转化生子因子β1对培养心脏成纤维细胞α-SMA及Cx43表达的影响

目的：本研究拟观察转化生子因子β1（TGFβ1）诱导乳鼠CFs向MFs分化中α—SMA及Cx43表达的影响。方法：酶解-差速贴壁分离法分离培养乳鼠CFs,将10ng／mL的TGFβ1诱导培养第1天细胞;细胞免疫荧光及共聚焦纤维观察α—SMA及Cx43表达;以免疫印迹和RT—PCR分别半定量比较两者a—SMA及Cx43蛋白和mRNA表达。结果：分离培养2d的原代CFs细胞极少表达a-SMA及Cx43蛋白及其mRNA;经TGFβ1诱导24h后α—SMA及Cx43蛋白及其mRNA表达显著增高（P〈0．01）。结论：TGFβ1,可诱导乳鼠CFs向MFs分化,导致α—SMA及Cx43蛋白及其mRNA表达显著增高。     

雌二醇对大鼠肝星状细胞MMP-2、TIMP-1表达的影响

目的探讨雌二醇对肝星状细胞（HSC）的影响及其可能的作用途径。方法培养大鼠HSC,初次传代后,HSC随机分为4组,分别加入不同浓度的雌二醇,噻唑蓝（MTT）法检测雌二醇对HSC增殖的影响;逆转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）分析其对HSC的基质金属蛋白酶因子（MMP-2）、组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP-1）的mRNA表达的影响;免疫细胞化学分析其对HSC的α—SMA蛋白的表达的影响。结果MTT法发现雌二醇抑制HSC的增殖,并且随浓度增加抑制作用增强,与阳性对照组比较雌二醇干预组HSCMMP-2mRNA表达增加（P〈0．01）,TIMP—1mRNA的表达下降（P〈0．01）,α-SMA蛋白表达明显下降（P〈0．05）。结论雌二醇具有抑制肝纤维化作用是因为：①可以抑制HSC的增殖、活化;②促进MMP-2mRNA的表达,抑制了TIMP-1mRNA的表达。     

姜黄素对肝纤维化大鼠肝组织中核转录因子-κB及细胞外信号调节激酶-1mRNA表达的影响

目的探讨核转录因子-κB（NF-κB）及细胞外信号调节激酶（ERK）mRNA在CCl4致实验性肝纤维化大鼠肝组织中的表达及姜黄素（CUR）对它们的影响。方法建立CCl4致大鼠实验性肝纤维化的模型,用免疫组织化学法比较正常组、模型组以及CUR组的α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达,用RT—PCR法比较各组肝组织NF-κB以及ERK-1mRNA的表达。结果NF-κB mRNA及ERK—1mRNA的表达：正常组分别为0．317±0．035和0．434±0．067,模型组分别为1．219±0．158和0．944±0．151,CUR组分别为0．912±0．274和0．736±0．293,CUR组与模型组比较,P值均〈0．05．差异有统计学意义。α-SMA的表达：CUR组为4．327±2．064,模型组为6．784±2．158,正常组为0．943±0．371,CUR组与模型组比较．P值均〈0．05．差异有统计学意义。结论CUR可能通过抑制α—SMA的表达,减弱NF-κB诱导的肝星状细胞的活化以及抑制ERK-1的促肝星状细胞的增殖,从而起到抗大鼠肝纤维化的作用。     

