血管生成三维培养模型的研究进展

血管生成是内皮细胞的重要功能,在胚胎发育、组织再生、炎症﹑肿瘤的生长与转移等多种生理和病理过程均有血管生成。传统的单层细胞培养(2D培养)模型是迄今最常用的体外实验研究模型,但存在诸多的不足,如细胞的生长特性与体内差异较大等。三维培养(3D培养)模型上细胞呈立体生长,更接近于体内的自然生长状态。3D培养已经发展出了多种方法,特别是近年组织工程技术的应用,3D血管生成模型的建立取得了很多新进展,在肿瘤领域的相关研究尤为活跃。     

碱性成纤维细胞生长因子对三维培养内皮细胞血管样结构形成的作用研究

目的 :观察碱性成纤维细胞生长因子 (basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)对三维培养内皮细胞血管样结构形成的作用。方法 :实验分为两组 ,即加入浓度 2 0ng·ml-1bFGF的bFGF组及不加bFGF的对照组。采用Pepper等介绍的三维培养胶原基质配制及细胞培养方法制作标本 ,透射电子显微镜下观察结果。 结果 :对照组内皮细胞在胶的表面呈单层生长 ,未见其向深层生长及管腔结构形成。bFGF组内皮细胞在胶内呈多层浸润生长 ,伸展、变形呈扁平状 ;内皮细胞与胶原纤维之间可见半桥粒结构 ,内皮细胞之间以桥粒连接 ,形成毛细血管样管腔结构 ;在形成管状结构的内皮细胞中可见空泡样变 ,边界由胞质与胞膜组成 ,细胞核变形 ,凹陷 ,可见切迹 ,或呈薄片状 ;内皮细胞游离面有微绒毛突起。结论 :三维培养技术简单易行 ,是揭示在体血管形成的最简单模型 ;bFGF有利于三维培养内皮细胞在有展性的胶原基质面形成血管样结构。     

脉络膜微血管内皮细胞的体外培养

脉络膜微血管内皮细胞不仅在维持眼睛局部的内环境稳定、局部散热以及营养视网膜色素上皮细胞（RPE）和外层视网膜等方面发挥重要作用，更是许多视网膜、脉络膜病变的解剖基础，包括脉络膜渗漏、炎症以及新生血管的发生等等。脉络膜新生血管的发生是一系列引起视功能障碍的脉络膜、视网膜疾病的重要病理生理学机制，尤其在渗出性老年黄斑变性、中心性渗出性视网膜炎、高度近视眼底改变等方面，脉络膜新生血管是致盲的根本原因。     

胎牛主动脉内皮细胞的培养

目的 建立动脉内皮细胞（ＥＣｓ）的体外研究模型。方法 用消化法结合机械法的方法分离胎牛主动脉ＥＣｓ,在ｐＨ７．０的Ｍ１９９培养液中培养。结果 用Ⅷ因子相关抗原免疫荧光法以及倒置显微镜下细胞融合后呈单层生长、鹅卵石状排列,证实所培养的细胞为ＥＣｓ,在无内皮细胞生长因子的条件下体外连续培养的细胞达１８代。结论 在人动脉取材极为不易的情况下,胎牛主动脉ＥＣｓ的培养是很好的补充。     

大鼠脑皮质微血管内皮细胞的培养

目的：培养脑皮质微血管内皮细胞。方法：取1－5d Wistar乳鼠脑皮质，经不同孔径的筛网过滤后，用胶原酶振荡消化获得的血管内皮细胞进行培养，用Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定。结果：培养的细胞呈单层贴壁生长，7－9d呈典型的铺路卵石样征象。结论：建立了一种简便易行的培养脑皮质微血管内皮细胞的方法。     

兔血管平滑肌细胞三维培养模型的建立

目的 观察兔血管平滑肌细胞（VSMCs)在三维培养系统中的生物学特性,方法 在兔主动脉中膜来源的VSMCs单层培养系统的基础上,将VSMCs培养在胶原凝胶中,形成VSMCs三维培养系统,并对细胞的形态结构,生长增殖及其影响因素进行研究。结果（1）三维培养VSMCs在凝胶形成后3－4h,形成多个细胞突起,呈星状,后继续伸展,呈梭 ,纺锤形,（2）张力条件下,三维培养VSMCs可呈一定的方向性排列。（3）三维培养VSMCs与经典的单层培养相比,细胞活力无统计学差异,但细胞增殖受到一定程度的抑制。结论 运用VSMCs三维培养系统不仅可以观察和研究细胞的形态结构,生长增殖等方面,还可研究在力条件下的撑特征,对组织工程化血的研究将产生积极的影响。     

