肝细胞癌相关微小RNA研究进展

微小RNA(miRNA)是近年来研究较多的内源性非编码小RNA,能与靶基因3''UTR进行不完全配对,通过序列特异性翻译抑制或信使RNA降解来调控靶基因表达,参与细胞发育、增殖、分化、凋亡等一系列重要生物学进程,并在肿瘤的发生和发展过程中起着重要作用。越来越多的研究证实miRNA与肝细胞癌的发生发展、侵袭转移、血管生成、术后复发等生物学行为相关;并有研究者将miRNA用于肝细胞癌的早期诊断及治疗。本文就与肝细胞癌相关的miRNA研究作一综述。     

原发性IgA肾病中微小RNA的差异表达研究

目的 借助微小RNA(microRNA,miRNA)芯片研究IgA肾病(IgA nephropathy,IgAN)中miRNA的差异表达. 方法 收集11例IgAN患者肾穿标本作为IgAN组,3例镜下病理检查止常的肾皮质作为对照组.使用Trizol试剂提取每组总RNA,分离miRNA,采用miRNA芯片筛选出差异表达显著的miRNA,荧光实时定量PCR(Real-time PCR)技术验证芯片结果的可靠性.结果 IgAN组中miRNA表达出现显著差异的有66个,其中表达显著上调35个,显著下调31个.挑选has-miR-637、has-miR-492进行Real-time PCR相埘定量检测,结果显示2个miRNA的表达趋势与芯片结果相符,证明了芯片结果的可靠性. 结论 IgAN是一种经典的多因素、多基因病,本实验通过芯片技术表明miRNA在IgAN中出现显著差异表达.     

基于生物信息调控网络的肝细胞癌核心标志物筛选

目的 通过生物信息学分析,探索肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）诊断中潜在的miRNA标志物。方法 收集GEO数据库中诊断为HCC患者的临床资料并进行筛选,通过R软件识别差异表达的miRNA、mRNA,运用MiRWalk数据库预测筛选出来的差异miRNA的下游靶mRNA。利用网络生物信息分析工具进行gene ontology(GO)功能注释分析和kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG)通路富集分析,建立蛋白互作网络（protein-protein interaction network,PPI),并通过Cytoscape软件分析出关键基因,进而构建mRNA-miRNA的调控网络。结果 共筛选出了152个高表达和109个低表达的差异表达基因,其中上调的关键基因为BUB1B、AURKA、CCNA2、TOP2A、RACGAP1、MKI67、RRM2、KIF4A、NCAPG、FOXM1;下调的关键基因为IGF1、HGF、PDGFRA、CXCL12、DCN、TGFA、NRG1、FOXO1、AR、NAMPT。通过...     

长链非编码RNA和微小RNA相互作用参与调控肝细胞癌发生和发展的研究进展

原发性肝癌(PLC)是最常见的恶性肿瘤之一,其恶性程度高,发病率和死亡率均位居恶性肿瘤的前列,其中75％以上为肝细胞癌(HCC).长链非编码RNA(lncRNAs)、微小RNA(miRNAs)等非编码RNA(ncRNAs)在肝癌细胞的增殖、分化、转移等生物学过程中发挥着重要作用,它们之间如何通过相互作用参与调控HCC的...     

肝细胞癌中微小RNA mir219启动子区异常甲基化和表达下调

目的:微小RNA(microRNA)异常在肿瘤发生发展中起重要作用,本研究探讨microRNA mir219在肝细胞癌中的异常甲基化和异常表达,可能参与肝细胞癌的发生发展过程.方法:采用pyrosequence、TA克隆测序等方法检测正常肝组织、肝细胞癌细胞株和肝癌标本中mir219上游预测启动子区域甲基化,Taqman实时定量Rt-PCR测定肿瘤组织表达.结果:与正常肝脏组织相比,肝癌细胞株、肝癌标本中mir219上游预测启动子区域中茎环区和上游1kb区域的CpG岛存在高度甲基化.肝癌细胞株、肝癌标本中mir219表达显著下调,与其异常甲基化相关.结论:肝癌中微小RNA mir219茎环序列上游1094 bp区域存在启动子区异常甲基化,表达下调,提示mir219异常可能在肝细胞癌发生发展巾起重要作用,是潜在的抑癌基因.     

