人脐带源间充质干细胞的培养及生物学性状

目的 建立从脐带分离培养间充质干细胞的方法,并研究其生物学特性.方法 脐带经剪碎置于?MEM培养基中培养至细胞爬出,细胞生长达80%培养皿底后传代,整个过程用倒置显微镜观察细胞形态,绘制生长曲线,用免疫荧光方法测定细胞免疫表型并研究其冻存及复苏.结果 脐带组织经直接贴壁培养法可培养出成纤维样细胞,免疫表型分析CD44和CD20阳性,冻存复苏后细胞存活率在90%以上,增殖能力强,和未冻存过的传代细胞具有同样的生长特性.结论 脐带组织培养可获得大量间充质干细胞,为间充质干细胞应用于科学研究和临床治疗提供了新的细胞来源.     

人脐带华通氏胶间充质干细胞的分离、培养、鉴定及冻存、复苏

目的：探讨从人脐带华通氏胶（Wharton’s jelly,WJ）中分离、培养、鉴定间充质干细胞（mesenchymal stemcells,MSCs）及其冻存、复苏的方法。方法：采用植块法分离、培养间充质干细胞,流式细胞仪检测P3代细胞免疫表型,鉴定其向成骨、成脂方向诱导分化的能力;将P1细胞冻存6个月后复苏,鉴定复苏后细胞的特性。结果：植块法容易从人脐带华通氏胶中获得间充质干细胞;组织块贴壁后6 d可见组织块周围细胞爬出,原代培养14~18 d细胞融合70%~80%;P3代细胞强烈表达CD73、CD90、CD105,不表达CD14、CD34、CD45、CD79a和HLA-DR;成骨诱导分化后10 d,可见明显钙结节;成脂诱导14 d,有明显的脂滴出现,油红O染色阳性。冻存再复苏细胞活力达80%,细胞免疫表型及成骨、成脂诱导显示与冻存前细胞呈相同的特性。结论：组织块培养法可从人脐带华通氏胶中分离、培养出纯度较高间充质干细胞,冻存、复苏不改变其特性。     

低温冻存对人脂肪间充质干细胞生物学特性的影响

目的: 比较人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,hADSCs)冻存前和复苏后的生物学特性,为今后建立低温干细胞库提供实验支持。方法： 采用0.1%Ⅰ型胶原酶消化法从腹部大网膜脂肪组织中分离hADSCs,体外培养扩增,将处于均一稳定生长状态的第3代hADSCs置于液氮中分别冻存1、3和6个月,复苏后台盼蓝染色检测细胞存活率,采用MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞表面抗原,成脂成骨诱导后鉴定多向分化能力,RT PCR检测成脂特异性基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ-2(peroxisome proliferator activated receptorγ-2,PPARγ-2)和成骨特异性基因骨钙素(osteocalcin,OC)的表达情况。结果： 随冻存时间的延长细胞存活率略有下降,但差异无统计学意义(P＞0.05)。MTT结果显示冻存前后细胞增殖能力均很强。流式细胞检测结果显示冻存前后细胞均高表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166,低表达CD45和HLA-DR。冻存前后hADSCs均具有向脂肪细胞和骨细胞分化潜能,且RT-PCR结果显示,PPARγ-2和骨钙素mRNA的表达冻存前后差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论： 经液氮冻存后的hADSCs具有高存活率,生物学特性保持稳定且仍具有多向分化潜能。     

人脐带间充质干细胞分离培养建立及其生物学特性观察

目的:建立从人的脐带组织中分离和培养脐带间充质干细胞(UC-MSCs)的方法,并探讨UC-MSCs的生物学特性。方法:分别采用原代贴壁培养法和酶消化法(胶原酶Ⅱ和胰酶)分离培养UC-MSCs,瑞氏染色观察细胞形态,流式细胞术检测第3代以后的UC-MSCs表面特异标志物表达,MTT法检测P7细胞增殖情况。UC-MSCs同外周血单个核细胞共培养后,用MTT法测定细胞增殖率,Hoechst与PI双染色,观察UC-MSCs对健康人淋巴细胞增殖的影响。结果:原代贴壁培养法1周左右可见成纤维样细胞从组织块边缘爬出,成簇生长;酶消化法3~5天可见成纤维样细胞均匀生长。传代培养后,UC-MSCs均呈长梭形、旋涡状生长;细胞核大,核仁清晰;免疫表型:CD29阳性率为(95.71±2.23)%,CD31和CD34阳性率分别为(2.47±0.54)%和(3.24±0.34)%;第7代UC-MSCs仍具有较强的分裂增殖能力。UC-MSCs对淋巴细胞的增殖反应具有抑制作用,呈细胞数量剂量依赖性,而淋巴细胞对UC-MSCs的生长未见影响。结论:从人脐带中成功分离培养的细胞具有UC-MSCs生物学特性。     

