原代人脐静脉内皮细胞培养方法经验总结

目的 建立分离培养原代人脐静脉内皮细胞的方法。方法 采用0.125%胰酶+0.01%乙二胺四乙酸(EDTA)消化液灌注法,获得原代人脐静脉内皮细胞,用免疫组织化学方法进行细胞鉴定。结果 原代培养的脐静脉内皮细胞呈典型的铺路石样排列;细胞鉴定可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。结论 0.125%胰酶+0.01%EDTA消化法能够获取大量且纯度高的原代人脐静脉内皮细胞,为体外实验提供可靠的细胞模型。     

三种人脐静脉内皮细胞的培养鉴定及表面抗原表达比较

目的 探索建立稳定有效的原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)体外培养方法,并比较原代HU-VECs与HUVEC-CS、EA.hy926细胞株之间的表面抗原表达情况。方法 Ⅱ型胶原酶消化人脐静脉分离HUVEC,M199完全培养液培养,HUVEC-CS及EA.hy926用DMEM完全培养液。胰蛋白酶消化传代,对三种细胞进行形态学观察,流式细胞仪分析比较表面抗原的表达率。结果 原代HUVECs细胞为多角形,铺路石样排列;HUVEC-CS和EA.hy926细胞为圆形或扁平形,生长速度快,呈典型鹅卵石状排列。vWF因子免疫荧光染色:原代HUVECs及EA.hy926大部分细胞内可见绿色荧光,而HUVEC-CS为阴性。流式细胞仪分析原代HUVEC(s 77.7%)或EA.hy926(78.6%)CD31表达率明显高于HUVEC-CS(4.2%),原代HUVECs CD34表达率(43.3%)明显高于HUVEC-CS或EA.hy926(分别为1.6%、0.2%),差异有统计学意义。结论 脐静脉灌注Ⅱ型胶原酶消化法配合M199完全培养液可获得高纯度的内皮细胞,EA.hy926永生细胞株培养方法简单,短时间内可获得足够数量的细胞,两者均是组织工程及相关医学基础研究较好的细胞来源。     

原代人脐静脉内皮细胞的分离培养及其对人巨细胞病毒的易感性研究

目的 通过检测原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对人巨细胞病毒(HCMV)的易感性,探讨胎儿宫内感染HCMV的可能途径.方法 无菌条件下取30例健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐带,向脐静脉灌注0.1%胶原酶Ⅱ 37 ℃消化15 min,通过对细胞的形态学观察和免疫荧光染色方法对细胞进行纯度鉴定;用HCMV病毒株体外感染HUVEC,通过对HCMV基因及蛋白检测确定HUVEC对HCMV的易感性.结果 0.1%胶原酶Ⅱ、15 min的消化方法对HUVEC有较好的分离效果,免疫荧光染色结果表明HUVEC细胞内有Ⅷ因子相关抗原表达; HCMV体外感染HUVEC 72 h后形态学有明显改变,病毒基因及蛋白均有阳性表达.结论 原代HUEVC对HCMV易感,通过脐静脉的血液传播可能是胎儿宫内感染HCMV的重要途径之一.     

平阳霉素对人脐静脉内皮细胞株EA.hy926的作用及其机制

目的:观察平阳霉素(PYM)对人脐静脉内皮细胞株EA.hy926的作用及可能机制。方法:采用甲基三氯硅烷(MTS)比色法检测PYM对EA.hy926细胞体外生长的作用;流式细胞术测定PYM作用细胞24h后细胞凋亡、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3表达、线粒体膜电位的变化;免疫印迹(Western-blot)法检测PYM对EA.hy926细胞中Caspase-8、Caspase-9蛋白表达水平的影响。结果:PYM可明显抑制EA.hy926细胞的增殖,且生长抑制率具有浓度时间依赖性;流式细胞术检测结果显示PYM各浓度作用24h后,细胞凋亡百分率随药物浓度增加而增高,活化Caspase-3表达在PYM各浓度组均增强,线粒体膜电位在各浓度组均下降;Western-blot法检测结果显示PYM作用EA.hy926细胞后,Caspase-8、Caspase-9蛋白均可出现明显的剪切带。结论:PYM能抑制EA.hy926细胞的增殖,这种抑制作用是可通过诱导细胞凋亡实现的,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9参与了PYM诱导EA.hy926细胞凋亡的过程。     

