCR检测方法,应用于长爪沙鼠、小鼠等实验动物EMCV的检测.方法 根据已发表的EMCV VP1基因序列设计合成引物.建立RT-PCR方法,并对方法的特异性、敏感性、稳定性等进行验证.用该方法检测62只长爪沙鼠、12只小鼠.结果 建立的EMCV RT-PCR检测方法特异、敏感、稳定.以EMCV RNA逆转录产物为模板,所能检测RNA最小模板浓度为4.1 pg/μL,可检测病毒最小滴度为10-7mL-1.经RT-PCR检测,62只沙鼠均为阴性;12只小鼠中有1只EMCV核酸阳性,测序结果与GenBank中EMCV标准株核苷酸序列进行比对,其同源性为85%.结论 建立的脑心肌炎病毒（EMCV）RT-PCR检测方法特异、敏感、稳定,可用于长爪沙鼠、小鼠等实验动物EMCV的检测.     

应用PCR方法对三种新型实验动物钩端螺旋体感染情况的调查研究

目的：建立有效的钩端螺旋体 PCR 检测方法,并对树鼩（（tree shrew, Tupaia belangeri））、长爪沙鼠（ Meriones unguiculatus; Mongolian gerbil）和灰仓鼠（ Cricetulus migratorius）等三种新型实验动物进行感染情况调查。方法针对 NCBI 公布的钩端螺旋体序列,设计并筛选特异性引物,优化 PCR 体系,进行特异性和敏感性测试;并运用优化 PCR 方法对树鼩、长爪沙鼠和灰仓鼠样品进行检测。结果成功建立钩端螺旋体 PCR 检测方法,序列测定验证了该方法的特异性。普通级树鼩钩端螺旋体的阳性率为8.33％,普通级长爪沙鼠钩端螺旋体为100％,清洁级长爪沙鼠和清洁级灰仓鼠钩端螺旋体的阳性率为0％。结论本研究建立了钩端螺旋体 PCR 检测方法,调查了树鼩、长爪沙鼠和灰仓鼠三种新型实验动物的感染情况,为这三种实验动物的研究和使用奠定基础。     

应用PCR方法对新型实验动物钩端螺旋体感染情况的调查研究

[摘要] 目的 建立有效的钩端螺旋体PCR检测方法,并对树鼩、长爪沙鼠和灰仓鼠等三种新型实验动物进行感染情况调查。方法 针对NCBI公布的钩端螺旋体序列,设计并筛选特异性引物,优化PCR体系,进行特异性和敏感性测试;并运用优化PCR方法对树鼩、长爪沙鼠和灰仓鼠样品进行检测。结果 成功建立了树鼩巴尔通体的PCR检测方法,序列测定验证了该方法的正确性。普通级树鼩钩端螺旋体的阳性率为8.33%,普通级长爪沙鼠钩端螺旋体为100%,清洁级长爪沙鼠钩端螺旋体和清洁级灰仓鼠钩端螺旋体的阳性率为0%。结论 本研究建立了钩端螺旋体PCR检测方法,调查了树鼩、长爪沙鼠和灰仓鼠三种新型实验动物的感染情况,为这三种实验动物的研究和使用奠定基础。     

利用双重PCR.技术研究长爪沙鼠的微卫星结构

目的 为了建立快速检测长爪沙鼠群体遗传多样性的方法及获得Z:ZCLA长爪沙鼠封闭群现用微卫星位点的结构.方法 利用17个微卫星位点(9个来自长爪沙鼠,8个来自大小鼠)进行了PCR反应体系及反应条件的优化,组合了6组双重PCR及两个复合式点样,用上述8个组合对普通级z:ZCLA长爪沙鼠封闭群43、44、45三个世代核心群各.100只种鼠进行遗传检测.结果 三个世代的300只种鼠的检测结果表明,9个长爪沙鼠位点均为微卫星,其中7个位点为完全型的微卫星,1个为复合型,1个为不完全型,多态性主要表现在核心序列的重复;来自大小鼠的8个微卫星位点,有7个在z:ZCLA长爪沙鼠核心群中得到有效扩增,只有3个位点在三个世代中均有出现,对测序结果分析后发现,其核心序列均为小卫星.结论 来自长爪沙鼠的位点,无论结构还是遗传方式均符合微卫星遗传标记的特点,可用作检测长爪沙鼠的群体遗传多样性.     

