BMP2/Smads通路介导富血小板纤维蛋白对人牙髓干细胞成骨分化的作用研究

目的:基于骨形态发生蛋白2(BMP2)/母亲信号蛋白同源物通路(Smads)通路,分析富血小板纤维蛋白(PRF)对人牙髓干细胞成骨分化的作用.方法:分离纯化牙髓干细胞,流式细胞仪检测并鉴定牙髓干细胞表面抗原标记物,随机分为对照组、PRF组、BMP激活剂组和BMP抑制剂组(简称激活剂组和抑制剂组),检测培养7d、14d后的碱性磷酸酶(ALP)活性;RT-qPCR检测牙髓干细胞胶原蛋白Ⅰ(COL-Ⅰ)、Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨钙素(OCN) mRNA相对表达水平;茜素红染色观察矿化结节形成;Western-Blot检测牙髓干细胞BMP2、Smad1、Smad5、p-Smad1/5、RUNX2蛋白相对表达水平.结果 ..STRO-1、CD29、CD90表达阳性,符合牙髓干细胞的表型.各组ALP活性随时间延长而升高(P＜0.05),从对照组到抑制剂组、PRF组、激活剂组,牙髓干细胞ALP活性及COL-Ⅰ、RUNX2、OCN mRNA相对表达水平依次升高,红色矿化结节数目、A值依次增加(P＜0.05).从抑制剂组到对照组、PRF组、激活剂组,牙髓干细胞BMP2、p-Smad1/5、RUNX2蛋白相对表达水平依次升高(P＜0.05).结论 ..PRF可能通过激活BMP2/Smads信号通路促进人牙髓干细胞成骨分化.     

釉质基质蛋白对乳牙牙髓干细胞体外增殖、分化能力的影响

目的：研究釉质基质蛋白（enamel matrix proteins,EMPs）对人脱落乳牙牙髓干细胞（stem cells from hu—man exfoliated dediduous teeth,SHED）体外增殖分化能力的影响。方法：利用酶消化法联合组织块法获得脱落乳牙牙髓干细胞,并进行形态学观察。三氯乙酸法制备EMPs,用不同浓度的EMPs对SHED进行诱导,利用四唑盐比色法（MTT）检测并分析诱导后的SHED增殖活性的变化,检测经诱导后的培养液中碱性磷酸酶（ALP）。RT—PCR检测牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein,DSPP）及牙本质基质蛋白1（dentin matrix protein1,DMP-1）的mRNA表达。结果：人脱落乳牙牙髓干细胞呈集落生长,并且在体外具有一定的自我增殖能力。EMPs对乳牙牙髓干细胞的增殖无明显影响,而能够显著提高ALP的活性,并呈现一定的剂量依赖性。经EMPs诱导后,细胞相对高表达DSPP、DMP-1mRNA。结论：EMPs对于SHED向成牙本质样分化具有积极作用。     

镁黄长石对乳牙牙髓干细胞增殖和成骨分化的影响

目的:研究山羊乳牙牙髓干细胞在镁黄长石表面黏附、增殖和成骨分化特性。方法:采用酶消法培养山羊乳牙牙髓干细胞。在生长培养液条件下,应用荧光显微镜观察细胞在材料表面的黏附情况,以CCK-8法检测细胞在材料表面的增殖特性;在矿化培养液条件下,以pNPP法检测细胞在材料表面于1、4、7 d碱性磷酸酶(ALP)活性,并通过实时定量PCR检测4、7 d时成骨标志基因ALP、COL I、OPN和OCN的表达。采用SPSS 13.0软件包对数据进行统计学分析。结果:与β-TCP相比,山羊乳牙牙髓干细胞在镁黄长石表面伸展更开,在第4天起增长明显加快,ALP活性在4、7 d更高,镁黄长石组的基因表达水平明显上调,其中OCN表达量在第7天显著增加(P<0.01)。结论:山羊乳牙牙髓干细胞在镁黄长石表面能够良好黏附和增殖。与β-TCP相比,镁黄长石能够促进山羊乳牙牙髓干细胞向成骨方向分化。     