MicroRNA在HepG2肝癌细胞表达差异谱的研究

目的 建立HepG2人肝癌细胞株与LO2正常肝细胞株microRNA(miRNA)表达的差异谱,为研究miRNA在肝细胞癌变机制中的作用提供新线索.方法 体外培养HepG2人肝癌细胞和LO2人正常肝上皮细胞,Trizol法抽提细胞总RNA,Ambion′s miRNA Isolation Kit进一步分离miRNA;利用基因芯片技术,将细胞miRNA与哺乳动物miRNA芯片杂交,采用LuxScan3.0 图像软件和SAM version 2.1进行数据分析.结果 HepG2细胞与LO2细胞表达的miRNA中有146个存在着明显差异(fold change >4.0),其中80个低表达和66个高表达,最高fold change达36倍,部分miRNAs与肿瘤关系密切,其中has-miR-224为肝癌癌变相关miRNA.结论 HepG2较LO2细胞miRNA低表达数多于高表达数,反映其基因表达数量更丰富,细胞代谢和增殖更活跃;部分miRNAs可能参与肝细胞癌变分子机制.     

肝细胞癌中microRNA的表达水平与早期复发的相关性分析

目的:探讨肝细胞癌组织中microRNA(miRNA)的表达水平与肝细胞癌早期复发的相关性.方法:下载公共数据库TCGA的肝细胞癌患者临床信息、随访结果及miRNA表达情况,根据复发时间将患者分为早期复发组(≤2年复发)和晚期复发组(＞2年复发),连续变量资料采用独立样本t检验评估2组之间是否存在差异,分类变量资料采用...     

乳腺癌化疗耐药微小RNA的筛选

目的 探索乳腺癌化疗耐药的分子机制,筛选具有差异表达的微小RNA(miRNA,miR)及其靶基因,为其治疗提供潜在靶标.方法 以乳腺癌、化疗耐药及miRNA为关键词在基因表达数据库(GEO)中进行检索,并选择以组织为样本的数据集.从数据集筛选出差异表达miRNA并使用TargetScan、MiRDB、miRWALK及G...     

奥沙利铂诱导人肝癌细胞株HepG2凋亡及其机制探讨

目的 :研究奥沙利铂对人肝癌细胞株HepG2生长抑制及诱导凋亡的作用并探讨其诱导凋亡的作用机制。方法 :应用MTT法检测奥沙利铂对HepG2细胞生长的抑制作用 ;电镜观察细胞的形态改变 ;流式细胞仪分析细胞周期的分布和凋亡的情况 ;免疫组织化学法检测突变型p5 3,Bcl- 2 ,Bax ,Fas等凋亡相关基因蛋白的表达。结果 :奥沙利铂对HepG2有明显的抑制作用 ,细胞阻滞于S期和G2 /M期 ,G0 /G1期细胞减少 ,作用 72h出现凋亡峰 ,电镜可以找到凋亡小体 ,免疫组织化学表明Bax表达增强 ,突变型 p5 3、Bcl- 2表达减弱 ,Fas表达无差异。 结论 :奥沙利铂具有抑制肝癌细胞株HepG2增殖及诱导凋亡作用 ,其机制与促凋亡相关基因表达增强和抗凋亡相关基因表达减弱有关。     

肝细胞癌相关外泌体中微小核糖核酸与肝癌腹腔镜根治术后预后的研究进展

肝细胞癌是临床上发病率、死亡率均较高的一种原发性肝癌,其早期症状不明显,预后较差。因此,需要一种有效的方法在疾病早期进行诊断,同时在监测与治疗疾病中发挥作用。随着医学科技的发展,大量研究发现外泌体微小核糖核酸(miRNAs)可为疾病诊断与治疗提供新思路,肝细胞癌相关外泌体中miRNAs可影响相关癌细胞的微环境、转移、增殖、侵袭等。因此外泌体中miRNAs在肝癌诊断、治疗以及预后中发挥着重要作用。文章以肝细胞癌为例,对外泌体、外泌体miRNAs以及在肝细胞癌发生、发展、诊治进行综述,探讨肝细胞癌相关外泌体中miRNAs与肝癌腹腔镜根治术后预后的研究进展。     

