绿色荧光蛋白和HCV5′NCR调控荧光素酶双顺反子真核表达载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的 :探讨绿色荧光蛋白 (greenfluorescentprotein ,GFP)和HCV 5′NCR(noncodingregion)调控荧光素酶双顺反子真核表达载体的构建及其在肝细胞中的表达。方法 :用基因重组技术 ,将真核表达载体pCMVNCRLuc的HCV5′NCR及其调控的荧光素酶基因亚克隆至报告载体pEGFP C1的GFP基因下游 ,构建含GFP和HCV 5′NCR调控荧光素酶双顺反子的真核表达载体pGFPNCRLuc。用脂质体基因转染技术 ,将pGFPNCRLuc转染至肝细胞株QSG770 1。结果 :GFP和荧光素酶基因均得到高效表达 ,其荧光素酶表达强度与pCMVNCRLuc比较 ,差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,GFP表达水平与pEGFP C1比较 ,差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论 :成功构建HCV和HCV 5′NCR调控荧光素酶双顺反子真核表达载体 ,HCV和荧光素酶基因在肝细胞内得到共表达。该结果为特异性抗HCV药物评价系统的建立创造了条件     

HCV 5′非编码区和核心区重组真核表达质粒的构建及其细胞内定位

目的 :构建丙型肝炎病毒 (HCV)重组真核表达载体 ,为HCV感染基因免疫和基因治疗的研究奠定基础。方法 :构建含HCV 5′非编码区 (NCR)及编码核心蛋白C区基因片段的重组真核表达质粒pBBS2 12 HCV ,通过脂质体介导转染入人肝癌细胞株HepG2中 ,应用RT PCR及免疫组织化学方法鉴定HCV核心蛋白的表达及其在细胞内的定位。结果 :重组真核表达质粒在HepG2细胞中有稳定表达 ,HCV核心蛋白以胞浆内表达为主。结论 :成功构建了含HCV 5′NCR和核心C区基因片段的真核表达载体 ,明确核心抗原的细胞内定位主要在细胞胞浆内。     

HCV 5′非编码区和核心区重组真核表达质粒的构建及其细胞内定位

目的 :构建丙型肝炎病毒 (HCV)重组真核表达载体 ,为HCV感染基因免疫和基因治疗的研究奠定基础。方法 :构建含HCV 5′非编码区 (NCR)及编码核心蛋白C区基因片段的重组真核表达质粒pBBS2 12 HCV ,通过脂质体介导转染入人肝癌细胞株HepG2中 ,应用RT PCR及免疫组织化学方法鉴定HCV核心蛋白的表达及其在细胞内的定位。结果 :重组真核表达质粒在HepG2细胞中有稳定表达 ,HCV核心蛋白以胞浆内表达为主。结论 :成功构建了含HCV 5′NCR和核心C区基因片段的真核表达载体 ,明确核心抗原的细胞内定位主要在细胞胞浆内。     

绿色荧光蛋白和HCV5′NCR调控荧光素酶双顺反子真核表达载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的：探讨绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP)和HCV5′NCR(noncoding region)调控荧光素酶双顺反子真核表达载体的构建及其在肝细胞中的表达。方法：用基因重组技术，将真核表达载体pCMVNCRLuc的HCV5′NCR及其调控的荧光素酶基因亚克隆至报告载体pEGFP-C1的GFP基因下游，构建含GFP和HCV5′NCR调控荧光素酶双顺反子的真核表达载体pGFPNCRLuc。用脂质体基因转染技术，将pcGFPNCRLuc转染至肝细胞株QSG7701。结果：GFP和荧光素酶基因均得到高效表达，其荧光素酶表达强度与pCMVNCRLuc比较，差异无显著性（P＞0.05)，GFP表达水平与pEGFP-C1比较，差异无显著性（P＞0.05)。结论：成功构建HCV和HCV5′NCR调控荧光素酶双顺反子真核表达载体，HCV和荧光素酶基因在肝细胞内得到共表达。该结果为特异性抗HCV药物评价系统的建立创造了条件。     

HCV 5′UTR调控GFP真核表达质粒的构建及表达

目的构建丙型肝炎病毒5′非翻译区（HCV 5′UTR）调控绿色荧光蛋白真核表达质粒，并在HepG2细胞中表达。方法通过PCR扩增，获得HCV基因组HCV 5′UTR完整序列及C区序列的部分基因片断。将此片断插入pEGFP-NI载体多克隆位点区，构建受HCV 5′UTR调控的绿色荧光蛋白真核表达质粒．应用脂质体转染技术转染HepG2细胞并观察荧光。结果成功构建受HCV 5′UTR调控的绿色荧光蛋白真核表达质粒，并在HepG2细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达。结论该载体的成功构建，可以用于直观地评价针对HCV 5′UTR的基因药物的效果。     