人脐静脉内皮细胞的研究和应用

血管内皮细胞在人体多种生理和病理过程中发挥重要作用,一直以来都是研究的热点。其中使用最广泛的当属人脐静脉内皮细胞,然而就其各种亚系细胞有何特点和优劣,国内尚未见报道。现通过总结原代人脐静脉内皮细胞、延长寿命的脐静脉内皮细胞系、永生化的脐静脉内皮细胞系等在医学研究领域的应用和进展,对不同种类之间优势和局限性进行比较,从而更好地指导实际运用。     

人脐静脉内皮细胞的原代培养及鉴定

目的建立一种能大量分离人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)体外培养模型,并对其进行鉴定,为体外血管内皮细胞及相关疾病的研究搭建桥梁。方法采用0.1%Ⅰ型胶原酶分离脐静脉内皮细胞,于M199培养基(含20%胎牛血清,80%M199不完全培养基,1%终浓度为50μg/mL内皮细胞生长复合物,1%终浓度为100μg/mL肝素钠,1%青-链霉素,1%L-谷氨酰胺)中培养,待细胞80%以上融合后,用0.25%的胰酶和0.25%的EDTA消化传代,并在倒置显微镜下观察细胞形态,用免疫荧光法对细胞进行鉴定。结果原代培养的HUVECs在24 h后完全贴壁,2～3 d可达80%的融合,倒置显微镜下观察细胞呈鹅卵石状排布,免疫荧光显示细胞胞浆中Ⅷ因子相关抗原阳性。结论 0.1%Ⅰ型胶原酶消化HUVECs方法便于操作,细胞获得量多且生长状态良好。     

原代人脐静脉内皮细胞分离和培养方法的改进

目的建立一套高效、方便、可靠的脐静脉内皮细胞的体外分离和培养方法。方法取剖腹产新生婴儿脐带,加入Ⅰ型胶原酶消化分离人脐静脉内皮细胞,内皮专用培养基EGM-2培养传代。应用相差显微镜观察细胞形态。DiL-Ac-LDL染色证实细胞具有内皮功能。免疫荧光染色证明新分离细胞表达FⅧ相关抗原。流式细胞仪检测细胞表面表达CD31。结果原代培养细胞培养10～15d左右长成单层,细胞呈多角形,铺路石样排列。DiL-Ac-LDL染色阳性,证实细胞具内皮吞噬功能。免疫荧光检测证明细胞特异性表达FⅧ相关抗原。流式细胞仪检测证明细胞表面高表达CD31。结论通过酶灌注法消化脐静脉血管获得细胞,操作简便、高效,EGM-2培养基可保证内皮细胞具有较高纯度,细胞形态学观察和细胞生物学鉴定证明获得人脐静脉血管内皮细胞。     

人脐静脉内皮细胞的原代培养及鉴定

目的:体外进行人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)原代培养及鉴定.方法:用0.1%Ⅱ型胶原酶消化法收集HUVECs,加入含20%胎牛血清的M199培养基在37℃、5%CO2孵箱中培养,用Tryple express进行消化传代培养.采用细胞形态学观察、流式细胞仪测定CD34鉴定细胞.结果:原代培养的HUVECs在24 h完全贴壁,在3～5天融合成片,呈现单层铺路石样改变.流式细胞仪测定内皮细胞纯度为75.52%.结论:Ⅱ胶原酶及Tryple express的灵活使用可获得大量连续传代培养的HUVECs.     