苦参碱诱导人肝癌细胞系HepG2凋亡的研究

目的 观察苦参碱是否能诱导人肝癌细胞系HepG2凋亡及凋亡相关基因的变化。方法 0－3.0g/L苦参碱处理HepG2细胞,光镜和电镜下观察细胞形态;TUNEL法原位检测DNA断裂;流式细胞仪检测凋亡峰;AnnexinV-FITC/PI双标记检测早期凋亡;免疫组化和原位杂交法检测wp53,bcl-2,bax,c-myc,Fas等凋亡相关基因的表达,采用真彩色图像分析仪定量检测。结果 1.5-3.0g/L苦参碱可诱导HepG2凋亡,并且使凋亡相关基因wp53,bax,Fas表达上调,而抗调亡基因bcl-2,c-myc表达下调。结论 一定浓度的苦参碱可诱导人肝癌细胞HepG2凋亡,并且该凋亡与凋亡相关基因表达增强和抗凋亡相关基因表达减弱有关。     

ZD6474对肝癌HepG2细胞的抑制作用

目的探讨ZD6474对肝癌细胞HepG2的杀伤作用及作用机制。方法甲基噻唑基四唑实验(MTT法)测定ZD6474对HepG2细胞的增殖抑制;通过流式细胞仪检测细胞周期变化。结果 ZD6474对HepG2细胞有明显的增殖抑制作用(P<0.001)。ZD6474导致肝癌细胞发生G_0/G_1期阻滞。结论 ZD6474能显著抑制肝癌HepG2细胞的体外增殖,可能与导致肝癌细胞G_0/G_1期阻滞相关。     

p53在漆树黄酮诱导人肝癌细胞系HepG2细胞凋亡的作用

目的:观察漆树黄酮诱导人肝癌细胞系HepG2细胞凋亡的现象,研究p53在漆树黄酮诱导人肝癌细胞系HepG2细胞凋亡的作用究。方法：用不同浓度的漆树黄酮（50μmol•L-1、100μmol•L-1、200μmol•L-1）处理HepG2细胞24h和100μmol•L-1漆树黄酮处理HepG2细胞不同时间（12h、24h、48h）,流式细胞术和免疫荧光法观察漆树黄酮作用HepG2细胞的凋亡情况; Westem blot法检测漆树黄酮对HepG2细胞p53、Caspase-3 和Caspase-8蛋白的表达情况。结果:漆树黄酮能诱导HepG2细胞凋亡,呈剂量一时间依赖性; 漆树黄酮可增加p53蛋白的表达,降解Caspase-3 、Caspase-8酶原,提高Caspase-3 、Caspase-8活性。p53蛋白的上调与凋亡的发生呈正相关,Caspase-3 、Caspase-8酶原的降解与与凋亡的发生呈负相关。结论:漆树黄酮可诱导HepG2细胞凋亡,其机制可能与上调p53表达,活化Caspase-3、 Caspase-8有关。     

苦参碱对肝癌细胞HepG2端粒酶活性调控的体外研究

目的 观察苦参碱对人肝癌细胞株HepG2体外增殖和端粒酶活性的影响,进一步探讨苦参碱的可能作用机制.方法 采用人肝癌细胞株HepG2作为研究对象,MTT法检测不同浓度和作用时间的药物对细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪分析细胞周期的分布及凋亡;PCR-ELISA法检测端粒酶活性的变化.结果 苦参碱具有抗HepG2细胞增殖、阻滞细胞周期、诱导凋亡及抑制端粒酶活性的作用.结论 对端粒酶活性的抑制可能是苦参碱发挥抗肿瘤作用的机制之一.     