酸敏感离子通道1a在高糖环境下肝纤维化发病中的作用研究

目的研究ASIC1a(acid-sensing ion channel 1a)对糖尿病合并肝纤维化的病理影响及高糖环境下PDGF-BB刺激的HSC-T6细胞活化增殖的作用。方法采用链脲佐菌素(STZ)制备大鼠糖尿病模型,四氯化碳(CCl4)诱导大鼠肝纤维化模型,观察糖尿病组、单纯肝纤维化组及糖尿病并发肝纤维化双模型组肝组织损伤程度及ASIC1a的表达变化;体外实验,利用ASIC1a阻断剂阿米洛利(amiloride)预处理HSC-T6细胞,然后加入高糖处理HSC-T6细胞24 h,再添加重组小鼠血小板衍生生长因子(PDGF-BB)刺激24 h,观察HSC-T6的活化增殖情况;Western blot检测ASIC1a、α-SMA和Collagen I蛋白表达水平。结果 STZ诱导的糖尿病大鼠、CCl4诱导的肝纤维化大鼠和STZ加CCl4联合诱导的糖尿病肝纤维化双模型大鼠肝组织较对照组大鼠肝组织均出现不同程度的肝损伤,其中双模型大鼠的损伤最为严重,且3组大鼠肝组织较对照组大鼠肝组织中ASIC1a表达明显升高,双模型大鼠肝组织中ASIC1a升高最为明显;阿米洛利预处理HSC-T6,明显降低了高糖环境下ASIC1a的表达,并抑制了高糖环境下PDGF-BB诱导的HSC-T6中α-SMA、Collagen I的表达。结论高糖环境加剧CCl4诱导大鼠肝纤维化及PDGF-BB诱导的HSC活化,其可能与高糖环境下ASIC1a的过表达有关。     

姜黄素衍生物对原代大鼠肝星状细胞作用的体外研究

目的：观察姜黄素衍生物（Curc-OEG）抑制原代肝星状细胞（HSC）增殖、活化以及诱导其凋亡的作用,探讨其可能的作用机制。方法：采用IV型胶原酶、DNA酶消化SD雄性大鼠肝脏,percoll梯度离心得到纯化的肝星状细胞。细胞分离后1d分别加入0、6.25、12.5μg/mL的姜黄素衍生物,作用7d后用RT-PCR及Western blot检测细胞α-SMA、TGF-β1、Smad2的mRNA水平和蛋白表达量。活化的肝星状细胞在第14天分别加入0、6.25、12.5、25、50、75μg/mL的姜黄素衍生物,作用24h后RT-PCR检测凋亡基因Bax、Bcl-2的mRNA水平和纤维化相关基因TGF-β1、collagen I、NF-κB及TIMP-1的mRNA水平。结果：药物作用7d后,6.25μg/mL和12.5μg/mL浓度药物处理组与对照组相比,细胞数目分别减少了56%和86%。在12.5μg/mL浓度药物作用下,原代肝星状细胞α-SMA、TGF-β1及Smad2的mRNA表达水平分别下调83%、85%及75%,蛋白表达水平分别下调94%、92%及73%（P〈0.05）。25μg/mL浓度药物作用24h后,细胞凋亡明显。在50μg/mL浓度药物作用下,活化的肝星状细胞Bax的mRNA表达水平上调约2.3倍,Bcl-2的mRNA表达水平下调约5.6倍;TGF-β1、collagen I、NF-κB及TIMP-1的mRNA表达水平分别下调90%、83%、74%、65%（P〈0.05）。结论：姜黄素衍生物可以明显抑制原代肝星状细胞的增殖和活化,促进活化的肝星状细胞凋亡及减少细胞外基质的沉积。     