HCV脱氧核酶在表达荧光素酶HepG2细胞中的活性

目的　对丙型肝炎病毒 (HepatitisCvirus ,HCV) 5′ 非编码区 ( 5′ Noncodingregion ,5′ NCR)靶向性脱氧核酶 (De oxyribozymes ,DRz)在靶基因调控性荧光素酶表达HepG2细胞中的活性进行评价。方法　根据HCV 5′ NCR中符合 5′…Y↓R… 3′(Y =A/G ,R =U/C)特征的位点及 5′ NCR的二级结构选择靶位 ,采用 10 2 3DRz基序 ,设计并合成HCV靶向性脱氧核酶DRz 2 3 2、DRz 12 7、DRz 84、DRz1以及两端被硫代修饰的DRz(Phosphorothioatedeoxyribozymes ,TDRz)和活性中心区人工突变的硫代DRz(MutantphosphorothioateDRz ,MDRz)。直接将其加入体外培养的受HCV 5′ NCR调控的表达荧光素酶HepG2细胞 (HepG2 970 6细胞株 )中 ,或用脂质体转染法将其导入靶细胞。用化学发光法检测荧光素酶活性 ,计算抑制率。结果　转染终浓度为 0 5 μmol/L的药物 2 4h后 ,DRz 2 3 2 /TDRz 2 3 2、DRz 12 7/TDRz 12 7、DRz 84/TDRz 84和DRz1/TDRz1的抑制率分别约14 3 %/ 14 9%、5 3 2 %/ 5 0 6%、2 5 6%/ 2 3 8%和 44 7%/ 43 3 %,均高于对应的MRz ,其中DRz 12 7/TDRz 12 7与MRz 12 7( 4 1 2 %)相比抑制率有显著性差别 (P <0 0 5 )。直接将TDRz 12 7或MRz 12 7加入细胞培养体系中被动作用 5h和 2 4h ,抑制率无明显差别 ,     

抗丙型肝炎病毒5′非编码区核酶在细胞内对病毒翻译启动的抑制作用

目的　研究抗丙型肝炎病毒(HCV)5′非编码区(NCR)双位点213和260核酶(Rz)在细胞内对HCV翻译启动功能的抑制作用.方法　通过脂质体介导的基因转染方法,转染Rz基因和带荧光素酶(luc)的靶基因真核表达载体于人肝癌细胞(HHCC),应用液体闪烁计数仪检测luc报告基因的表达活性.结果　Rz213和Rz260均能在HHCC细胞内有效地抑制luc基历的表达,其抑制率在45%～70%之间,而针对两个不同切割位点的Rz之间无显著差异.结论　我们构建的Rz213和Rz260真核表达载体能在HHCC细胞内表达,并有效地抑制HCV5′NCR介导的翻译启动作用抗丙型肝炎病毒5′…     

带GFP的启动子鉴定质粒的构建及在HCV启动子鉴定中的应用

目的:利用已有质粒构建带GFP报告基因的启动子鉴定质粒,并用此质粒鉴定丙型肝炎病毒5非翻译区(HCV5'-UTR)启动基因表达的活性.方法:用限制性内切酶将质粒pEGFP-N1上的EGFP基因片断切下,与用相同酶切去除荧光素酶基因片断的PGL3 enhancer质粒大片断连接,得到带GFP的启动子鉴定质粒pEGFP enhancer.HCV 5'-UTR片断用PCR方法获得,插入pEGFP enhancer的多克隆区,构建HCV 5'-UTR驱动GFP表达质粒.应用脂质体转染技术转染HepG2细胞并观察荧光.结果:成功构建带GFP报告基因的启动子鉴定质粒,并在此基础上构建了HCV 5'-UTR启动GFP表达的质粒.前者转染HepG2细胞后,几乎无GFP表达,而后者观察到较强的绿色荧光.结论:该实验构建的带GFP报告基因的启动子鉴定质粒本底表达低,可用于真核启动子的鉴定.HCV 5'-UTR可以启动报告基因的表达,具有启动子活性.     

