鼠疫耶尔森氏菌基因分型的研究进展

鼠疫是一种典型的自然疫源性疾病，鼠疫菌、宿主、媒介之间保持相对的生态平衡，鼠疫菌的生存繁殖依赖于宿主动物，蚤类寄生于宿主动物，并作为传播媒介使鼠疫菌传播循环于宿主动物之间，从而形成稳定的鼠疫自然疫源性。鼠疫的自然疫源性最终取决于自然疫源地的地理景观和生态环境：地理景观和自然生境决定了宿主和媒介的种数及其生态学特征，宿主、媒介、鼠疫菌相互作用的复合体（宿主生态位）决定了鼠疫菌的存在和型别。不同自然疫源地来源的鼠疫菌存在诸多差异，不同型别的鼠疫菌对不同宿主动物的免疫原性和毒力具有明显差异，不同宿主动物对同一型别鼠疫菌表现出不同的感受性和敏感性。因此，鼠疫菌的分型工作可以帮助追溯感染的来源及其与其他近缘微生物的遗传关系，判断其毒力、免疫能力和流行病学特征，追踪其在进化中的系统发育地位。     

鼠疫耶尔森氏菌研究进展

鼠疫耶尔森能导致致病性极强的鼠疫,曾在世界范围内引起3次大流行,可作为生物武器使用。鼠疫耶尔森菌的全基因组序列已测定完成,3个毒性质粒上含有诸多与致病性有关的基因。对鼠疫耶尔森菌遗传特征的研究已进入后基因组时代。本文就鼠疫耶尔森茵的基因组,遗传特征及检测技术等方面作一综述。     

耶尔森菌选择培养基在鼠疫耶尔森菌分离培养中的应用

目的了解大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鼠疫耶尔森菌等实验菌株在不同培养基上的生长情况。方法将9种实验菌株分别接种营养琼脂培养基、赫氏培养基、耶尔森菌选择培养基进行分离培养。结果 9种实验菌株在营养琼脂培养基、赫氏培养基上生长良好,而在耶尔森菌选择培养基上只有鼠疫耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌、假结核耶尔森菌生长,其它实验菌株受到抑制未生长。结论耶尔森菌选择培养基在鼠疫耶尔森菌的分离培养中优于营养琼脂培养基和赫氏培养基。     

广东省鼠疫疫源地小肠结肠炎耶尔森氏菌生物学特性研究

目的了解广东省鼠疫疫源地8株耶尔森氏菌的生物学特性及与鼠疫菌的免疫原性关系。方法采用生长特性、糖醇酵解、毒力因子、药敏、动物试验和免疫原性血清学等试验。结果试验菌株菌落圆形光滑,G-短杆菌,22℃有动力3、7℃无动力;生化试验6株菌与标准株基本一致,2株菌有偏差;8株菌均对氯霉素、痢特灵、舒普深、环丙沙星、先锋噻肟、庆大霉素敏感;2株菌为VW 株,3株为VW±株,VW 及VW±株对小白鼠有致病性;8株菌均与小肠结肠炎菌0:3血清型的抗血清呈强凝集反应,与鼠疫菌、假结核菌的抗血清不凝集;每株菌免疫血清进行鼠疫IHA试验均阴性。结论8株菌为小肠结肠炎菌0:3血清型,其中6株为典型菌株,2株为非典型菌株,血清学上与鼠疫菌、假结核菌无免疫原性交叉反应。     

广东省鼠类耶尔森氏菌现状分析

目的 了解广东省鼠疫疫源地和非鼠疫疫源地鼠类耶尔森氏菌的分布和相互抑制的情况。方法 分别采用间接血球凝集试验（IHA）、放射免疫沉淀试验（RIP）进行鼠疫耶尔森氏菌特异性F1抗体检测，并分别对鼠类回盲部内容物和肝、脾、舌进行冷增菌后，以选择培养基分离。结果 广东省鼠疫疫源地未检出任何一种耶尔森氏菌，而非鼠疫疫源地区检出小肠结肠炎耶尔森氏菌2株，中间型耶尔森氏菌1株。结论 广东省鼠疫疫源地处于静息期，在鼠疫疫源地区和非疫疫源地区耶尔森氏菌存在互相抑制现象。     

广东省鼠疫静息期小肠结肠炎耶尔森氏菌分布调查

目的 查明广东省鼠疫疫源地静息期小肠结肠炎耶尔森氏菌在啮齿动物感染和自然环境中分布情况。方法 采集鼠回盲部内容物378份、菜市摊位污水200份和猪场猪粪200份各分别放入改良PBS缓冲液中，置4℃增菌3周，经KOH溶液处理后，涂布IN培养基；蚤类直接拉胃接种IN培养基。置28℃24h，挑取可疑菌落鉴定。结果 从鼠、猪粪、蚤分别检出小肠结肠炎菌9、50和1株。结论 广东省鼠疫疫源地内静息期啮齿动物小肠结肠炎耶尔森氏菌携带率偏低，而在局部地区猪携带率很高，已造成流行。     