羊膜作为载体培养血管内皮细胞替代自体角膜内皮细胞的研究

目的将羊膜作为血管内皮细胞的生长载体,探讨血管内皮细胞代替自体角膜内皮细胞生理功能的可行性,为大泡性角膜病变的治疗新方法提供实验依据.方法取实验家兔的一侧颈静脉(约3~4 cm),用0.25%胰蛋白酶 0.02?TA灌注法收集血管内皮细胞进行原代培养.取新鲜羊膜并去除其表皮细胞,剪成1.5 cm×1.5 cm大小,表皮面向上平铺于24孔培养板中,再将原代培养的血管内皮细胞传代于羊膜表面,当血管内皮细胞贴壁并长满整个羊膜表面后,我们将载体同血管内皮细胞一起移植到带有大泡性角膜病变的角膜内表面,1~2个月后观察其角膜透明度的变化.结果术后12 d左右,实验组和实验对照组(各10只)的角膜水肿及透明度有明显差别.实验组术后4~5 d时植片呈白色,高度水肿,通过植片看不见前房,10 d后,水肿开始减轻,角膜混浊开始好转,其中7只实验家兔的角膜透过植片能看见前房的组织结构.实验对照组的绝大部分角膜植片水肿加剧,部分角膜植片由于高度水肿而出现坏死溃疡,经统计学分析P<0.05,两者具有差异性.结论血管内皮细胞具有类似于角膜内皮细胞的生理功能,但其长期的功效有待于进一步的观察和探讨.     

大鼠肺微血管内皮细胞原代培养方法的改进及细胞鉴定

目的改进大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）的原代培养方法,并对培养细胞进行相关鉴定。方法从动物选择、取材、循环灌注、植块贴壁等方面对体外分离PMVECs的原代培养方法进行改良。原代培养细胞经传代、冻存与复苏,倒置显微镜观察培养细胞的形态学特征和生长特性,免疫组织化学染色检测血管内皮细胞表面标志物Ⅷ因子相关抗原和CD31表达,荧光显微镜观察细胞与PMVECs的特异性结合物植物凝集素BSI的结合情况（FITC-BSI结合试验）。结果倒置显微镜下,培养细胞呈多边形或梭形,融合为单层后呈典型的鹅卵石或铺路石样镶嵌生长并有接触抑制现象;免疫组织化学染色显示,细胞CD31和Ⅷ因子表达阳性;FITC-BSI结合试验呈阳性结果。结论改进的原代细胞培养方法操作简单、可重复性好且成功率高;综合鉴定表明培养细胞形态学及生物学特性与PMVECs一致。     

大鼠肺微血管内皮细胞原代培养方法的改进及细胞鉴定

目的 改进大鼠肺微血管内皮细胞（PMVECs）的原代培养方法,并对培养细胞进行相关鉴定。方法 从动物选择、取材、循环灌注、植块贴壁等方面对体外分离PMVECs的原代培养方法进行改良。原代培养细胞经传代、冻存与复苏,倒置显微镜观察培养细胞的形态学特征和生长特性,免疫组织化学染色检测血管内皮细胞表面标志物Ⅷ因子相关抗原和CD31表达,荧光显微镜观察细胞与PMVECs的特异性结合物植物凝集素BSI的结合情况（FITCBSI结合试验）。结果 倒置显微镜下,培养细胞呈多边形或梭形,融合为单层后呈典型的鹅卵石或铺路石样镶嵌生长并有接触抑制现象;免疫组织化学染色显示,细胞CD31和Ⅷ因子表达阳性;FITC-BSI结合试验呈阳性结果。结论 改进的原代细胞培养方法操作简单、可重复性好且成功率高;综合鉴定表明培养细胞形态学及生物学特性与PMVECs一致。     