人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定

目的：探讨人脐带华通胶间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及冻存、复苏的方法。方法收集健康足月新生儿脐带组织,采用组织块贴壁法分离、培养脐带间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面抗原,将细胞冻存3个月后复苏,鉴定复苏后细胞的特性。结果组织块贴壁法获得脐带间充质干细胞成功率高;细胞表面高表达CD29、CD44、CD90和CD105,不表达造血干细胞表型CD34、CD45等;冻存后再复苏细胞活性高达80％～90％。结论组织块贴壁法可以从人脐带华通胶中较好的分离、培养出间充质干细胞,为干细胞移植实验研究和临床治疗提供了理想的细胞来源。     

大鼠脂肪干细胞分离培养及细胞表型的研究

目的：分离、培养和冻存大鼠脂肪干细胞,并对其相关的细胞表型进行研究,为利用脂肪干细胞治疗梗阻性肾病肾纤维化等实验提供依据。方法取大鼠3只,经消毒麻醉,采集其腹股沟处脂肪组织分离培养其中的脂肪干细胞,用相差倒置显微镜观察细胞生长方式及形态变化。取第三代细胞用流式细胞仪作细胞免疫表型的鉴定。冻存复苏后再次检测干细胞生长情况及表型。结果大鼠脂肪组织中含有大量间充质干细胞,原代培养的ASCs呈小圆形或星形,经传代后的脂肪干细胞形态比较均一,呈长梭形,个别略呈多角形、漩涡样生长。其细胞表型为CD29、CD44高表达,CD73、CD105中等程度表达,CD34极低表达。脂肪干细胞经低温冻存3个月,复苏后,生长活力和存活率与冻存前未见明显区别,CD44和CD29检测与冻存前表达率也一致。结论建立了一种脂肪干细胞的有效分离、培养及保存方法,并对其表面标志物进行鉴定,为利用脂肪干细胞进行进一步的实验研究提供了依据。     

成年大鼠神经干细胞的冷冻复苏及生物学特性观察

目的 建立成年大鼠神经干细胞冷冻复苏方法，观察冻存复苏后神经干细胞的活力及生物学特性。方法 采用10％BSA 8％DMSO做冷冻保护剂，于液氮中冻存；采用细胞培养和免疫细胞化学方法观察冻存复苏后细胞的活力、形态、分化能力及特异性抗原表达。结果 不同的冻存时间、细胞代数对冻存后细胞的存活率没有明显影响；冻存复苏的神经干细胞不仅有较高的存活率，而且仍保持其原有的生物学特性。结论 成年大鼠神经干细胞的冻存并不影响其活力及原有的生物学特性。     

人脐带间充质干细胞的培养鉴定及其向神经元细胞分化的研究

目的研究脐带间充质干细胞（UC-MSCs）在体外分离、培养、扩增和鉴定以及向神经元分化的方法.方法 30例符合入选标准的脐带采用贴壁法分离得到UC-MSCs,选用20%FBS血清培养液进行原代培养,再选用10%FBS扩增培养液进行一般传代.用神经分化培养基诱导UC-MSCs向神经细胞分化,在荧光显微镜下观察细胞形态,透射电镜观察UC-MSCs超微结构,用流式细胞仪分析其表面特性,采用直接和间接免疫荧光法检测细胞悬浮液的表型特征,用抗人神经纤维M、突触素、微管蛋白、半乳糖神经酰胺的单克隆抗体检测各代之间神经诱导形成率.结果 12 h后细胞开始贴壁生长,超微结构观察表现出未分化细胞的特征,CD123、CD49、CD29、CD73和CD166均为阳性,免疫荧光检测人UC-MSCs分化成神经细胞.结论 UC-MSCs长期传代培养,生物学特性稳定,具有向神经细胞分化的潜能.     