血清饥饿对原代人脐静脉内皮细胞周期同步化的影响

目的探讨人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）的最佳饥饿条件,以建立高效稳定的 HUVECs体外分离提取方法,并为HUVECs相关实验提供研究基础。方法用0.1%Ⅱ型胶原酶灌注脐静脉腔消化15 min,收集 细胞并用内皮细胞专用培养基（含5%内皮细胞基础培养基、1%内皮细胞生长因子、1%青链霉素）,置37 ℃,5% CO2培养箱培 养。在倒置显微镜下观察细胞形态特点,并用细胞免疫荧光方法对所得细胞进行鉴定。用流式细胞术检测所得HUVECs的纯 度,并检测0%、0.1%、0.5%、1%血清浓度的培养基饥饿处理0、6、12、18、24 h对细胞周期的影响。结果0.1%Ⅱ型胶原酶消化可 以得到HUVECs,细胞培养呈典型的铺卵石状排列,细胞较密处呈涡旋状排列。免疫荧光检测细胞VIII因子相关抗原表达呈阳 性。流式检测细胞纯度高达99.67%。不同血清浓度培养基培养6 h可获得70%左右的G0/G1期细胞;培养12 h可获得80%~90% 的G0/G1期细胞;培养18、24 h 可获得95%左右的G0/G1期细胞。结论0.1%Ⅱ型胶原酶充盈静脉管腔可以获得高纯度的原代 HUVECs。完全无血清培养基培养12 h即可获得纯度超过80%的G0/G1期HUVECs。     

人脐静脉内皮细胞的培养与鉴定

目的研究人脐静脉内皮细胞的体外培养方法,并进行细胞鉴定。方法胰蛋白酶灌流消化法收集人脐静脉内皮细胞,加入DMEM/F12混合培养基,37℃5%CO2培养箱中培养,观察细胞形态及生长状况,近融合时消化传代培养。采用形态学观察和CD34免疫组化法进行细胞鉴定。结果原代培养的人脐静脉内皮细胞约于24h完全贴壁,4~5d后融合成单层铺路石样结构。CD34染色证实培养的细胞是人脐静脉内皮细胞。结论胰蛋白酶灌流消化法可获得大量连续传代扩增的人脐静脉内皮细胞。     

人脐静脉内皮细胞的原代培养

目的建立一种能大量分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC)且操作方便的体外培养方法。方法采用不同浓度的Ⅱ型胶原酶(0.05%,0.1%和0.2%)对HUVEC进行灌注,并分别孵育不同的时间(10min,13min,15min和18min)进行消化,观察细胞的形态、数量以及生长融合情况。结果采用0.1%的胶原酶消化10-13min为最佳条件,经光学显微镜观察培养的细胞数量较多,生长、繁殖状态良好,培养3d左右细胞可达到融合状态。结论本实验建立的胶原酶法消化HUVEC培养方法简便,细胞获得量较多且生长状态良好。     

人脐静脉内皮细胞体外培养方法

目的探索人脐静脉内皮细胞体外培养方法和注意事项。方法采用0.1%I型胶原酶分离脐静脉内皮细胞,于RPMI-1640和20?S内培养,待细胞80%融合后,以0.25%胰蛋白酶和0.02?TA消化传代,并以倒置光显微镜观察内皮细胞生长情况,以免疫组化方法对内皮细胞进行鉴定。结果原代培养细胞在接种4 h后开始贴壁生长,5~7 d后融合成单层,倒置光显微镜下观察细胞呈鹅卵石状排列,有接触抑制现象,免疫组化显示细胞胞浆内Ⅷ因子相关抗原阳性。结论用胶原酶灌注消化脐静脉是获得内皮细胞的一种较可靠的方法,成活率较高,培养的多个环节均需关注。     

人脐静脉内皮细胞体外培养方法的改进

目的 建立一种能大量分离人脐静脉内皮细胞(HUVECS)的体外培养方法,为血管内皮细胞的大规模体外实验研究奠定基础.方法 比较0.25%胰酶、0.1%Ⅰ型胶原酶、0.25%胰酶与0.1%Ⅰ型胶原酶(1∶1)3种消化方法分离HUVECs的细胞数量和活细胞率的差异.观察血管内皮细胞生长因子(VEGF)对细胞生长的影响.细胞鉴定采用形态学观察和免疫荧光法检测.结果 0.1%Ⅰ型胶原酶单独或混合0.25%胰酶消化分离细胞数量较多、活细胞率较高(P＜0.05).VEGF能明显促进细胞增殖能力,延长细胞自然生长时间.细胞呈单层"铺路石"样排列,免疫荧光细胞化学法染色,激光买聚焦检测可见胞质中绿色荧光颗粒.结论 Ⅰ型胶原酶与胰酶混合消化HUVECs是获取血管内皮细胞的一种经济且效果较好的方法,添加VEGF能明显促进细胞增殖,可用于构建体外研究血管内皮细胞的模型.     

