大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子工程菌DH5α的发酵工？…

目的 研究大肠杆菌表达重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）工程菌ＤＨ５α的发酵工艺,方法：采用发酵罐发酵,对影响工程菌生长和目标蛋白的表达条件如;工程菌发酵的培养基配方,ｐＨ值,诱导时间,分批补加营养物质等进行了优化,结果：根据优化的条件,２０Ｌ罐发酵工程菌,菌体收得量可达湿重１５．６ｇ／Ｌ目标蛋白表达量约占菌体总蛋白的３０％,结论：此发酵工艺可以提高ｒｈＧ－ＣＳＦ工程菌菌体的得率和目标蛋白     

重组人肝增强因子工程菌JM109的发酵工艺研究

目的：研究表达重组人肝增强团子（hALR）工程菌JM109的发酵工艺。方法：采用发酵罐发酵,优化工程菌发酵的培养基配方、pH值、诱导表达时间、补料方式等。结果：在pH6．9条件下,培养6h后诱导表达5h,同时补科,5L罐发酵工程菌,菌体收得量可达湿重33．0g／L。目标蛋白表达量约占菌体总蛋白的31．3％。结论：此发酵工艺可以较好地提高ALR工程菌菌体得率和目标蛋白表达量。     

聚乙二醇增加重组人粒—单系集落刺激因子复性效率的研究

重组人粒－单系集落刺激因子在大肠杆蓖表达后积累在细胞中形成包涵体，在变性的包涵体的现提液复性过程中，目的产物可能聚积而使活性蛋白的得率降低。本研究对聚乙二醇增加复性的能力进行试验。将ｒｈＧＭ－ＣＳＦ在６ｍｏｌ／Ｌ尿素中变性，迅速稀释到不同浓度尿素和ＰＥＧ的溶液中并保护蛋白浓度为０．２ｍｇ／ｍｌ，在尿素浓度为２．０ｍｏｌ／Ｌ，ＰＥＧ４０００对ｒｈＧＭ－ＣＳＦ的摩尔比为２０：１时活性蛋白从４０％增加到     

重组人白细胞介素-18工程菌的培养及高密度发酵

目的优化重组人白细胞介素-18的发酵工艺,以获得工程菌的高密度发酵和目的蛋白的高表达.方法在10L发酵罐中,研究重组人白细胞介素-18工程菌在不同的pH值、溶氧和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响.结果根据优化条件,连续三批重复发酵10L工程菌,最终菌体密度均达A600nm=28,菌体获得量均可达湿重50g?L-1以上.目的蛋白表达量均为40%以上.结论优化了重组人白细胞介素-18基因工程菌的发酵和表达条件,为规模化生产奠定了基础.     

重组人胸腺肽α1工程菌的高密度发酵

为实现重组人胸腺肽α１工程菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０／ｐＴｈｉｏ Ｈｉｓ－Ｔα的高密度高表达发酵,首先进行了培养条件的摸索,确定了该工程菌的最佳培养条件、诱导剂ＩＰＴＧ的浓度、诱导起始和结束时间,然后用５Ｌ自控发酵罐进行分批补料培养,发酵中采用分阶段限制性流加氮、碳源,保持溶解氧在３５％左右,结果经３ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导５ｈ,３批重复发酵,最终菌体密度均达到６０Ａ６００以上（相当于干菌２５．６ｇ／Ｌ）,保持了并超过了该重组蛋白在试管和摇瓶中的表达量,融合蛋白Ｔｈｉｏ Ｈｉｓ－Ｔα的表达占菌体总蛋白的４２．４％左右,含量达到了５．７ｇ／Ｌ,相当于胸腺肽α１ ２．４ｇ／Ｌ,为胸腺肽α１的下游纯化和工业化生产奠定了基础。     

人粒细胞集落刺激因子包涵体的提取及其复性研究

研究人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）包涵体的复性方法。方法：采用我室发明的包涵体提纯新方法。结果：复性回收率可达９０％以上,生物活性达天然比活的８０％以上。结论：对ｒｈＧ－ＣＳ Ｆ包涵体提纯和复性的研究,建立了ｒｈＧ－ＣＳＦ的复性新方法。     

基因重组人集落刺激因子对环磷酰胺处理小鼠造血干细胞的动员作用

国产基因重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）和进口人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ），对Ｃ５７小鼠环磷酰胺（ＣＰＡ）应用所造成的骨髓抑制，无论在化疗药与造血因子同时应用的治疗组或造血因子先于化疗药应用的预防组，均显示出对造血干细胞明显的动员作用，与对照组相比有显著差异（Ｐ＜０．０１～Ｐ＜０．００１）；ｒｈＧＭ－ＣＳＦ升高白细胞（ＷＢＣ）的作用稍次于ｒｈＧ－ＣＳＦ，但增加骨髓ＤＮＡ含量作用稍强于ｒｈＧ－ＣＳＦ，无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。同时，ｒｈＧＭ－ＣＳＦ对骨髓干细胞中分化程度低的集落刺激作用强于分化程度高的小丛和大丛，ｒｈＧ－ＣＳＦ恰好相反。各测定指标显示：两种造血因子作用无显著差异。各药皆有一定的量效关系。     