低温冻存对兔脂肪间充质干细胞部分生物学特性的影响

目的 研究低温冻存对兔脂肪间充质干细胞部分生物学特性的影响。方法 采用组织块法分离培养兔脂肪间充质干细胞。用倒置显微镜观察原代细胞的细胞形态,流式细胞仪检测兔脂肪间充质干细胞的免疫表型。取第3代兔脂肪间充质干细胞置于-196℃液氮保存半年,37℃复苏并传至第7代。实验分为两组,实验组为冻存复苏后传至第7代的兔脂肪间充质干细胞,对照组为未冻存的第7代兔脂肪间充质干细胞,用MTT绘制其生长曲线;添加成脂、成骨诱导液进行诱导,油红O、茜素红染色和碱性磷酸酶活性检测分别进行鉴定。结果 体外培养的兔脂肪间充质干细胞呈梭形纤维样细胞形态,生长力旺盛。流式细胞仪检测显示,第3代兔脂肪间充质干细胞强表达CD44、CD90,阴性表达造血细胞相关的表面标志CD45。两组细胞生长曲线呈典型的“S”形,无统计学差异（P>0.05）;成脂诱导14 d后,油红O染色呈阳性;成骨诱导2周时茜素红染色阳性,ALP表达活性随成骨诱导时间延长不断增加且无统计学差异（P>0.05）。结论 冻存后的兔脂肪间充质干细胞体外生长及多向分化潜能未发生显著变化。     

大体系冻存对细胞因子诱导的杀伤细胞免疫表型及细胞杀伤活性的影响

目的探讨大体系(50 mL)冻存对细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞免疫表型及细胞杀伤活性的影响。方法采集6例健康志愿者的外周血,采用Ficoll法分离得到单个核细胞,用细胞因子诱导培养CIK细胞。收集冻存1个月后复苏的CIK细胞,采用流式细胞术检测其冻存前后的细胞活率和免疫表型;通过与乳腺癌细胞共培养(效靶比10∶1和40∶1)的方法测定其杀伤活性,与新鲜未冻存的细胞杀伤活性进行比较,同时并对不同效靶比冻存前后的细胞杀伤活性进行比较。结果 CIK细胞大体系冻存前平均细胞活率(97.79±1.92)%,显著高于复苏后的(83.61±3.42)%(P<0.05)。复苏后CIK细胞中CD3~+、CD3~+CD4~+、CD3~+CD8~+、CD3~+CD56~+表型CIK细胞所占比例虽较冻存前稍有降低,但差异均无统计学意义(P>0.05)。效靶比10∶1、40∶1时冻存前细胞和复苏后细胞杀伤率比较差异均无统计学意义(P>0.05);效靶比40∶1时冻存前细胞和复苏后细胞杀伤率均显著高于效靶比10∶1时(P<0.05)。结论大体系(50 mL)冻存对于CIK细胞活率虽有影响,但对免疫表型和细胞活性均未影响。     

人脐带间充质干细胞体外分离培养及其生物学特性的研究

目的：研究人脐带间充质干细胞（MSCs）详细的生物学特性,包括其细胞形态、免疫表型、纯度及增殖能力,从而建立稳定的MSCs体外分离培养体系。方法将剔除动静脉及内膜的新鲜人脐带组织剪切成1 mm3小块,用含10％胎牛血清的DM EM／F12培养,得到贴壁细胞。观察贴壁细胞形态,利用CCK‐8试剂盒测定生长曲线,流式细胞术研究特殊细胞表面抗原CD29、CD73、CD90、CD105、CD31、CD14、CD34、CD45、CD11b、HLA‐DR表达,并检测细胞周期。结果体外培养7～10 d后,可见细胞从组织块中游出;细胞主要呈纺锤体样、成纤维细胞样形态;生长曲线显示其增殖能力强;特殊表面抗原 CD29、CD73、CD90、CD105表达强阳性,造血性抗原标志CD31、CD14、CD34、CD45、CD11b、HLA‐DR表达均呈阴性,流式细胞仪周期检测结果显示G0／G1期细胞超过80％。结论利用组织块法可有效获得人脐带 M SCs ,具有高纯度、低成本优点,并在体外较易培养、扩增。     

人脐血间充质干细胞鉴定及用5-氮胞苷诱导后的生物学特性研究

目的探讨脐血间充质干细胞经体外扩增纯化表面CD标志的鉴定及在体外定向分化成心肌样细胞的诱导剂5一氮胞苷（5-aza）作用后的生物学特性。方珐健康妊娠产妇分娩的胎儿脐带血,分离单个核细胞进行培养、传代,取第3代以后细胞用流式细胞仪直接标记分析CD34、CD44、CD90细胞表面标志。10μmmol／L5-aza诱导4周后,进行透视电镜观察,并检测细胞肌球蛋白重链基因的表达。结果体外纯化扩增后的脐血间充质干细胞含有与骨髓来源的间充质干细胞相同的细胞表面标志,第3代以后细胞纯度较高,经5-aza体外诱导培养可形成心肌样细胞。结论脐血间充质干细胞经体外纯化扩增,第3代以后的细胞纯度较高,在体外经5-aza诱导定向分化为心肌样细胞后,其基本的生物学特性未发生改变。     