奥沙利铂对人肝癌HepG2细胞周期、凋亡及侵袭能力的影响

目的 研究奥沙利铂对人肝癌细胞株HepG2细胞的增殖、周期与凋亡及侵袭力的影响.方法 应用MTT法检测奥沙利铂对HepG2细胞生长的抑制作用;流式细胞仪分析细胞周期的分布和凋亡的情况;Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭力变化.结果 奥沙利铂对HepG2生长有明显的抑制作用,使细胞周期阻滞于s期(P＜0.01),细胞凋亡率增加(P＜0.05);奥沙利铂作用后癌细胞的侵袭力明显减弱(P＜0.01).结论 奥沙利铂能明显抑制肝癌细胞增殖及侵袭能力,诱导癌细胞凋亡.     

溪黄草对肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响

目的 探讨溪黄草对人肝癌HepG2细胞株增殖和凋亡的影响。方法 MTT法检测溪黄草对肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用,流式细胞仪Annexin V/PI 双染法检测对细胞凋亡的影响,ELISA法检测Bcl-2、Bax蛋白表达的情况。结果 不同浓度溪黄草能抑制肝癌细胞HepG2细胞的生长(P＜0.01),并具有浓度和时间依赖性。0.75g/μL的溪黄草作用于HepG2细胞3、6h后,结果表明溪黄草能显著促进细胞凋亡,具有时间依赖性,与阴性对照组比较有统计学差异(P＜0.05)。0.75g/μL溪黄草作用HepG2 细胞6h后,Bcl-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达增加,与阴性对照组比较,亦具有统计学差异(P＜0.05)。结论 溪黄草能抑制HepG2细胞的体外增殖,且抑制作用表现出时效关系,其机制可能与促进细胞凋亡、下调Bcl-2蛋白及上调Bax蛋白表达有关。     

肾母细胞瘤细胞株与正常胚肾细胞株微小RNA表达谱的差异分析

目的 探讨肾母细胞瘤G401与正常胚肾CCC-HEK-1细胞株中微小RNA(miRNA)分子表达谱的差异,为进一步研究相关miRNA在肾母细胞瘤发病机制中的作用奠定基础.方法 选取G401和CCC-HEK-1的各3个样本分别作为实验组和对照组,采用miRNA芯片筛选两者之间差异表达的miRNA,样品间表达变化标准以上调2倍/下调50.0%作为阈值范围,并用实时定量PCR验证miRNA芯片结果的可靠性.结果 上调超过2倍差异表达miRNA分子71个,其中上调超过8倍差异表达miRNA分子11个;其中下调至50.0%以下差异表达miRNA分子59个,其中下调至12.5%以下差异表达miRNA分子11个.总体上,G401和CCC-HEK-1之间差异表达显著.结论 G401和CCC-HEK-1之间存在差异表达miRNA分子,它们可能与肾母细胞瘤的形成有关.     

Establishment of hepatocellular carcinoma multidrug resistant monoclone cell line HepG2/mdr1

Background  The multidrug resistance (MDR) associated with the expression of the mdr1 gene and its product P-glycoprotein is a major factor in the prognosis of hepatocellular carcinoma cell (HCC) patients treated with chemotherapy.  Our study was to establish a stable HCC MDR cell line where a de novo acquisition of multidrug resistance specifically related to overexpression of a transgenic mdr1.
Methods  The 4.5-kb mdr1 cDNA obtained from the plasmid pHaMDR1-1 was cloned into the PCI-neo mammalian expression vector, later was transferred by liposome to human hepatocarcinoma cell line HepG2. Then the transfected HepG2 cells resisting G418 were clustered and cultured and the specific fragment of mdr1 cDNA, mRNA and the P-glycoprotein (Pgp) in these HepG2 cells were detected by PCR, RT-PCR and flow cytometry, respectively.  The accumulation of the daunorubicin was determinated by flow cytometry simultaneously. The nude mice model of grafting tumour was established by injecting subcutaneously HepG2/mdr1 cells in the right axilla. When the tumour diameter reached 5 mm, adriamycin was injected into peritoneal cavity. The size and growth inhibition of tumour were evaluated.
Results  The mdr1 expression vector was constructed successfully and the MDR HCC line HepG2/mdr1 developed.  The PCR analysis showed that the specific fragment of mdr1 cDNA in HepG2/mdr1 cells, but not in the control group HepG2 cells. Furthermore, the content of the specific fragment of mdr1 mRNA and Pgp expression in HepG2/mdr1 cells were (59.7±7.9)% and (12.28±2.09)%, respectively, compared with (16.9±3.2)% and (3.07±1.06)% in HepG2 cells.  In the nude mice HCC model, the tumour genes of both groups were identified. After ADM therapy, the mean size of HepG2 cell tumours was significantly smaller than HepG2/mdr1 cell tumours.
Conclusion  The approach using the transfer of mdr1 cDNA may be applicable to the development of MDR hepatocarcinoma cell line, whose MDR mechanism is known. This would provide the experimental basis of MDR research.