长爪沙鼠生化位点检测方法的优化设计

长爪沙鼠生化位点检测方法可用于长爪沙鼠的遗传质量分析，同时也为该动物群体遗传结构的研究提供了一种有效的手段。孙贺娟等基于首都医科大学的普通级长爪沙鼠，对长爪沙鼠生化位点的检测方法进行了探索。目前，有关规范实验长爪沙鼠遗传质量的检测方法至今仍是空白，这与该动物目前实验动物化的进程不相适应。另外，有关实验动物遗传质量的国家标准只给出了近交系大小鼠的质量检测规范，对于封闭群动物则没有相应的规定。基于此，我们在参照GB14923-2001、GB／T14927．1-2001及孙贺娟检测方法的基础上进行了试验，并在试验中对每个条件进行摸索，排除可能的干扰因素，在尽量取得较佳结果的基础上，对本中心长爪沙鼠生化位点的检测提出了一些优化设计。     

长爪沙鼠生物净化技术的研究

目的：为实现长爪沙鼠微生物质量升级和实验动物化目标,我们对长爪沙鼠实施生物净化。方法：在长爪沙鼠生物净化过程中,采取孕鼠选择和临产期判断、无菌剖腹产、仔鼠代乳以及独立通风笼盒（IVC）饲养管理和微生物检测等措施,比较了ICR小鼠、SD大鼠、长爪沙鼠代乳和饲料中添加营养成分对仔鼠代乳的影响。结果：本研究共实施长爪沙鼠无菌剖腹产达85胎次,通过ICR代乳鼠代乳并成功断乳167只。讨论：根据微生物检测结果,本研究顺利实现了长爪沙鼠生物净化,形成的关键技术有望为我国特色实验动物资源的生物净化提供参考。     

普通环境长爪沙鼠呼吸道菌群的分离鉴定

目的调查普通环境长爪沙鼠呼吸道细菌及支原体携带情况,为制定长爪沙鼠微生物学等级标准提供依据。方法对普通环境饲养的65只长爪沙鼠进行解剖,取气管分泌物接种血琼脂,分别放入普通培养箱和5%CO2培养箱中培养48 h,分离菌株后同时进行生化分析和PCR测序鉴定,以期准确判断分离菌株所属菌属;气管浸液提取DNA,用支原体特异性引物进行PCR检测,并分别计算检出率。结果本研究共检出22种细菌及支原体。不同细菌、支原体感染率相差很大,阳性率在1.5%(1/65)到64.6%(42/65)之间,其中部分细菌为大鼠和小鼠致病菌。结论本研究为长爪沙鼠的微生物学等级标准的制定提供了参考数据。     

动物宿主对弓形虫3种不同毒力株的易感性

本文应用弓形虫不同毒力虫株感染同一种宿主和应用同一毒力虫株感染不同动物及不同免疫状态的动物宿主，观察了ｓｔｄ／ｄｄｙ小鼠和长爪沙鼠对ＲＨ株、ＢＥＶ株和ＦＵＫ株弓形虫的易感性．结果见到，弱毒株（ＢＥＶ株－小鼠）和无毒株（ＦＵＫ株－小鼠）对长爪沙鼠具有强致死性．提出虫株毒力除了与原虫自身的生物学特性有关外，也是寄生虫－宿主相互作用的综合表现．因此，在根据实验动物的临床指标评价虫株毒力时，需附加动物模型条件.     