橙皮苷对化学性肝纤维化大鼠α－SM A表达的影响

目的：观察橙皮苷对化学性肝纤维化大鼠α－平滑肌肌动蛋白（α－smooth muscle actin,α－SMA）表达的影响,探讨其可能的作用机制。方法采用50％四氯化碳（ carbon tetrachloride,CCl4）每周2次,连续12周皮下注射的方法,诱导肝纤维化大鼠模型。造模后第7周,每天按50,100,200 mg· kg－1灌胃给予不同剂量的橙皮苷（hesperidin,HDN）和秋水仙碱（0．1 mg· kg－1）,共6周。末次给药后,禁食8 h,处置大鼠,分光光度法检测血清丙氨酸转氨酶（ alanine aminotransferase,ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）和肝组织羟脯氨酸（hydroxyproline,Hyp）的含量;取固定部位肝脏组织,HE和Masson染色观察肝组织病理损伤程度,免疫组化和RT－PCR技术检测肝组织中α－SMA蛋白与mRNA的表达。结果与模型组相比,HDN （100,200 mg· kg－1）组不仅可改善大鼠肝纤维化损伤程度,降低ALT、AST、Hyp含量（P＜0．05或P＜0．01）,还可减少肝组织中α－SMA蛋白与mRNA的表达（P＜0．05或P＜0．01）。结论 HDN对化学性肝纤维化大鼠具有很好的保护作用,其机制可能与抑制肝星状细胞的活化、增殖有关。     

酸敏感离子通道1a在酸诱导的大鼠关节软骨细胞自噬的作用及其机制研究

目的研究酸敏感离子通道1a(acid-sensing ion chan-nel 1a)在体外培养的酸诱导的大鼠关节软骨细胞自噬的作用及其可能机制。方法Ⅱ型胶原酶消化法分离大鼠关节软骨细胞,鉴定后传代培养,观察在不同pH条件下诱导的细胞自噬情况以确定胞外酸化条件;将软骨细胞分为pH7.4环境下培养的正常组、pH 6.0的酸化组、以及经ASIC1a非特异性阻断剂Amiloride和特异性阻断剂PcTX1处理的酸化组,RT-PCR法检测细胞自噬基因Beclin-1 mRNA的表达,Western blot法检测自噬蛋白LC3及ERK1/2、p38MAPK磷酸化蛋白的表达,透射电子显微镜法(TEM)观察自噬小体数量的变化;通过使用ERK1/2、p38MAPK磷酸化抑制剂(PD98059、SB203580),采用RT-PCR和Western blot法观察ERK1/2及p38MAPK对酸诱导的软骨细胞自噬的影响。结果 pH 5.5和pH 6.0胞外酸化刺激均能明显升高软骨细胞自噬水平(P<0.01);与pH 7.4组比较,酸化组软骨细胞Beclin-1 mRNA及LC3、磷酸化的ERK1/2和p38MAPK蛋白表达水平均明显升高(P<0.01),且自噬小体数量增多,ASIC1a阻断剂组自噬水平及ERK1/2、p38磷酸化蛋白表达水平较酸化组明显降低(P<0.01),且自噬体数量减少;与pH 6.0组相比,ERK1/2磷酸化抑制剂处理后,Beclin-1 mR-NA和LC3蛋白的表达均下调(P<0.05,P<0.01),而p38磷酸化抑制剂组自噬水平则无明显变化。结论胞外酸化环境下能诱发软骨细胞自噬,阻断ASIC1a能明显减弱酸化诱导的软骨细胞自噬,其机制可能与抑制ERK1/2磷酸化有关。     

高表达SUMO蛋白对人肝星状细胞LX-2纤维化的影响

目的研究在体外培养的人肝星状细胞LX-2中高表达SUMO蛋白对LX-2纤维化指标的影响。方法采用脂质体瞬时转染法分别将SUMO-1／2／3的高表达质粒转染入LX-2细胞中,分别运用RT-PCR和Western Blot检测a-SMA、Collagen I、MMP-2、TIMP-1的mRNA和蛋白表达量。结果转染质粒48h后a—SMA、Collagen I的mRNA和蛋白表达水平显著降低（P〈0．05）,MMP-2、TIMP-1的mRNA表达量亦显著降低（P〈0．01）,但MMP-2和TIMP-1的蛋白表达水平无明显影响。结论高表达SUMO蛋白能抑制人肝星状细胞LX-2的纤维化过程。     