一种改进的人脐静脉内皮细胞的培养方法

目的:建立稳定的人脐静脉内皮细胞分离和培养的方法. 方法:采用胰蛋白酶/胶原酶(1∶1)混合酶液消化法培养人脐静脉内皮细胞,简化完全培养液组分(不添加血管内皮细胞生长因子、肝素等辅助因子),当原代培养细胞80%以上汇合后用胰蛋白酶消化传代;用形态学、免疫细胞化学法进行鉴定. 结果:种植在培养瓶中的内皮细胞4h贴壁生长,48～96 h生长最快,7～10 d汇合. 内皮细胞呈单层铺路石样外观,Ⅷ因子相关抗原(Ⅷ:Ag)和内皮细胞生长因子受体2(KDR)鉴定内皮细胞纯度达95%以上. 结论:用混合酶液灌注脐静脉消化内皮细胞是获取内皮细胞的一种好方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型.     

尼古丁对人脐静脉内皮细胞凋亡及坏死的影响

目的不同浓度尼古丁对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡及坏死的影响。方法用CD34以免疫组织化学法鉴定HUVECs。通过3种不同浓度的尼古丁(3、30、300 ng/ml)刺激HUVECs 24 h后,用流式细胞仪检测其凋亡及坏死率。结果低浓度尼古丁促进细胞凋亡最强,而随着尼古丁浓度的增加,细胞凋亡率反而逐渐降低,各组差异具有统计学意义(P<0.05);此外,随着尼古丁浓度增加,细胞坏死率也日益增多,各组差异具有统计学意义(P<0.05)。细胞坏死率与尼古丁浓度呈正相关(r=0.675)。结论尼古丁对HUVECs凋亡的影响具有浓度依赖性,细胞坏死率与尼古丁浓度呈正相关。     

威麦宁对PG细胞与HUVEC黏附作用的影响

目的研究威麦宁体外对人高转移肺癌细胞(PG)与血管内皮细胞(HUVEC)黏附作用的影响,探讨其抗肿瘤转移作用机制。方法MTT法检测威麦宁对PG、HUVEC活力的影响;虎红染色法检测威麦宁对PG细胞与HUVEC黏附作用的影响,检测对肿瘤坏死因子(TNF-α)活化的HU-VEC与PG细胞黏附作用的影响。结果威麦宁(31.25、62.5 mg/L)作用PG、HUVEC 24 h后,对两种细胞的存活率即活力皆没有影响(P>0.05)。威麦宁(31.25、62.5mg/L)作用PG细胞24 h后,对HUVEC的黏附有明显抑制作用(P<0.05,P<0.01);作用HUVEC 6、12 h后,能明显降低TNF-α诱导的HUVEC对PG细胞的黏附作用(P<0.01)。结论威麦宁可能通过对PG细胞和HUVEC双重作用,抑制PG-HUVEC间的黏附,从而抑制肿瘤细胞的血道转移。     

葡萄糖和胰岛素对人脐静脉内皮细胞蛋白C受体分泌水平的影响

目的：探讨在葡萄糖和胰岛素作用下人脐静脉内皮细胞可溶性内皮细胞蛋白C受体(sEPCR)的分泌,阐明内皮功能损伤与糖尿病血栓形成的机制。方法：将体外培养的人脐静脉内皮细胞分为葡萄糖组(5.5、20.0和40.0 mmol·L-1)、胰岛素组(0.1、1.0和10.0 nmol·L-1)、高糖(40 mmol· L-1)环...     

不同培养基对人脐静脉内皮细胞体外培养效果的影响

目的研究不同培养基对人脐静脉内皮细胞体外培养生长的影响,探讨内皮细胞的最佳体外扩增培养条件。方法取健康产妇分娩后脐带,用胶原酶Ⅰ消化后得脐静脉内皮细胞,进行原代培养,并用免疫荧光染色的方法对细胞进行鉴定,传代培养时则分别采用RPMI-1640培养基和EGM-2培养基,倒置显微镜观察两种培养条件下细胞的生长状态,同时利用流式细胞仪检测其生长周期,对比培养效果。结果 EGM-2组内皮细胞生长良好,2d后贴壁生长的细胞可达90%。EGM-2组S期细胞比例为(29.07±1.48)%,RPMI-1640培养基组S期细胞为(17.58±3.49)%,二者比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论 EGM-2培养基更适合人脐静脉内皮细胞的体外传代扩增培养。