鸡胚致死孤儿病毒（CELO）和鸡减蛋综合症病毒（EDS） 多重PCR检测方法的建立及初步应用

【摘要】目的 建立鸡胚致死孤儿病毒（CELO）和鸡减蛋综合症病毒（EDS）的多重PCR检测方法并进行初步应用。方法 参照GenBank提供的基因序列,设计了2对特异性引物分别扩增CELO长纤突蛋白和EDS六邻体蛋白的基因序列,建立检测CELO和EDS的多重PCR方法,考察该方法的特异性和敏感性,并使用该方法检测流感疫苗主种子批病毒是否存在外源性禽腺病毒的污染。结果 该多重PCR方法成功扩增得到了两条特异性目的条带,并经测序验证。该方法特异性好,灵敏度显示核酸最低检测量可达10-4ug/ml。使用该方法检测12批次流感疫苗主种子批病毒,外源性禽腺病毒的检测结果均为阴性。结论 成功建立鸡胚致死孤儿病毒和鸡减蛋综合症病毒的多重PCR检测方法,灵敏度高,特异性好。在流感疫苗主种子批病毒的外源性禽腺病毒的检测中具有很高的使用价值和应用前景。     

念珠状链杆菌Taqman MGB荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

目的 建立念珠状链杆菌的实时荧光定量PCR检测方法, 实现该菌在多种实验动物中的快速检测。方法 根据NCBI公布的念珠状链杆菌序列, 设计特异性引物和探针, 通过对24株标准参考菌株的扩增, 验证其特异性、敏感性和重复性。运用所建立的方法对小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、长爪沙鼠和树鼩的共823份呼吸道样本进行检测。结果 用所建Taqman MGB荧光定量PCR方法在小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠和兔中未检出念珠状链杆菌;检出普通级长爪沙鼠和树鼩中念珠状链杆菌的阳性率分别为1.5%(1/65)和61.7%(37/60)。结论 本研究所建立的念珠状链杆菌Taqman MGB荧光定量PCR检测方法, 能够对实验动物中念珠状链杆菌进行快速准确的检测, 敏感性优于国标方法, 为实验动物质量检测体系的完善奠定了基础。     

猫疱疹病毒Ⅰ型PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立猫疱疹病毒Ⅰ型（FHV-1）PCR检测方法,应用于临床样品中FHV-1的快速检测。方法根据已发表的FHV-1TK基因序列设计合成引物,并以此建立FHV-1的PCR检测方法,并对方法的特异性、敏感性、稳定性等进行验证。用建立的方法对15份猫临床样品进行检测。结果建立的FHV-1PCR检测方法与单纯疱疹病毒Ⅰ型（HSV-1）、犬疱疹病毒（CHV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猫细小病毒（FPV）均无交叉反应;可检测病毒最小滴度为7lg TCID50/ml,相应的DNA模板浓度为1.46×102拷贝/ml;FHV-1DNA在-30℃冰箱放置12个月仍可检测出目的条带。应用该方法从15份猫临床样本中检测出10份FHV-1核酸阳性。结论建立的FHV-1PCR检测方法具有特异、敏感及稳定的特点,适合于临床FHV-1的感染检测。     

种间转移扩增法筛选长爪沙鼠微卫星位点

目的筛选长爪沙鼠新的微卫星位点,为长爪沙鼠遗传分析提供遗传标记物。方法从GenBank中随机选取小鼠微卫星位点引物536对,用这些引物对长爪沙鼠基因组DNA扩增,将阳性目的条带进行序列分析,找出符合微卫星序列特征的短串联重复序列。结果 536对小鼠微卫星引物在长爪沙鼠基因组中扩增出了313个阳性条带,经序列分析,确定130个长爪沙鼠微卫星位点;其中完美型位点占80.77%(105/130),不完美型位点占19.23%(25/130),与小鼠同源性为24.3%(130/536)。将筛选出的微卫星位点在GenBank中注册,注册号从GU562694到GU562823。结论小鼠和沙鼠的微卫星位点具有较高的同源性,用小鼠的微卫星位点引物直接扩增长爪沙鼠基因组DNA可有效地筛选出长爪沙鼠微卫星位点。     