人牙髓干细胞体外成骨向分化的实验研究

目的：探讨人牙髓干细胞在体外成骨向分化潜能。方法：用免疫磁珠法分选人牙髓干细胞并检测其干细胞表面标志物Stro-1、CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105的表达。体外诱导人牙髓干细胞向成骨细胞分化,通过碱性磷酸酶染色和茜素红染色观察成骨诱导后细胞的成骨活性和矿化结节形成情况,通过real-time PCR分析成骨相关基因ALP、col I、RunX2、OC的表达,未成骨诱导细胞作为对照。结果：人牙髓干细胞阳性表达间充质干细胞表面标志物Stro-1、CD29、CD44、CD90、CD105,阴性表达造血干细胞表面标志物CD34、CD45。成骨诱导5d、7d、14d ALP染色阳性,21d茜素红染色仅诱导组可见明显钙结节形成,对照组为阴性。成骨相关基因ALP、RunX2和Col I mRNA在成骨诱导早期高表达,OC mRNA在成骨诱导14d表达开始逐渐升高。结论：经磁珠分选纯化的人牙髓干细胞在成骨诱导条件下可向成骨细胞分化,形成钙盐沉积和矿化结节,ALP、col I、RunX2、OC参与了成骨向分化的过程。     

雌激素对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

目的： 应用17 β-雌二醇（E₂）作用于大鼠骨髓间充质干细胞,研究不同浓度雌激素对细胞增殖、凋亡及成骨分化的影响。方法：原代培养大鼠骨髓间充质干细胞（rat bone mesenchymal stem cells,rBMSCs）,加入0、10^-9和10^-7 mol/L不同浓度E₂,CCK-8及Annexin V/PI双染法检测E₂对细胞增殖与凋亡的影响。分别于成骨诱导后第1、3、5、7、11、14和21天,采用碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性测定、ALP和钙结节染色,以及实时定量PCR等方法检测不同浓度E₂对细胞成骨向分化能力的影响。采用SPSS19.0软件包对数据进行统计学分析。结果：E₂对大鼠骨髓间充质干细胞增殖与凋亡未见明显影响,并能显著提高干细胞的成骨分化能力,浓度为10^-9 mol/L时促进作用最为明显。与对照组相比,加药组细胞ALP活性升高,钙结节形成增多,成骨相关基因（RUNX2、ALP、COL I、OCN）表达显著升高。结论：17 β-雌二醇能促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化,体外浓度为10^-9 mol/L时,作用最为显著。     

神经生长因子对小鼠颌骨骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

目的：研究不同浓度神经生长因子（nerve growth factor,NGF）对外胚层来源的颌骨骨髓间充质干细胞（jaw bone marrow mesenchymal stem cells,JBMMSCs）增殖及成骨分化的影响。方法：原代培养小鼠JBMMSCs并鉴定。然后分四组分别加入含0 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml NGF培养液至第二代JBMMSCs中孵育3天,采用CCK-8检测JBMMSCs增殖,碱性磷酸酶试剂盒、qRT-PCR检测ALP、OCN、BMP2、RUNX2等重要成骨及增殖标记物Ki67、MCM-2的表达,Western blot检测OPN、RUNX2以及Ki67、MCM-2的表达。结果：采用骨片贴壁法原代培养的小鼠JBMMSCs经流式细胞术鉴定,表明成功获取JBMMSCs。CCK-8显示3种浓度的NGF均能促进JBMMSCs增殖,且呈浓度依赖性特点。qRT-PCR结果显示：ALP、OPN、RUNX2、BMP2、Ki67、MCM-2表达水平随浓度的升高而增加,但Ki67、MCM-2表达量在100 ng/ml NGF时下降。Wes...     

用酶消化法进行鼠原代牙髓细胞的体外培养

目的：试用酶消化法获取鼠原代牙髓细胞，并研究其形态和生长特性。方法：采用０．５％胰酶－０．１％ＥＤＴＡ酶消化法获取ＳＤ鼠原代牙髓细胞，在倒置显微镜下观察其细胞形态和生长情况。结果：细胞形态主要呈梭形和星形，在６ｄ时开始增殖，１３ｄ细胞数达最高，细胞倍增时间为５８．５ｈ（６ｄ～１３ｄ）。结论：用胰酶－ＥＤＴＡ酶消化法可在短期内获得大量的牙髓细胞。     