丙型肝炎病毒NS5A基因真核表达载体的构建及其在HL-7702细胞中的高效表达

目的：构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5A基因的真核表达载体，并在正常人肝细胞株(HL-7702细胞)中进行表达，为今后研究HCV NS5A蛋白功能奠定基础。方法：从含HCV NS345序列的重组质粒pCDNA3.1（+）/ NS345中扩增出HCV NS5A基因片段，构建pCI-neo/ NS5A重组表达质粒。用脂质体将其转染HL-7702细胞，通过Western blotting印迹法鉴定NS5A蛋白。结果：用PCR方法扩增的HCV NS5A基因全长1 344 bp,与PGEM-T重组，测序证实所克隆的NS5A基因片段大小正确；成功地构建pCI-neo/ NS5A重组表达质粒，瞬时转染HL-7702细胞表达NS5A蛋白，Western blotting印迹法显示其相对分子质量约为56 000。结论：HCV NS5A的真核表达载体pCI-neo/ NS5A在HL-7702细胞中能有效表达NS5A蛋白，NS5A蛋白可导致病毒复制、肝细胞癌发生，且NS5A区为IFN敏感性决定区。     

果蝇S2细胞中高表达荧光素酶重组质粒的构建及活性测定

目的：构建果蝇S2细胞中高表达荧光素酶的重组质粒。方法：用PCR方法扩增得到pac启动子的基因片段,经酶切亚克隆至pGL3—Basic的真核表达载体中,转染果蝇S2细胞,通过测定荧光素酶和β-半乳糖苷酶的活性计算荧光素酶的相对活性。结果：构建的重组质粒在S2细胞中荧光素酶的相对活性较pGL3—Control中增加了2．7万倍。结论：成功构建了果蝇S2细胞中高表达荧光素酶的重组质粒pGL3—pac。     

Expression of secreted alkaline phosphatase in hepatocytes controlled by HCV IRES]

OBJECTIVE: To establish a cell model of secreted alkaline phosphatase (SEAP) controlled by HCV internal ribosome entry site (IRES). METHODS: The fragment of HCV 5' noncoding region (5' NCR) was amplified by polymerase chain reaction (PCR), and was immediately cloned the upstream of the SEAP gene of pSEAP2-Control, an SEAP eukaryotic expression plasmid. With the liposome transfection technique, the resulting recombinant plasmid pdNCRSEAP was transfected into hepatocytes QSG7710, and the SEAP activity of cell culture media was monitored quantitatively by the chemiluminescent method. The regulatory effect of the HCV 5' NCR on the SEAP expression was measured by the treatment of transfected cells with antisense oligodeoxynucleotide (ASODN) at 5 mumol and 10 mumol, respectively. RESULTS: The light emission intensity of pdNCRSEAP expression was 76% that of pSEAP2-Control. The inhibition rates of pNCRSEAP luminescence intensity affected by ASODN of 5 mumol and 10 mumol were 29.2% and 44.6%, respectively, while ASODN had no significant effect on the pSEAP2-Control expression. CONCLUSION: The SEAP expression of pdNCRSEAP is controlled by HCV 5'NCR. The cell model of drug evaluation targeted at HCV 5'NCR is successfully established and can be analyzed conveniently.     

HOXA1基因反义寡核苷酸对食管癌细胞生长的影响

  目的  探讨同源异形盒A1(HOXA1)基因反义寡核苷酸（ASODN）对食管癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响及机制。  方法  采用蛋白免疫印迹（Western blot）检测正常食管上皮细胞Het-1A和人食管鳞癌TE-1、EC9706和Eca109细胞HOXA1蛋白的表达,筛选高表达的食管鳞癌细胞进行后续实验;设计合成HOXA1 ASODN链、正义寡核苷酸(SODN)链及无义寡核苷酸（N-ODN）链;将筛选出的高表达的食管鳞癌细胞分为HOXA1 ASODN组（5、10、15 μmol/L的HOXA1 ASODN转染Eca109细胞）、对照组（细胞常规培养,不进行细胞转染）、SODN组（细胞转染15 μmol/L的SODN）和N-ODN组（细胞转染15 μmol/L的N-ODN）。采用噻唑蓝(MTT)法、流式细胞术、Transwell小室分别检测细胞活力、凋亡率及侵袭迁移能力;Western blot检测HOXA1、磷酸化的丝氨酸苏氨酸激酶（p-AKT）、细胞增殖核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、B细胞淋巴瘤-2蛋白（B-cell lymphoma 2,Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达。  结果  与正常食管上皮细胞Het-1A比较,人食管鳞癌TE-1、EC9706和Eca109细胞HOXA1蛋白表达均升高,差异有统计学意义（P<0.05）。HOXA1蛋白在Eca109细胞表达最高,因此选用Eca109细胞进行后续实验。转染HOXA1 ASODN的Eca109细胞HOXA1蛋白表达降低（P<0.05）。随着Eca109细胞转染HOXA1 ASODN浓度及时间增加,Eca109细胞活力降低,与对照、SODN、N-ODN组比较差异有统计学意义（P<0.05）。15 μmol/L的HOXA1 ASODN转染Eca109细胞后,与对照组比较,细胞侵袭和迁移能力降低,凋亡率升高,p-AKT、PCNA和MMP-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达升高（P<0.05）。  结论  HOXA1基因反义寡核苷酸可抑制食管癌细胞增殖、侵袭和迁移能力,并诱导凋亡,机制与抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT信号通路可能有关。     