活体长爪沙鼠幽门螺杆菌检测方法的建立

目的应用巢式PCR方法通过胃液活体检测长爪沙鼠幽门螺杆菌感染,从而建立可以持续监测长爪沙鼠幽门螺杆菌感染的检测技术。方法体外培养幽门螺杆菌并接种至长爪沙鼠体内,在感染后第10周使用普通PCR方法检测长爪沙鼠胃液,使用巢式PCR方法对长爪沙鼠胃液、胃组织、十二指肠内容物、结肠粪便进行检测;同时还利用快速尿素酶试验和血清ELISA方法等对比分析巢式PCR方法的准确性,上述PCR产物均经过测序验证。结果普通PCR方法检测胃液、巢式PCR方法检测胃液、胃组织、十二指肠内容物,结肠粪便以及快速尿素酶试验、血清ELISA检测方法检验结果阳性率分别为30%、100%、100%、90%、10%、100%和0%。比较不同检测方法的检测结果发现,胃液巢式PCR、胃组织巢式PCR和快速尿素酶试验均有100%的检测率,普通PCR检测胃液的方法、结肠粪便巢式PCR方法及血清学ELISA检测方法检测率均比较低。结论胃液巢式PCR检测方法由于其特异性、准确性及灵敏性较高等特点可以用于长爪沙鼠幽门螺杆菌的长期检测,特别是对于预防和治疗幽门螺杆菌感染的实验具有重要价值。     

呼肠孤病毒Ⅲ型(Reo3)RT-PCR检测方法的建立

目的建立呼肠孤病毒Ⅲ型(Reo3)RT-PCR检测方法,应用于实验动物及人用动物源性材料及生物制品外源Reo3的检测。方法根据已发表的呼肠孤病毒Ⅲ型(Reo3)M1基因序列,设计合成引物。提取Reo3细胞毒RNA,以其为模板,进行PCR扩增。优化反应条件,进行特异性、敏感性、重复性试验。结果建立的Reo3RT-PCR检测方法特异、敏感、稳定。以Reo3 RNA逆转录产物为模板,所能检测RNA最小模板浓度为0.42pg/μL,可检测病毒最小滴度为10-9/mL。结论建立的呼肠孤病毒Ⅲ型(Reo3)RT-PCR检测方法可用于实验动物及人用动物源性材料及生物制品外源Reo3的检测。     

多重荧光定量PCR检测婴幼儿腹泻病毒感染及其临床应用

目的:建立一种能同时检测婴幼儿腹泻粪便中常见病毒的多重荧光定量 PCR技术。方法:根据GenBank上几种病毒基因组保守序列设计引物序列,建立多重荧光定量PCR方法,对所建立的多重荧光定量PCR方法的特异性、灵敏性及重复性进行验证;并以所建立的方法对150例婴幼儿病毒性腹泻患者粪便标本进行检测。结果:所建立的多重荧光定量PCR检测方法具有很好的特异性,灵敏性检测可达102拷贝/mL,检测不同病毒核酸浓度各自的检测 Ct 值标准差均较小,变异系数均低于1.0%,具有较好的重复性;检测150 份粪便标本,多重荧光定量 PCR 的检出率为36%,胶体金方法检出率为38.67%,两者比较差别无统计学意义（χ2= 6.91,P > 0.05）。多重荧光定量 PCR方法中轮状病毒、腺病毒、诺如病毒、星状病毒的检出率分别为12.67%、6.00%、13.33%和4.00%,测序结果与已知病毒株基因都具有高度同源性。结论:所建立的多重荧光定量PCR方法快速、特异、灵敏,可以作为临床病原诊断的一个重要工具且适用于流行病学调查研究。