2型糖尿病血瘀证血管内皮细胞损伤模型的研究

目的 建立2型糖尿病血瘀证的血管内皮细胞损伤模型.方法 取对数生长期的正常人脐静脉内皮细胞(ECV-304),干预分组如下:空白对照组(无血清的DMEM)、健康组(健康人血清)、糖尿病血瘀证组(糖尿病血瘀证患者血清)和糖尿病非血瘀证组(糖尿病非血瘀证患者血清).采用MTT法观察细胞活性;在倒置相差显微镜、扫描电镜和透射电镜下观察细胞形态的变化;应用放免法测定内皮素(ET)含量;硝酸还原酶法测定一氧化氮(NO)含量;利用双抗夹心ELISA法检测各组细胞培养上清液中内皮细胞蛋白C受体(EPCR)、血管内假性血友病因子(vWF)和血栓调节蛋白(sTM)的含量;应用激光扫描共聚焦显微镜,采用Fluo-3/AM作为荧光指示剂观察细胞内游离钙浓度的变化;并采用荧光探针标记的鬼笔环肽染色法观察细胞肌动蛋白微丝分布的差异.结果 ①10%浓度的糖尿病血瘀证组的OD值较健康组明显降低(P＜0.001);②糖尿病血瘀证组的ET水平比空白对照组和糖尿病非血瘀证组升高(P＜0.001);糖尿病血瘀证组的NO水平比空白对照组降低(P＜0.001);但和糖尿病非血瘀证组相比差异没有统计学意义(P＞0.05);③内皮细胞经过患者血清损伤后,糖尿病血瘀证组分泌的EPCR含量比空白对照组升高(P＜0.001),但低于糖尿病非血瘀证组(P＜0.001);糖尿病血瘀证组分泌的vWF和sTM含量比空白对照组升高(P＜0.001),和糖尿病非血瘀证组相比差异没有统计学意义(P＞0.05);④糖尿病血瘀证组胞浆内荧光分布不均匀,荧光强度高于正常对照组和糖尿病非血瘀证组(P＜0.001);⑤空白对照组和健康组细胞骨架微丝分布多规则清晰,保持着细胞的正常外形,糖尿病血瘀证组的细胞骨架微丝断裂且排列紊乱,糖尿病非血瘀证组细胞微丝断裂但排列较为规则.结论 应用2型糖尿病血瘀证患者血清干预ECV-304可以在体外表现出血管内皮细胞损伤的种种征象,初步建立一种病证结合的血瘀证细胞损伤模型.     

Experimental studies of autologous macaque vein endothelial cell transplantation onto blood vessel prostheses

Itiswellknownthatsyntheticvasculargraftscannotspontaneouslyendothelializeafteritsubstitutesforthepathologicalveinsandsmalldiameterarteries[1'Zj.Itsremotepatencyrateissignificantlylowerthanthatofautologoussaphenousveins[3J.Toresolvetheposer,autologousendothelialcelltransplantationwasintroduced.Althoughthisconceptseemedtobeinspiringinanimal(suchasdogsandpigs)experimentation["'J,reportsofclinicaltrialsweredisappointing['j,mostlikelyduetoalownumberofimplantedendothelialcellsorarelativelyhighperce…     

骨桥蛋白对骨髓内皮祖细胞体外增殖功能的影响

目的观察骨桥蛋白(OPN)对体外培养的人骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)增殖功能的影响及可能的机制。方法以密度梯度离心法获取人骨髓单个核细胞(MNCs),差速贴壁法培养8d,由形态学、流式细胞仪、Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素1双染鉴定为EPC后,免疫组化和RT-PCR方法检测OPN在EPC的表达。加入不同浓度人重组OPN和PI3K抑制剂LY294002和Akt抑制剂作用于EPC,采用CCK-8法观测EPC的增殖能力。结果人重组OPN促进EPC的增殖功能,并且呈剂量依赖性。抑制PI3K/Akt信号通路可以阻断OPN对EPC增殖能力的影响。结论人重组OPN在体外可能通过PI3K/Akt信号通路调节人骨髓源性EPC的增殖能力。     

联合培养的内皮细胞对平滑肌细胞增殖和形态的影响

目的探索体外培养和扩增同一来源内皮细胞和平滑肌细胞的有效方法,研究联合培养的内皮细胞对平滑肌细胞形态和增殖的影响。为研究内皮细胞和平滑肌细胞相互关系和体外构建组织工程血管提供理论和实践基础。方法在体外用酶消化法和组织块贴壁法分别建立内皮细胞和平滑肌细胞的原代,并应用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸钠传代培养。应用光镜、透射电镜、细胞计数和MTY法对内皮细胞和平滑肌细胞的形态和代谢进行研究。模拟血管壁的内层结构及内皮细胞和平滑肌细胞间的相互影响途径,建立以聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜为介质的内皮细胞与平滑肌细胞联合培养模型。分3组：内皮细胞／平滑肌细胞、平滑肌细胞／平滑肌细胞和空白／平滑肌细胞,应用。H—TdR掺入法研究联合培养的内皮细胞对平滑肌细胞增殖的影响。结果酶消化法和植块培养法可以有效地建立起内皮细胞和平滑肌细胞的原代。内皮细胞对联合培养的平滑肌细胞早期增殖有促进作用,晚期则增殖缓慢。结论以PET膜为介炙联合培养同一来源的内皮细胞和平滑肌细胞的新模型是研究两者间相互影响的良好模型。内皮细胞和平滑肌细胞作为血管构成的基本细胞,对于它们的形态学、体外培养和扩增以及相互关系的研究具有重要的意义。     