HPLC测定乙酸在控制G-CSF工程菌高密度发酵质量中的应用研究

采用ＨＰＬＣ和ＧＤＡＳ分析测定Ｇ－ＣＳＦ基因工程菌在发酵罐高密度发酵培养过程中菌体产生积累乙酸的含量,分析确定了乙酸含量与产物表达的量化关系,验证了乙酸抑制产物表达的作用。建立了快速测定菌体培养过程中乙酸积累含量检测和动态菌体产物表达量测定的方法。     

突变的人铜、锌超氧化物歧化酶基因的克隆、测序及表达

目的：通过基因工程的方法将ｒｈＣｕ,Ｚｎ－ＳＯＤ ｃＤＮＡ基因改造以得到更加稳定的酶。方法：以本实验室构建的 ｒｈＣｕ,Ｚｎ－ＳＯＤ ｃＤＮＡ为模板,利用含有突变核苷酸的引物进行 ＰＣＲ扩增,将正确测定的含 ｒｈＣｕ, Ｚｎ－ＳＯＤ突变（ｒｈＣｕ,Ｚｎ－ＭＳＯＤ）基因的重组质粒重组到表达载体ＰＥＴ－２２ｂ（＋）中,重组质粒在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达ｒｈＣｕ,Ｚｎ－ＭＳＯＤ。结果：表达产物占菌体总蛋白的３８％,具有特异性ＳＯＤ酶活性。结论：从基因突变的角度改善酶的性能不仅具有理论意义,又有一定的实用价值。     

重组人肝细胞生长因子α高效表达工程菌筛选及发酵工艺研究

将人肝细胞生长因子α重组质粒转化至不同E.coli菌株，在相同培养条件下比较其表达量，筛选高表达工程菌株；在15L的发酵罐内，采用分批补料培养的方法，研究表达菌株的发酵培养条件，检测改变发酵培养基成分、种子液接种量、诱导时间等参数对菌液密度以及蛋白表达的影响，同时检测质粒传代的稳定性。实验结果表明筛选出的高表达工程菌在优化的发酵培养条件下，菌体收获量可达52g/L，目的蛋白表达量约占菌体可溶性总蛋白的25％，且质粒和蛋白表达均具有良好的稳定性。高效表达工程菌和优化发酵工艺可以较好地提高菌体收率，为规模化生产奠定了基础。     

丙肝病毒非结构4区和5区抗原的克隆表达及纯化鉴定

通过分析丙肝病毒（ＨＣＶ）的非结构４区（ＮＳ４）和５区（ＮＳ５）蛋白的氨基酸序列，推测确定抗原决定簇位点。用ＲＴ－ＰＣＲ技术从中国丙肝病人血甭中扩增克隆含抗原决定簇基因的ＮＳ４及ＮＳ５基因，将该丙段基因分别克隆至质粒表达载体ｐＥＴ２８ａ（＋）内，转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），成功了高儿表达ＮＳ４和ＮＳ５蛋白的工程菌，ＩＰＴＧ诱导后两蛋白在工程菌内的表达量分别约占菌体蛋白的３３％和２８％。经Ｓｅｐ     

重组集落刺激因子对大鼠正常骨髓及其白血病细胞体外增殖的影响

通过体外半固体培养集落形成和液体培养测定分析了重组的人或小鼠集落刺激因子对大鼠正常骨髓及其白血病细胞生长的影响。实验结果表明，重组的人巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＭ－ＣｓＦ），粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）和重组的小鼠粒－巨噬细胞集落刺激因子（ｒｍＧＭ－ＣＳＦ）能明显促进褐家（ｂｒｏｗｎＮｏｅｗａｙ）大鼠正常骨髓造血祖细胞的生长，在终浓度１０００ｋＵ·Ｌ－１时，它们的刺激指数分别为２８±ｓ１０，１２±ｓ４，２５±ｓ９。然而，ｒｈＧ－ＣＳＦ和ｒｍＧＭ－ＣＳＦ明显地抑制其白血病细胞集落形成，其ＩＣ５０分别为３５±ｓ８和１３４３±ｓ６３４ｋＵ·Ｌ－１也具有一定的抑制效应。同样，在液体培养中证实ｒｈＧ－ＣＳＦ和ｒｍＧＭ－ＣＳＦ明显地抑制ＬＴ１２白血病细胞ＤＮＡ合成及饱和生长密度（ＩＣ５０分别为１９１３和１８７ｋＵ·Ｌ－１）。重组的人粒－巨噬细胞集落刺激因子和小鼠多系集落刺激因子无论在半固体或液体培养中对大鼠正常骨髓造血祖细胞和白血病细胞的增殖均无明显影响。此外，还观察到大鼠急性白血病ＬＴ１２细胞经ｒｍＧＭ－ＣＳＰ（１０００ｋＵ·Ｌ－１）处理８ｄ后，６±ｓ１％的细胞显示具有还原硝基篮四氮唑的能力。     