非内皮细胞在血管瘤生长周期中的作用

血管瘤是婴儿和青少年常见的肿瘤,通常情况下血管瘤的生长可分为增殖期、消退期以及消退完成期。目前多种因素都被证实可以导致血管瘤血管内皮细胞的异常增殖,本文从非内皮细胞的角度,总结了近年的研究成果,探讨血管瘤发生发展的机制。     

Mesenchymal stem cells derived from dental tissues

Regeneration of tissues occurs naturally due to the existence of stem cells with the capacity to self-regenerate and differentiate; however, regenerative capacity decreases with age, and in many cases, regeneration is not sufficient to repair the damage produced by degenerative, ischaemic, inflammatory, or tumour-based diseases. In the last decade, advances have been made in the understanding of stem cells, the genes that control the alternative fates of quiescence and differentiation, and the niches that provide specific signals that modulate cell fate decisions. Embryonic stem-cell research is shedding light on the secrets of development. Adult stem cells (AS cells) are available from several sources. Bone marrow and connective tissue have been used in preliminary clinical trials for regenerative therapy. Recently, several types of AS cells have been isolated from teeth, including dental pulp stem cells, stem cells from human exfoliated deciduous teeth, periodontal ligament stem cells, dental follicle progenitor stem cells and stem cells from apical papilla. Preliminary data suggest that these cells have the capacity to differentiate into osteoblasts, adipocytes, chondrocytes and neural cells. If confirmed, these data would support the use of these cells, which are easily obtained from extracted teeth, in dental therapies, including in regenerative endodontics, providing a new therapeutic modality.     

骨骼肌卫星细胞体外培养及分化为成骨样细胞的实验研究

目的:评估骨骼肌卫星细胞(skeletalmusclesatellitecells,SMSCs)体外分化为成骨样细胞的能力,探讨骨骼肌卫星细胞作为骨组织工程种子细胞的可能性。方法:取新生Wistar大鼠骨骼肌,采用酶消化法分离出SMSCs,体外原代及传代培养,经腺病毒介导的人骨形成蛋白2(Ad-BMP2)基因转染后,行成骨细胞标志物活性的检测及细胞化学染色,并进行细胞体外矿化能力的测定。结果:转染后细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性增强(P<0.01)且组织化学染色呈阳性,骨钙素及I型胶原的免疫细胞化学染色呈阳性,21d后见钙结节形成。结论:体外培养的骨骼肌卫星细胞可以向成骨方向转化,有望成为骨组织工程的种子细胞。     

骨髓间质干细胞转染牙本质涎磷蛋白基因的实验研究

目的 评价牙本质涎磷蛋白（DSPP）转基因修饰骨髓问质干细胞（BM-MSC）后，对BM-MSC生物学特性及DSPP表达的影响。方法构建含小鼠DSPP基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）／DSPP，用脂质体介导转染大鼠BM-MSC；RT-PCR检测转染后细胞的Pax-9和DMP-1基因表达情况；检测转染细胞矿化诱导后Von Kossa钙盐染色计算单位面积钙结节形成率。结果成功构建DSPP真核表达载体pcDNA3．1（＋）／DSPP，酶切后得到3．0kb和5．4kb的片段，与回收的目的基因和载体基因片段大小相符；经转染BM-MSC后24h可见DSPP基因表达，48h后可见有Pax-9基因表达，无DMP-1基因表达；转基因后的BM-MSC免疫组化染色显示DSPP阳性；转染细胞矿化诱导后钙结节形成率高于未转染细胞。结论BM-MSC转基因表达DSPP能够增强其矿化能力，并诱导牙齿发育相关基因的表达，提示DSPP可能在牙齿发育早期具有一定作用。     