人真皮淋巴管内皮细胞的分离及冷冻保存

目的建立分离培养人真皮淋巴管内皮细胞(LECs)及其冷冻保存技术。方法采用中性蛋白酶及胶原酶消化结合免疫磁珠方法,分选CD34-/CD31 细胞。所获内皮细胞进行体外培养,经免疫荧光染色、RT-PCR鉴定证实为LECs。采用梯度降温法冻存内皮细胞,经复苏后进行形态学观察,以台酚蓝试验、MTT试验、流式细胞术细胞检测等方法鉴定细胞生物学特性。结果中性蛋白酶及胶原酶消化方法结合免疫磁珠分选,可从真皮组织获取高纯度的LECs。与新鲜细胞相比,复苏的内皮细胞活力保持在92%以上。复苏后的内皮细胞形态学、生物学特性及生长曲线与新鲜细胞差异无统计学意义。冻存内皮细胞的凋亡率较新鲜内皮细胞高,为(9.15±0.34)%vs(5.31±0.23)%,但无统计学差异(P>0.05)。结论中性蛋白酶及胶原酶消化结合免疫磁珠分选,可获取足够数量及纯度的LECs;冻存的内皮细胞复苏后无明显形态学改变,并保持较高的活力及体外增殖能力;可作为种子细胞来源,为淋巴管系统发育和新生研究提供方便。     

体外培养乳牙牙髓干细胞向血管内皮细胞定向分化的实验研究

目的 研究体外培养乳牙牙髓干细胞向血管内皮细胞的定向分化。方法 选取南方医科大学口腔医院29 例健康儿童的滞留乳牙,在4 h 内进行乳牙牙髓干细胞的原代提取。采用免疫磁珠分选法进行细胞分选,并对分选出的细胞进行特定的血管内皮细胞定向诱导。对乳牙牙髓干细胞及血管内皮细胞定向诱导后的细胞进行镜下形态观察、血管生成实验,以及免疫表型鉴定。结果 镜下形态观察显示,经过血管内皮定向诱导的乳牙牙髓干细胞呈典型血管内皮细胞的形态特征;血管生成实验表明,经过血管内皮定向诱导的乳牙牙髓干细胞可呈现明显的血管样结构;免疫表型鉴定显示经过血管内皮定向诱导的乳牙牙髓干细胞血管内皮细胞表面抗原呈阳性。结论 乳牙牙髓干细胞可定向分化为血管内皮细胞。     

人非小细胞肺癌血管内皮细胞的分离培养及鉴定

目的:建立人非小细胞肺癌血管内皮细胞体外分离培养体系,研究其体外生长特性。方法:利用酶消化法分离出肺癌组织微血管片段,采用植块培养法培养原代内皮细胞,先后以局部消化法和差速黏附法进行纯化;应用光镜、免疫细胞化学及免疫荧光技术对所获得的人肺癌血管内皮细胞进行鉴定。结果:所获人非小细胞肺癌血管内皮细胞呈FⅧ-RAg、CD34阳性;电镜下生长状态良好、可传代培养。结论:本研究摸索并建立了人非小细胞肺癌血管内皮细胞的分离培养方法,所获人非小细胞肺癌血管内皮细胞对肿瘤血管生成及抗肿瘤药物的研究具有重要价值。     

血管内皮细胞生长因子基因转染诱导大鼠骨髓基质干细胞分化为内皮细胞

目的：评价经腺病毒介导的血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因转染后的大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导成内皮细胞的可行性。方法：从大鼠骨髓中分离培养获取BMSCs，分别经Adv-VEGF、Adv-GFP转染，Western印迹分析检测VEGF蛋白的表达情况．细胞生长曲线测定BMSCs增殖特性．同时进行免疫表型鉴定．并与未转染细胞组比较。结果：Adv-VEGF转染组BMSCs可分泌VEGF蛋白，而其杂两组不分泌VEGF蛋白。转染VEGF基因后,BMSCs生长速度变快．向内皮细胞分化。与Adv-VEGF转染组BMSCs相比．Adv-GFP转集细胞组、未转染细胞组的BMSCs生长速度较慢．未有向内皮细胞分化的证据。结论：腺病毒介导的VEGF基因转繁可诱导BMSCs分化成内皮细胞。