自噬抑制剂对乙醇诱导的肝星状细胞活化作用的影响

【摘要】目的 观察自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）对乙醇诱导的肝星状细胞（HSC）活化作用,并探讨其作用机制。方法 体外培养大鼠肝星状细胞株HSC-T6,设立空白对照组、阳性对照组（乙醇刺激组）、低剂量组（5 mmol/L3-MA+100mmol/L乙醇）、高剂量组（10mmol/L3-MA+100mmol/L乙醇）。RT-PCR分析各组HSC活化标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及Ⅰ型胶原基因表达,Western blot法检测各组HSC中自噬水平标志蛋白LC3Ⅱ、α- SMA、Ⅰ型胶原表达;MTT法检测3-MA对乙醇诱导的HSC增殖的影响。结果与空白对照组比较,阳性对照组中α- SMA、Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达及LC3Ⅱ表达量明显增加（P＜0.05）,高剂量组却显著减少（P＜0.01）;与阳性对照组比较,低剂量组和高剂量组中α-SMA、Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达及LC3Ⅱ表达量逐渐减少（P＜0.05）;与低剂量组比较,高剂量组中α-SMA、Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达及LC3Ⅱ表达减少（P＜0.05）。与阳性对照组比较,加入3- MA处理后的HSC增殖显著减少（P＜0.05）。结论3-MA可抑制乙醇诱导的HSC-T6细胞中LC3Ⅱ蛋白的表达、α- SMA、Ⅰ型胶原mRNA及蛋白的表达,抑制HSC增殖,且高剂量的作用更明显。     

鸢尾黄素对肝星状细胞外基质表达的影响

目的:研究鸢尾黄素对肝星状细胞的活化以及细胞外基质合成和降解的影响。方法:体外培养大鼠肝星状细胞株HSC-T6,通过荧光定量PCR法检测鸢尾黄素对肝星状细胞的Ⅰ型胶原、α-肌动球蛋白(α-SMA)、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)以及基质金属蛋白酶-1抑制剂(TIMP-1)mRNA的表达的影响。结果:鸢尾黄素能显著抑制肝星状细胞中Ⅰ型胶原及活化标志α-SMA mRNA的表达,增强肝星状细胞中MMP-13 mRNA的表达,降低TIMP-1 mRNA的表达。结论:鸢尾黄素既可以有效地抑制肝星状细胞的活化,同时又能减少肝星状细胞胞外基质的合成以及增加胞外基质的降解,因而具有潜在的抗肝纤维化的作用。     

TRPM7 channel regulates PDGF-BB-induced proliferation of hepatic stellate cells via PI3K and ERK pathways

TRPM7, a non-selective cation channel of the TRP channel superfamily, is implicated in diverse physiological and pathological processes including cell proliferation. Recently, TRPM7 has been reported in hepatic stellate cells (HSCs). Here, we investigated the contribution role of TRPM7 in activated HSC-T6 cell (a rat hepatic stellate cell line) proliferation. TRPM7 mRNA and protein were measured by RT-PCR and Western blot in rat model of liver fibrosis in vivo and PDGF-BB-activated HSC-T6 cells in vitro. Both mRNA and protein of TRPM7 were dramatically increased in CCl₄-treated rat livers. Stimulation of HSC-T6 cells with PDGF-BB resulted in a time-dependent increase of TRPM7 mRNA and protein. However, PDGF-BB-induced HSC-T6 cell proliferation was inhibited by non-specific TRPM7 blocker 2-aminoethoxydiphenyl borate (2-APB) or synthetic siRNA targeting TRPM7, and this was accompanied by downregulation of cell cycle proteins, cyclin D1, PCNA and CDK4. Blockade of TRPM7 channels also attenuated PDGF-BB induced expression of myofibroblast markers as measured by the induction of α-SMA and Col1α1. Furthermore, the phosphorylation of ERK and AKT, associated with cell proliferation, decreased in TRPM7 deficient HSC-T6 cells. These observations suggested that TRPM7 channels contribute to perpetuated fibroblast activation and proliferation of PDGF-BB induced HSC-T6 cells via the activation of ERK and PI3K pathways. Therefore, TRPM7 may constitute a useful target for the treatment of liver fibrosis.     