     

NF-κB抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷对人肝癌细胞HepG2增殖的影响及其机制探讨

目的探讨抗氧化剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)在肝癌化学预防中的作用及机制。方法采用MTT法检测PDTC和顺铂单药或联用时对细胞增殖的抑制率;流式细胞术(FCM)检测PDTC处理细胞后细胞的周期变化。RT-PCR和Western boltting检测PDTC处理后细胞的NF-κB p65 mRNA和蛋白的表达。结果 PDTC在体外能明显抑制人肝癌细胞HepG2的增殖,呈量效关系。顺铂单用及联合PDTC用药结果也呈量效关系。顺铂联合PDTC用药比顺铂单用呈现更强的抑制效应。PDTC处理细胞后,引起HepG2细胞周期的阻滞,抑制核内NF-κBp65蛋白表达,但对NF-κBp65 mR NA表达水平无影响。结论PDTC能抑制肝癌细胞系HepG2细胞的增殖,增强顺铂的细胞毒作用,引起HepG2细胞周期的阻滞;其作用机制主要是抑制NF-κB入核,可用于肝癌的化学预防,联用顺铂可进一步提高疗效。     

Potential role of novel hepatocellular carcinoma-associated gene IDD01 in promoting tumorigenesis of HepG2 cell line

Background We have used suppression subtractive hybridization to construct a subtracted cDNA library of hepatocellular carcinoma （HCC） and isolated a panel of differential expression sequence tag （ESTs）. By using bioinformatics and rapid amplification of cDNA ends （RACE）, we found a novel HCC-associated gene IDD01. To further investigate its function, a recombinant eukaryotic vector pEGFP/ORF was constructed and transfected into the HepG2 cell line. Methods The open reading frame （ORF） of IDD01 was amplified by RT-PCR, digested with Bamh Ⅰ and Hind Ⅲ, and subcloned into the pEGFP-C1 vector. The ligation reaction was conducted with T4 DNA ligase, and the recombinant vector was named pEGFP/ORF. Untransfer control （control group）, pEGFP-C1 （HepG2/C1 group） and pEGFP/ORF （HepG2/ORF group） transfer groups were designed. Gene transfer was conducted with lipofectamine. To obtain stable transfection in HepG2 cells, selection was initiated with 500 μg/ml G418. Cellular IDD01 mRNA levels were assayed by semi-quantitative RT-PCR. The MTT colorimetric method and flow cytometry were used to determine the cell proliferation. The tumorigenic potential of transformed cells was determined from their ability to grow as anchorage-independent colonies on soft agar. Transient transfections were performed to observe subcellular location of GFP-IDD01 fusion protein. Results A 778 bp specific band of ORF was obtained by RT-PCR, and the positive clone of recombinant plasmid pEGFP/ORF （5.5 Kb） was identified by restriction endonuclease cleavage and sequence. The brightness ratio of IDD01 mRNA was not obvious between control and pEGFP/C1 groups, whereas the ratio of pEGFP/ORF was higher than that in the other two groups. After culture for 24-72 hours, the A490 values in pEGFP/ORF were higher than those in the other two groups （P〈0.01）. On histograms of flow cytometry, the S phase ratio of HepG2/ORF cells was significantly higher than that of the control and HepG2/C1 groups. The HepG2/ORF cells were able to form more colonies in soft agar compared with other HepG2 cell lines （P〈0.01）. GFP-IDD01 fusion protein predominantly localized in the plasma, whereas EGFP protein diffused all over the cell. Conclusion The IDD01 gene is a positive effector in cell proliferation and contributes to the carcinogenesis and progression of HCC. This gene may serve as a potential target for pharmaceutical intervention of HCC.