基因重组人集落刺激因子对X－射线照射后小鼠造血干细胞的动员作用

钴６０Ｘ－射线超大剂量曝射造成Ｃ５７纯种小鼠造血功能抑制。照射３ｄ后，小鼠的外周血白细胞（ＷＢＣ）下降到正常值的２９．１％，８ｄ降至最低，为正常值的１８．６％。骨髓成髓细胞ＤＮＡ含量照射后第３ｄ降至最低，为正常的１８％。国产重组人单核－巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）和进口重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）均有明显升高粒细胞的保护作用。治疗组放疗后立即皮下注射两种造血因子（ｒｈＣＳＦｓ），其对造血干细胞动员作用模式与对照一致，但其升高ＷＢＣ的保护作用非常明显地高于对照组（Ｐ≤０．０１）；预防组共注射ｒｈＣＳＦｓ５ｄ，在注药３ｄ后照射，照射３ｄ后ＷＢＣ降至正常值的约３０％后即持续上升；成髓细胞ＤＮＡ含量ｒｈＧ－ＣＳＦ组降至正常值的３６％及ｒｈＧＭ－ＣＳＦ组降至正常值的３２％，随后持续上升。两种造血因子作用无显著性差异（Ｐ＞０．２）。小鼠试验表明ｒｈＧＭ－ＣＳＦ与ｒｈＧ－ＣＳＦ皮下给予１００与３０μｇ／ｋｇ均呈良好的量效关系。     

重组人粒细胞集落刺激因子预防化疗后粒细胞减少的Ⅱ期临床试验

目的：评价重组人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ）对预防恶性肿瘤化疗后粒细胞减少的作用及不良反应。方法：６２例恶性肿瘤病人随机分入ＡＢ和ＢＡ２组。Ａ为治疗周期,即化疗结束４８ｈ开始,ｒｈＧ＿ＣＳＦ５μｇ／ｋｇ,ｓｃ,ｑｄ×７～１５ｄ;Ｂ为空白对照周期。自化疗开始隔日查血常规１次,观察中性粒细胞（Ｎｅｕ）绝对值及白细胞（ＷＢＣ）的变化。结果：治疗周期于ｒｈＧ＿ＣＳＦ注射２４ｈ后,ＷＢＣ及Ｎｅｕ绝对值迅速上升,４８ｈ出现第１个高峰,ｄ８出现第２个高峰,而对照周期化疗后ＷＢＣ和Ｎｅｕ绝对值逐渐下降,始终低于治疗周期。ＷＢＣ和Ｎｅｕ的最低值（ＷＢＣ＜４．０×１０９／Ｌ,Ｎｅｕ绝对值＜２．０×１０９／Ｌ）的持续时间,以及化疗后ｄ２１ＷＢＣ＜４．０×１０９／Ｌ的病例数在治疗周期和对照周期间差异有显著意义（Ｐ＜０．０５）。骨痛和感冒症状发生率分别为２１％和１６％,注射部位局部反应、皮疹、发热少见。结论：ｒｈＧ＿ＣＳＦ可以促进化疗病人ＷＢＣ和Ｎｅｕ的恢复,耐受性良好,可以作为肿瘤化疗中提高剂量强度的有效的辅助药。     

抗阿尔茨海默病神经保护肽[Gly14]-Humanin融合基因工程菌发酵工艺研究

目的优化大肠杆菌表达重组[Gly14]-Humanin(HNG)融合基因工程菌的发酵工艺。方法在15L发酵罐内,研究培养基、培养条件和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响,并考察工程菌中重组质粒的遗传稳定性。结果工程菌在pH7.4的2×YT培养基中诱导5h,菌体湿重可达80g/L,目的蛋白表达量约占总蛋白的36%,所构建的重组质粒在BL21宿主菌中传代稳定。结论优化了HNG融合基因工程菌的发酵和表达条件,为药物中试研究和规模化生产奠定了基础。     

白细胞介素－2工程菌高效表达影响因素的初探

白细胞介素－２工程菌高效表达影响因素的初探王捷，杨太成，江悦华，张宏斌（广州军区总医院医学实验科，广州５１００１０）ＰＲＢＬＩＭＩＮＡＲＹＳＴＵＤＹＯＮＣＯＮＳＴＩＴＵＥＮＴＳＡＦＦＥＣＴＩＮＧＨＩＧＨＬＥＶＥＬＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＯＦＲＥＣＯＭＢＩ...     