HIF-1α反义寡核苷酸体外对人脑胶质瘤细胞U251的作用

目的:研究缺氧诱导因子-1α(H IF-1α)反义寡核苷酸(ASODN)转染对人胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响,探讨以H IF-1α为靶点进行反义寡核苷酸转染治疗胶质瘤的有效性。方法:设计合成针对H IF-1α的寡核苷酸片段.实验分6组:空白对照组、脂质体组、正义组和反义组(1.0μmol/l、2.5μmol/l和5.0μmol/l)。利用脂质体包裹瞬时转染人胶质瘤细胞系U251,MTT法检测细胞增殖;采用AO/EB染色及末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡的变化。结果:转染后各组细胞增殖抑制率分别为(1.30±0.05)%、(1.98±0.35)%、(2.47±0.48)%、(22.30±2.08)%、(33.60±4.19)%和(56.20±4.22)%。转染H IF-1α反义寡核苷酸组较各对照组相比细胞增生下降,凋亡增加(P<0.01)。结论:H IF-1α反义寡核苷酸转染人胶质瘤U251细胞系可以抑制细胞增生并诱导胶质瘤细胞凋亡,H IF-1α有望成为一个极具潜力的肿瘤治疗的靶点。     

剪切HCV RNA的HDV核酶的设计及活性测定

目的：探讨丁型肝炎病毒（Hepatitis D virus,HDV）核酶用于抗丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）基因治疗的可能性。方法：以HDV基因组核酶的假结样结构为基础,优化其茎IV区,改建基底物结合区,获得3种针对HCV RNA的HDV核酶RzC1、RzC2和RzC3。体外转录获取含HCV RNA5‘－非编码区（5‘-noncoding region,5‘-NCR）及部分C区在内的底物RNA（HCV RNA 5‘－NCR－C）,并进行5‘端放射性标记。在pH7.5、37℃、Mg^2 20mmol/L和去离子甲酰胺2.5mol/L等条件下,将核酶和底物按摩尔比100：1混合,在不同的时间点观察剪切百分率。结论：RzC1、RzC2对底物的剪切百分率随时间延长而递增,90min分别达24.9％、20.3％;未观察到RzC3有剪切活性。结论：经过结构构优化的HDV基因组核酶在合适的位点能够剪切异源性RNA分子HCV RNA。     

维拉帕米通过下调硫氧还蛋白互作蛋白的表达抑制丙型肝炎病毒感染

目的 探讨抗高血压药维拉帕米是否可通过下调宿主硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP)的表达而抑制丙型肝炎病毒(HCV)的感染.方法 用不同浓度梯度的维拉帕米处理人肝癌细胞系Huh7.5.1,用qPCR和蛋白质印迹法检测TXNIP的表达.用维拉帕米处理Huh7.5.1细胞,同时加入细胞培养产生的HCV (HCVcc),48 h后检测HCVcc感染情况.用TXNIP siRNA转染Huh7.5.1细胞,检测下调TXNIP表达后,维拉帕米对HCVcc感染的影响;用TXNIP启动子调控的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因表达质粒(pTXNIP-EGFP)转染Huh7.5.1细胞,分析维拉帕米对TXNIP启动子转录活性的影响.结果 与对照孔相比,维拉帕米(100、200、400 μmol/L)可下调Huh7.5.1细胞中TXNIP的表达,并呈现浓度依赖性(P＜0.05);并可抑制HCVcc对Huh7.5.1细胞的感染,且浓度越高抑制作用越明显(P＜0.05).进一步研究结果显示,与对照组相比,维拉帕米能够抑制pTXNIP-EGFP转染细胞中EGFP的表达水平(P＜0.05).结论 维拉帕米可下调TXNIP的表达从而抑制HCV感染,这可能是通过抑制TXNIP启动子的转录活性来实现的.     