Antigen-presenting cells in human periodontal disease tissues

T cells are present in the inflammatory infiltrates of periodontal disease lesions and require antigen presentation by antigen-presenting cells (APCs). While it is still not known whether Th1 or Th2 cells predominate in these lesions, it has been reported that different APCs may induce activation of different T-cell subsets. An immunoperoxidase technique was used to investigate the presence of CD1a+, CMRF-44+, CMRF-58+ and CD83+ dendritic cells, CD14+ macrophages or dendritic cell precursors and CD19+ B cells in gingival biopsies from 21 healthy or gingivitis and 25 periodontitis subjects. The samples were divided into three groups according to the size of infiltrate (group 1, small infiltrates; group 2, medium infiltrates; group 3, extensive infiltrates). The presence of numerous CD1a+ Langerhans cells was noted in the epithelium with no differences between the healthy/gingivitis and periodontitis groups. The percentage of CD83+ dendritic cells in the infiltrates was higher than the percentage of CD1a+, CMRF-44+ or CMRF-58+ dendritic cells. Endothelial cells positive for CD83 were found predominantly in areas adjacent to infiltrating cells, CD83+ dendritic cells being noted in the region of CD83+ endothelium. The percentage of CD14+ cells in the inflammatory infiltrates was similar to that of CD83+ dendritic cells. B cells were the predominant APC in group 2 and 3 tissues. The percentage of B cells in group 3 periodontitis lesions was increased in comparison with group 1 periodontitis tissues and also in comparison with group 3 healthy/gingivitis sections. Functional studies are required to determine the roles of different APC subpopulations in periodontal disease.     

人牙髓细胞与牙周韧带细胞多向分化能力的比较

目的 比较人牙髓细胞(dental pulp cells,DPC)和牙周韧带细胞(periodontal ligamentcells,PDLC)的多向分化能力,揭示其干细胞成分特征,为开展干细胞介导的生物牙根再生奠定实验基础.方法 酶消化法分离培养人DPC和PDLC,流式细胞术检测STRO-1的表达.诱导细胞成牙本质及成骨分化、成脂分化和成软骨分化,von Kossa染色、抗骨钙素(osteocalcin,OCN)和牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein,DSP)免疫组化染色、油红O染色、阿新蓝染色、抗Ⅱ型胶原免疫组化染色以及实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)等检测DPC和PDLC的多向分化.结果 DPC和PDLC体外呈克隆样生长,STRO-1阳性率分别是(16.5%±4.2%)和(11.6%±1.1%).100%的DPC和83.3%的PDLC样本可多向分化.细胞诱导分化后,OCN、牙本质涎磷蛋白(dentinsialophosphoprotein,DSPP)、过氧化物酶体激活物增生受体2(peroxisomal proliferator activated receptorgamma 2,PPARγ2)、脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)和Ⅱ型胶原mRNA表达上调,与诱导前相比差异均有统计学意义(P<0.001),DPC和PDLC间OCN和PPARγ2基因上调倍数的差异有统计学意义(P<0.001).结论 人DPC和PDLC的间充质干细胞比例和多向分化能力相似.     

侵袭性牙周炎龈上皮细胞凋亡的研究

目的 观察侵袭性牙周炎龈上皮凋亡细胞形态特征,了解牙周炎发病机理.方法 以24例病变龈上皮组织为研究对象,利用透射电镜观察凋亡细胞的超微形态结构改变,流式细胞术测定分析细胞周期,及免疫细胞与细胞凋亡的关系.结果 凋亡细胞形态学改变分为四型,流式细胞术测试在G1期前出现亚G1期峰,凋亡细胞为19.9%;免疫细胞发生活化.结论 龈上皮细胞确有凋亡细胞存在,凋亡是在免疫细胞活化的基础上诱导进行的,由于细胞凋亡而导致牙周袋加深,形成侵袭性牙周炎.     

体外人牙髓细胞的矿化特性

为探讨体外人牙髓细胞的生物学特性，采用体外细胞连续培养、钙质染色、Ｘ射线能谱分析与透射电镜观察等方法，对体外人恒牙牙髓细胞的矿化特性进行了研究并与人牙龈成纤维细胞（ｈｕｍａｎｇｉｎｇｉｖａｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ＨＧＦｓ）进行了比较。结果表明，人牙髓细胞在体外可以复层生长并形成细胞结节，ＨＧＦｓ则无此能力，牙髓细胞的碱性磷酸酶活性亦较ＨＧＦｓ者高；细胞结节钙质染色呈阳性，结节内钙磷含量明显增高；人牙髓细胞有许多与成牙本质细胞相似的超微结构特征，胞间基质中可见致密晶状小体。结果提示，体外连续培养的人牙髓细胞有向成牙本质细胞分化的可能，这可为研究人牙髓细胞的分化和矿化提供有价值的思路。