莪术醇对肝星状细胞Rho-ROCK信号通路作用的实验研究

目的：研究莪术醇对肝星状细胞Rho-ROCK信号通路的作用，以此来分析莪术醇抗肝纤维化的作用机制。方法：用莪术醇孵育HSC-T6细胞48 h后用MTT法检测细胞增殖率，用免疫印迹和RT-PCR检测Rho-ROCK信号通路上关键分子RhoA和ROCK2的表达和含量。结果：RT-PCR检测发现莪术醇高、中、低浓度对Rho-ROCK信号通路中的关键分子RhoA和ROCK2mRNA的表达较模型组有抑制作用，而且这种抑制作用有明显的剂量依赖性，差异有显著性（P<0.05）；WB检测发现莪术醇高、中、低浓度对Rho-ROCK信号通路中的关键分子RhoA和ROCK2的表达较模型组有抑制作用，而且这种抑制作用有明显的剂量依赖性，差异有显著性（P<0.05）。结论：莪术醇可以抑制Rho-ROCK信号通路的活动，达到抗肝纤维化的效果。     

木犀草素对肝星状细胞迁移和增殖的影响

目的:研究木犀草素对肝星状细胞迁移的影响。方法:体外培养肝星状T6(HSC-T6)细胞,细胞计数Kit8(CCK-8)法检测0、10、20、40μmol/L木犀草素对HSC-T6细胞增殖的影响;通过划痕实验、Transwell实验观察0、10、20、40μmol/L木犀草素对HSC-T6细胞迁移能力的影响;蛋白印迹法检测木犀草素对细胞外信号调节激酶(ERK)5蛋白磷酸化水平的影响。结果:20、40μmol/L木犀草素能明显抑制HSC-T6细胞的增殖(P<0.05);10、20、40μmol/L木犀草素能明显抑制HSC-T6细胞划痕的修复(P<0.05);10、20、40μmol/L木犀草素能明显抑制HSC-T6细胞穿膜(P<0.05);10、20、40μmol/L木犀草素能明显抑制细胞中由血清诱导的去磷酸化(p)-ERK5表达(P<0.05)。结论:木犀草素呈浓度依赖性抑制HSC-T6细胞的增殖和迁移,其机制可能与抑制ERK5蛋白磷酸化水平有关。     

N1-acetyl substituted pyrrolidine derivative CIP-A5: A novel compound that could ameliorate liver cirrhosis through modulation of hepatic stellate cell activity

(2S,4R)-methyl 1-acetyl-4-(N-(4-bromophenyl)sulfamoyloxy)pyrrolidine-2-carboxylate (CIP-A5) is the N1-acetyl substituted pyrrolidine derivative which was designed against the structure of matrix metalloproteinase (MMP-2) and MMP-9. CIP-A5 has been considered as a candidate compound for treatment of liver cirrhosis. In this study, we evaluated the efficacy of CIP-A5 on the activity of hepatic stellate cells. CIP-A5 prevented the transforming growth factor β (TGF-β)-induced proliferation of hepatic stellate HSC-T6 cells as estimated by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay. CIP-A5 stimulated MMPs activity as evidenced by an increase of degradation of succinylated gelatin. Gelatin zymography analysis showed that CIP-A5 stimulated the secretion and activity of MMP-2 and MMP-9 in HSC-T6 cells. This stimulatory effect on MMPs was verified by the observation of increased expression of MMP-2 and MMP-9 as evaluated by Western blot assay. At the same time, a significant decrease of the expression of tissue inhibitors of matrix metalloproteinases-1 (TIMP-1) was observed, suggesting a modulation of the balance of MMPs/TIMPs in hepatic stellate cells. CIP-A5 treatment also resulted in suppression of the profibrogenic cytokines, such as TGF-β, tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and connective tissue growth factor (CTGF) in HSC-T6 cells. CIP-A5 did not have cytotoxicity to human normal hepatic cells. These results implied that CIP-A5 could selectively ameliorate the process of liver cirrhosis through modulation of activated hepatic stellate cell activity, which offers hope for prevention and treatment of this devastating end-stage liver disease.     