脂质体介导10-23脱氧核酶对人血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 :研究针对增殖细胞核抗原 (PCNA)基因特异性的 10 - 2 3脱氧核酶 (DNAzyme)对人血管平滑肌细胞(VSMC)PCNA的表达和细胞增殖的影响。方法 :应用脂质体转染法将不同寡聚核苷酸转入体外培养的人脐动脉VSMC。采用3 H -TdR掺入法观察空白对照组、脂质体组和等摩尔浓度 (1.0 μmol/L)的DNAzyme、反义寡核苷酸 (A SODN)、mDNAzyme在干预 2d后VSMC的DNA合成速率 ;免疫组化检测 1.0 μmol/L的DNAzyme和ASODN转染 2d后对PCNA表达的影响 ;四甲基偶氮唑蓝 (MTT)比色法分析不同剂量的DNAzyme(0 .12 5、0 .2 5、0 .5、1.0、2 .0 μmol/L)转染5d后VSMC增殖活性。结果 :1.0 μmol/LDNAzyme和ASODN转染 2d后 ,VSMC的3 H -TdR掺入量均较对照组显著减低 (P <0 .0 5 ) ,DNAzyme较ASODN更显著减低 (P <0 .0 5 ) ;1.0 μmol/LDNAzyme作用 2d后细胞增殖抑制率为 6 4 .5 % ,高于ASODN组 (37.7% )、mDNAzyme组 (11.9% )和脂质体组 (3.3% )。DNAzyme和ASODN处理细胞 2d后 ,PCNA的表达水平 (平均光密度值 )分别为 0 .2 95 6± 0 .0 2 5 1和 0 .3880± 0 .0 92 5 ,明显低于空白对照组 0 .7342± 0 .2 136 (P <0 .0 1)。转染 5d后 ,DNAzyme的作用呈剂量依赖性 ,0 .12 5 μmol/LDNAzyme处理后VSMC的增殖较对照组低 (P <0 .0 5 )。     

Hepatitis C virus nonstructural protein NS3 and telomerase activity

Objective To study the effect of hepatitis C virus nonstructural protein NS(3) （HCV NS(3)） on telomerase activity and carcinogenesis.Methods Streptavidin-peroxidase (SP) conjugated method was used to detect the expressio n of HCV NS(3) protein in NIH3T3 cells transfected with plasmid pRcHCNS(3)-5’ and pRcHCNS(3)-3’. Telomerase activity was detected by an in situ telomerase a ctivity labeling method, telomeric repeat amplification protocol polymerase chai n reaction (TRAP-PCR) and telomerase PCR enzyme linked immunosorbent assay (ELI SA) technology in the transfected and non-transfected NIH3T3 cells.Results HCV NS(3) protein was expressed in the NIH3T3 cells transfected with plasmid pR cHCNS(3)-5’ expressing HCV NS(3) C-terminal deleted protein or with plasmid pR cHCNS(3)-3’ expressing HCV NS(3) N-terminal deleted protein. The positive sig nal of HCV NS(3) protein was localized in the cytoplasm of NIH3T3 cells, and th e signal intensity of the former was stronger. Telomerase activity in NIH3T3 c ells transfected with plasmid pRcHCNS(3)-5’ was stronger than that in NIH3T3 c ells transfected with plasmid pRcHCNS(3)-3’ (P&lt;0.01), whereas telomerase a ctivity in NIH3T3 cells transfected with plasmid pRcCMV or untreated NIH3T3 ce lls was weaker than that in NIH3T3 cells transfected with plasmid pRcHCNS(3)-3 ’ (P&lt;0.05). The expression level of HCV NS(3) protein was significantly co rrelated with the strength of telomerase activity (P&lt;0.05). The results ob tained by in situ telomerase activity labeling corresponded to the results by te lomerase PCR ELISA technology. Conclusions HCV NS(3) protein may activate telomerase through endogenous mechanism to induce host cell transformation. The effect of HCV NS(3) C-terminal deleted protein on telomerase activity in the host cell may be stronger than that of HCV NS(3) N -terminal deleted protein. In situ telomerase activity labeling was a reliabl e technology for studying pathological morphology and telomerase activity in tis sues and cells.