基因重组人集落刺激因子对环磷酰胺处理小鼠造血干细胞的动员…

国产基因重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）和进口人粒细胞集落刺激因子（ｒｈＧ－ＣＳＦ），对Ｃ５７小鼠环磷酰胺（ＣＰＡ）应用所造成的骨髓抑制，无论在化疗药与造血因子同时应用的治疗组或造血因子先于化疗药应用的预防组，均显示出对造血干细胞明显的动员作用，与对照组相比有显著差异（Ｐ〈０．０１～Ｐ〈０．００１），ｒｈＧＭ－ＣＳＦ升高白细胞（ＷＢＣ）的作用稍次于ｒｈＧ－ＣＳＦ，但增加骨髓Ｄ     

白芍总甙对大鼠腹腔巨噬细胞产生肿瘤坏死因子的调节机制

目的：研究不同浓度白芍总甙（ＴＧＰ）调节大鼠腹腔巨噬细胞（ＭΦ）产生肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）作用。方法：在ＭΦ培养系统中有或无环氧酶抑制剂和钙调蛋白抑制剂等工具药，测定４５Ｃａ内流、ＰＧＥ２和ＴＮＦ含量。结果：ＴＧＰ（０．５～１０ｍｇ·Ｌ－１）明显促进ＬＰＳ诱导ＭΦ的４５Ｃａ内流和ＴＮＦ产生。线性回归分析表明，４５Ｃａ内流和ＴＮＦ产生呈明显正相关。三氟拉嗪（４０μｍｏｌ·Ｌ－１）可阻断ＴＧＰ促进ＬＰＳ诱导ＭΦ产生ＴＮＦ。ＴＧＰ－ＬＰＳ的ＴＮＦ释放曲线呈钟罩形，而ＴＧＰ－ＬＰＳ的ＰＧＥ２产生曲线呈浓度依赖性升高。当ＴＧＰ在低浓度（０．５～１２．５ｍｇ·Ｌ－１）时，ＴＮＦ与ＰＧＥ２产生明显正相关，而高浓度（１２．５～２５０ｍｇ·Ｌ－１）两者呈明显负相关。吲哚美辛（１０μｍｏｌ·Ｌ－１）可使ＴＮＦ量效曲线下降支消失，而Ｎω亚硝基－Ｌ－精氨酸（１５μｍｏｌ·Ｌ－１）对此无明显影响。结论：低浓度ＴＧＰ对ＴＮＦ产生上调作用可能与促进４５Ｃａ内流，提高钙调蛋白活性从而促进ＰＧＥ２分泌等有关，而高浓度下调作用是可能与ＭΦ自身产生大量ＰＧＥ２介导有关。     

重组人胰岛素样生长因子-Ⅰ工程菌高密度发酵工艺优化

目的优化表达重组人胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)工程菌的高密度发酵条件。方法考察培养基以及诱导时机、诱导剂量和诱导时间对蛋白表达的影响;用自控发酵罐进行分批补料培养实验,确定优化工艺条件。结果以2×YT+0.5%葡萄糖为发酵培养基,经0.8 mmol/L IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导5 h,通过pH-stat反馈补料方式实现工程菌高密度发酵与目的蛋白高效表达,每1 L发酵液收获干菌体50.1 g,IGF-Ⅰ含量达5.25 g/L。结论建立了IGF-Ⅰ工程菌优化的高密度发酵工艺,为IGF-Ⅰ的下游纯化和工业化生产奠定了基础。     

单链抗体与力达霉素辅基蛋白在大肠埃希菌表达的发酵工艺

目的 确定工程菌E.coli BL21(DE3)StarTM/pEFL表达抗Ⅳ型胶原酶单链抗体与力达霉素辅基蛋白构成的融合蛋白Fv-LDP的摇瓶发酵工艺.方法 比色法测定菌体浓度,干燥失重法测定细菌干重,SDS-PAGE-Spot Denso法测定融合蛋白Fv-LDP表达量,单因素或正交设计优化发酵工艺.结果 确定了融合蛋白Fv-LDP表达的最佳培养基配方和培养条件,融合蛋白Fv-LDP表达量为830μg/ml左右,比LB培养基的产量提高5.6倍.结论 优化工程菌发酵工艺大大提高了融合蛋白Fv-LDP表达水平,不仅为下一步中试研究和规模化生产奠定了基础,而且为其它生物来源的抗体和抗生素组分在基因工程大肠埃希菌的生产提供了发酵方面的实验证据.