川芎嗪衍生物影响肝星状细胞增殖的作用机制研究

目的研究川芎嗪衍生物H168抑制肝星状细胞(HSC-T6)增殖的机制。方法 MTS比色法观察H168对HSC-T6细胞增殖的影响;流式细胞仪检测H168对细胞周期的影响;应用Western blot和Real time PCR方法观察H168对p21/p27蛋白及mRNA表达的影响。结果 MTS结果显示H168具有明显的抑制HSC-T6增殖的作用,随着药物浓度的增大,对HSC-T6增殖的抑制作用逐渐增强,呈现量效关系。流式细胞周期检测发现H168作用24 h后,G0/G1期细胞增多,S期及G2/M期细胞减少;Western blot结果显示H168通过促进p21/p27蛋白表达抑制细胞的增殖;进一步采用Real timePCR研究发现,H168能够从mRNA水平促进p21/p27表达。结论 H168能抑制HSC-T6细胞的增殖,这主要是通过促进p21/p27蛋白和mRNA的表达而抑制HSC-T6细胞增殖。     

葡萄糖对HepG2细胞酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶2表达的影响

目的 探讨葡萄糖对HepG2细胞酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶2(acyl-CoA:cholesterol acyltransferase2,ACAT2)表达的调节作用及可能机制.方法 用不同浓度的葡萄糖(5.5、12.5、25.0 mmol/L)作用HepG2细胞12 h,RTPCR检测ACAT2和人肝细胞核因子-1α(hepatocyte nuclear factor 1α,HNF1α) mRNA的表达水平.将HNF1α的真核表达质粒瞬时转染HepG2,利用RT-PCR和Western blot检测高表达HNF1α对ACAT2表达的影响.利用凝胶迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)观察葡萄糖对HNF1α结合于ACAT2上游调控序列活性的影响.结果 25.0 mmol/L葡萄糖可上调HepG2细胞HNF1α和ACAT2的转录水平;HepG2细胞内过表达HNF1α可增强ACAT2的表达;高糖组HNF1α与ACAT2上游调控序列的结合活性明显增高.结论 高糖可上调ACAT2的表达,其机制可能与高糖增强了HNF1α与ACAT2上游调控区域的结合活性有关.     

青蒿琥酯抗大鼠免疫性肝纤维化的作用及机制研究

目的研究青蒿琥酯抗实验性肝纤维化的作用及其可能机制。方法制备牛血清白蛋白免疫性大鼠肝纤维化模型。动物随机分为6组:正常对照组、模型对照组、Art组(5、15、45 mg.kg-1)、阳性对照Col组(0.1 mg.kg-1)。Masson染色观察肝组织病理变化,Jamall法测定肝组织中羟脯氨酸(Hyp)的含量,RT-PCR技术检测肝组织转化生长因子β1(TGF-β1),α-肌动蛋白(α-SMA)mRNA的表达。体外培养大鼠肝星状细胞株(HSC-T6),用TGF-β1(5μg.L-1)刺激,与Art(终浓度6.25、25、50 mg.L-1)共培养后,检测HSC-T6中Ⅰ型前胶原(procollagenⅠ)mRNA及Ⅰ型胶原(collagenⅠ)蛋白的表达。结果与模型组相比,Art各组能减轻肝组织纤维增生的程度,降低肝组织Hyp含量,使肝组织α-SMA、TGF-β1 mRNA和HSC-T6中procollagenⅠmRNA和collagenⅠ蛋白的表达水平下降。结论 Art有明显的抗肝纤维化作用,其机制可能与抑制HSC活化,降低TGF-β1 mR-NA及collagenⅠ蛋白的表达有关。