鼠疫抗原及其免疫作用的研究进展

目的:鼠疫耶尔森氏菌作为鼠疫的病原菌,致病机制十分复杂,到目前为止,对于鼠疫的免疫机制并不十分清楚,而且尚无有效的疫苗预防鼠疫。随着人们对鼠疫抗原研究的不断深入,对其发挥的免疫作用的功能有了新的认识。本文就鼠疫抗原及其免疫作用研究进展作一综述。     

广东省非鼠疫疫源地三株耶尔森氏菌生物学特性的研究

目的研究三株耶尔森氏菌生物学特性,查明该菌株与鼠疫菌的免疫原性关系。方法采用生长特性、糖醇酵解试验、毒力因子和免疫原性交叉等试验方法。结果试验菌株的菌落呈圆形光滑、G^-短杆菌、22℃有动力、37℃无动力,生化测试葡萄糖、蔗糖、尿素、甘露醇和山梨醇阳性,鸟氨酸出现不稳定,而赖氨酸、鼠李糖、明胶和乳糖呈阴性,对氯霉素和链霉素呈高度敏感,而青霉素有耐药性,三株菌与鼠疫菌和假结核菌的抗血清不起凝集作用,而且与鼠疫反向试验的诊断液不发生凝集。三株菌抗血清与鼠疫间接血凝试验的诊断液不起凝集作用。结论153和271菌株属小肠结肠炎菌(生物Ⅰ型),而272菌株属中间型耶氏菌．它们与鼠疫菌和假结核菌无免疫原性交叉反应。     

广西31株鼠疫耶尔森氏菌鉴定及鼠疫疫源地性质的探讨

目的对31株鼠疫耶尔森菌进行系统的鉴定,探讨广西鼠疫自然疫源地的结构及性质,为今后防治措施的制定提供依据。方法采用鼠疫细菌学常规方法和分子生物学手段确定其生物学表型特征及基因组特征。结果31株菌株均具备鼠疫菌的典型形态特征,能被鼠疫噬菌体完全裂解,主要生化特性为阿胶糖（＋）、鼠李糖（-）、麦芽糖（＋）、甘油（＋）、脱氮（＋）,毒力因子（Pgm）呈阳性、弱阳性和阴性的比例为6：5：4;对Lawton和Glu呈半依赖,对Phe依赖;对22种常用的抗生素敏感,有4种抗生素耐药;含有相对分子量为4MD、6MD、45MD、65MD和111MD五种质粒。结论广西鼠疫菌属E群滇闽居民区型,推测广西的鼠疫流行可能是滇黔桂三省区交界地区相同鼠疫自然疫源地的内源性复燃。     

云南省鼠疫静息期家鼠鼠疫疫源地犬中致病耶尔森菌调查

目的 对云南省家鼠鼠疫疫源地鼠疫指示动物-犬中致病性耶尔森菌分布情况调查分析,以探求鼠疫菌微生态状况,为研究鼠疫的流行与静息提供更多线索。方法 2016年7月—2017年8月采用多重分层抽样法在云南省抽取不同时间进入流行静息期、不一样流行强度和不同地理位置的家鼠鼠疫疫源县共10个（历史疫区、近史流行区、复燃疫区、现疫区）作为调查点,采集犬肛门拭子置于改良PBS中,经4 ℃冷增菌15 d后,吸取混匀的培养液1 mL 提取DNA,采用PCR方法检测foxA、inv及caf1基因,并对基因阳性材料采用耶尔森选择培养基分离菌株,提取菌株的DNA并检测其ail毒力基因。结果 云南省10个疫源县共采集犬肛门拭子标本915份,foxA 基因检测阳性率为1.64%（15/915）,未检出inv基因与caf1基因阳性。小肠结肠炎耶尔森菌分离阳性率为1.3%（12/915）,其中2株具有ail 毒力基因;未分离到鼠疫耶尔森菌和假结核耶尔森菌。结论 云南省家鼠鼠疫疫源地犬中存在小肠结肠炎耶尔森菌的分布;未发现鼠疫菌线索,其原因值得进一步探讨。     

S系统及时序布尔网络模型构建鼠疫耶尔森菌基因调控网络的初步研究

目的应用S幂率系统构建鼠疫耶尔森菌小尺度基因调控网络。方法收集鼠疫耶尔森菌基因时间序列表达数据,数据经预处理后,分别用布尔网络模型和S幂率系统网络模型构建小尺度基因调控网络,并对两个网络结构进行比较。结果应用布尔网络模型构建的小尺度基因调控网络中存在2种基因调控模式,而应用S幂率系统网络模型构建的小尺度基因调控网络中存在4种基因调控模式。结论 S幂率系统可用于构建基因调控网络模型。     

大鼠RGS4基因的克隆及在原核中的表达

目的构建pGEX4T-1-RGS4载体,并检测融合蛋白GST-RSG4在原核中的表达水平。方法采用RT-PCR方法,将克隆SD大鼠G蛋白信号转导调节因子(regulator of G protein signaling4,RGS4)基因全长编码区的cDNA连接到原核表达载体pGEX4T-1中,IPTG诱导原核表达,通过Western blot检测融合蛋白GST-RSG4的表达水平。结果成功构建了pGEX4T-1-RGS4载体;经IPTG的诱导,RGS4可与GST以融合蛋白的形式高效表达。pGEX4T-1-RGS4在原核内表达产物相对分子质量约为50×103,与预期融合蛋白大小一致。结论构建的重组质粒能够在大肠杆菌中高效表达。     

青海高原喜马拉雅旱獭血清中特异性鼠疫噬菌体抗体的检测

目的 利用微量法间接检测青海高原喜马拉雅旱獭血清中特异性鼠疫噬菌体抗体,为后续噬菌体和哺乳动物免疫学之间的相互作用、噬菌体治疗、噬菌体与生态学研究提供理论依据。方法 以青藏高原鼠疫疫源地分离的3株野生型鼠疫噬菌体和实验室诊断用鼠疫噬菌体为抗原,利用微量板法和双层琼脂平板法定性检测青海高原同德县、贵南县、共和县、兴海县、天峻县5个疫源县采集于2020年、2021年7—9月份喜马拉雅旱獭血清中的特异性鼠疫噬菌体免疫抗体。结果 4株鼠疫噬菌体分别与847份喜马拉雅旱獭血清进行中和试验,通过点滴法均未检测到与鼠疫噬菌体抗原反应的特异性噬菌体免疫抗体。结论 青海高原喜马拉雅旱獭血清中未发现特异性鼠疫噬菌体抗体,这与2020—2021年青海省天峻县、同德县、共和县、兴海县、贵南县5个鼠疫疫源县采样地点的鼠疫流行病学显示为静息期无鼠疫病原体存在的流行特点一致,即无鼠疫病原体的存在,间接说明这些鼠疫疫源地鼠疫噬菌体不存在或者比较微弱的存在,故检测不到特异性鼠疫噬菌体免疫抗体。可能反映了宿主动物与鼠疫噬菌体自然接触频率少,抗噬菌体抗体可能与鼠疫感染的形式和疾病的强度有关。     

屋尘螨抗原Der p2基因的克隆和表达

目的构建并克隆屋尘螨抗原Der p2基因,在大肠杆菌中初步表达. 方法根据已发表的Der p2基因,人工设计合成一系列基因片段,经单链扩增后连接成完整的Der p2基因;将该基因克隆入表达载体pProEX HTb中,测序并进行初步表达. 结果利用所设计的结构制备了完整的Der p2基因,以大肠杆菌为宿主在IPTG的诱导下获得初步表达,该外源蛋白Mr约为17×103,占总蛋白量的20%. 结论所构建的Der p2基因能在大肠杆菌中表达.     

Different strategies for preparation of non-tagged rV270 protein and its efficacy against Yersinia pestis challenge

Objective LcrV is an important component for the development of a subunit vaccine against plague.To reduce immunosuppressive activity of LcrV,a recombinant LcrV variant lacking amino acids 271 to 326 （rV270） was prepared by different methods in this study.Methods A new strategy that produced non-tagged or authentic rV270 protein was designed by insertion of rV270-thrombin-hexahistidine fusion gene into the vector pET24a,or by insertion of hexahistidine-enterokinase-rV270 or hexahistitine-factor Xa-rV270 fusion gene into the vector pET32a.After Co2＋ affinity chromatography,a purification strategy was developed by cleavage of His tag on column,following Sephacryl S-200HR column filtration chromatography.Results Removal of His tag by thrombin,enterokinase and factor Xa displayed a yield of 99.5%,32.4% and 15.3%,respectively.Following Sephacryl S-200HR column filtration chromatography,above 97% purity of rV270 protein was obtained.Purified rV270 that was adsorbed to 25% （v/v） Al（OH）3 adjuvant in phosphate-buffered saline （PBS） induced very high titers of antibody to rV270 in BALB/c mice and protected them （100% survival） against subcutaneous challenge with 106 CFU of Y.pestis virulent strain 141.Conclusion The completely authentic rV270 protein can be prepared by using enterokinase or factor Xa,but they exhibited extremely low cleavage activity to the corresponding recognition site.Thrombin cleavage is an efficient strategy to prepare non-tagged rV270 protein and can be easily operated in a large scale due to its relatively low cost and high cleavage efficacy.The recombinant rV270 can be used as a key component to develop a subunit vaccine of plague.     

青海省格尔木市鼠疫耶尔森菌生化特征及基因分型研究

目的 了解青海省格尔木市鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）的生化特征,进行规律成簇的间隔短回文重复序列（CRISPR）基因分型和差异区段（DFR）研究,为青海省格尔木市鼠疫菌鉴定溯源、鼠疫科学防控提供理论依据。方法 选取1967年以来青海省格尔木市境内从人尸、宿主动物及媒介昆虫体内分离出28株鼠疫菌,通过糖醇酵解实验,研究其生化特征。采用十二烷基磺酸钠裂解和苯酚-氯仿法提取鼠疫菌DNA。分别对CRISPR的YPa、YPb和YPc3个位点进行PCR扩增并测序,然后将所测得CRISPR序列与文献最新报道的CRISPR Dictionary和NCBI数据库检索比对,以鉴定CRISPR spacer阵列。最后根据CRISPR spacer阵列的多态性对青海省格尔木市鼠疫菌进行基因分型。采用23对DFR(DFR01-DFR23)分型引物和质粒验证引物（PMT1）对试验菌株DNA进行分型验证。结果 鼠疫菌糖醇类酵解表型特征研究结果显示,28株鼠疫菌对甘油、阿胶糖、麦芽糖的酵解均为阳性,对鼠李糖、蜜二糖、脱氮的酵解均为阴性。CRISPR分型发现10种spacer,包括YPa 5种、YPb...     

Amplification，cloning，sequencing and expression of the gene encoding the major surface antigen of Toxoplasma gondii isolated

Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇｔｈｅｍａｊｏｒｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎｏｆＴｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｉｉｓｏｌａｔｅｄｉｎＣｈｉｎａ￥ＣｈｅｎＸｉａ...     

人黑色素瘤抗原MAGE-A10的基因克隆及原核表达

目的:扩增和克隆人黑色素瘤抗原MAGE-A10(melanoma antigen A10)cDNA,构建原核表达载体并在大肠杆菌表达. 方法:从人黑色素瘤细胞系LiBr中提取总RNA,用RT-PCR从中扩增出MAGE-A10 cDNA,插入载体pMD18-T中. 测序正确后,克隆至原核表达载体pGEX-4T-3中,构建重组表达载体pGEX-4T-3-MAGE-A10,转化大肠杆菌BL21株进行表达. 经IPTG诱导表达,谷胱甘肽亲和层析获得重组目的蛋白. 结果:成功获得MAGE-A10编码基因并构建原核表达载体,测序结果与GenBank收录序列相一致. 可以获得部分可溶性的原核重组蛋白,经亲和层析和分析,证实融合蛋白占总量的58.9%. SDS-PAGE分析其相对分子质量(Mr)为67 000,Western blot证实为目的蛋白. 结论:成功获得MAGE-A10 cDNA,构建得原核表达载体并获得高效表达. 本研究为制备MAGE-A10 mAb及研究MAGE-A10可能参与肿瘤发生发展的机制奠定了基础.     

麻风杆菌α2抗原基因的克隆及表达研究

目的用现代分子生物学技术即基因工程手段制备麻风杆菌抗原。方法用原位斑点杂交法筛选阳性克隆,并对其中一株约３０００ｂｐ的ＤＮＡ片段进行酶谱和ＤＮＡ序列分析。结果从本实验组制备的麻风杆菌基因文库中筛选出２株含α２抗原的基因片段,并建立了α２抗原基因在大肠杆菌中的表达体系,在ＸＬＩ－Ｂｌｕｅ菌株中大量表达出易于提纯的α２重组融合蛋白抗原,经麦芽糖亲和色谱柱提纯后,每２００ｍｌ转化宿主菌培养液可获得１０ｍｇ重组融合蛋白。结论α２重组融合蛋白抗原的制备对于探讨麻风病的发病机制、建立麻风病和其它抗酸杆菌疾病（如结核病等）的高度特异性血清学诊断方法都有意义。     

CTLA—4在大肠杆菌中的克隆和表达

目的 在原核表达系统大肠杆菌中表达具有生物活性的人毒性T淋巴细胞相关蛋白－4可溶性部分（human soluble CTLA-4)。方法 PCR扩增获得CTLA－4编码基因,利用表达载体pGEX－2T构建重组质粒2TC,在所获DNA片段与文献报道CTLA－4序列一致。在重组大肠杆菌中0．10mmol/L IPTG诱导4h可大量生成相对分子质量40000的GST－CTLA4融合蛋白。Westen blot分析表明原核表达产物CTLA－4具抗原抗体结合活性。结论 hsCTLA－4可在原核表达系统中表达并具有免疫活性。