玻璃化冷冻法保存人类胚胎干细胞

[目的]探讨玻璃化冷冻方法保存人类胚胎干细胞的效率.[方法]冷冻保存人类胚胎干细胞,按冷冻方法的不同分为玻璃化冷冻组和慢速冷冻组,比较两组解冻后人类胚胎干细胞的细胞复苏率、克隆生长与分化情况,并比较分析解冻后的与未经冷冻的胚胎干细胞的生长、分化情况,鉴定解冻后人类胚胎干细胞的全能性.[结果]玻璃化冷冻组与慢速冷冻组解冻后的细胞复苏率分别为81.9%和22.8%(P＜0.001).慢速冷冻组解冻后克隆生长较玻璃化冷冻组缓慢且更易分化.两组未分化的胚胎干细胞继续培养的生长与分化情况一致.玻璃化冷冻组解冻后第6代人类胚胎干细胞染色体核型正常,SSEA-4、SSEA-3阳性,表达OCT-4基因.人类胚胎干细胞来源的畸胎瘤包含了来源于3个胚层的组织细胞.[结论]玻璃化冷冻是保存人类胚胎干细胞的有效方法,解冻后的干细胞在继续培养过程中仍可保持其正常核型和全能性.     

人脐带间充质干细胞的生物学特性及向软骨细胞、骨细胞分化实验研究

目的 研究人脐带华尔通胶来源间充质干细胞的特性及向软骨细胞、骨细胞的分化能力,为椎间盘再生研究寻找新的细胞来源.方法 取人的正常分娩或剖腹产胎儿的脐带,酶消化法从Wharton胶中分离干细胞,应用复合胶原酶NB4、dispaseⅡ和透明质酸的组合混合酶消化,检测人脐带来源的MSCs的细胞表面标记;分别应用成软骨诱导液、成骨诱导液诱导人脐带来源的MSCs向软骨细胞、骨细胞分化.用免疫细胞化学方法对分化和未分化的细胞进行鉴定.结果 人脐带分离培养的贴壁细胞,体外生长形态类似于成纤维细胞,可以维持在未分化状态稳定增殖,这类细胞MSCs的表面标记CD44、CD105、CD90和D73呈现高表达,而不表达CD45、CD34、CD14、CD19及HLA-DR.向软骨细胞、骨细胞诱导结果提示P3代细胞有向终末软骨细胞、骨细胞分化能力,具有干细胞的特性.结论 人脐带华尔通胶含有丰富的MSCs,易于培养扩增.人脐带来源的MSCs能分化为软骨细胞、骨细胞,这类细胞可能成为椎间盘移植的一个干细胞来源.

Abstract：

Objective To investigate the isolation and expansion of mesenchymal stem cells (MSCS) from human umibilical cord Wharton's jelly and their biological identities , and explore the possibility of inducing human umbilical cord-derived MSCS to differentiate into chondrogenic and osteogenic cells. Methods The hUCMSCs were isolated form human umbilical cord by tissue adherence and digested with collagenaseNB4, dispase Ⅱ and hyaluronidase. The morphology, proliferation and immunophenotype of the 3rd passage cells were analyzed, and then the chondrogenic and osteogenic differentiation was tested and evaluated by specific staining methods. cells were induced to chondrogenic and osteogenic differentiation in vitro. Results The isolation of hUCMSCs by digestion with collagenaseNB4, dispase Ⅱ and hyaluronidase was efficient. After seeded for 24 hours, the adherent cells showed spindle shape and fibroblast cell-like shape and the size of hUCMSCs was homogeneous. Flow cytometry analysis revealed that the hUCMSCs were positive for CD44,CD105, CD90, CD73, but were negative for CD45, CD34, CD14, CD19 and HLA-DR.These cells could be induced to differentiate into chondrogenic and osteogenic cells under proper inducing conditions. The hUCMSCs retained the appearance and phenotype even after being expanded more than 40 passages in vitro. Conclusions The human MSCs could be isolated from human umbilical cord Wharton's jelly ,and it was easy to propagate these MSCs. An in vitro method for isolation and purification of hUCMSCs from human umbilical cord has been established. The cultured cells were composed of only undifferentiated cells and their biological properties were stable. The hUCMSCs are expected to be a new type of stem cells of tissue engineering.     

冷冻对人精子氧化应激水平、核DNA损伤的影响

目的 研究冷冻储存对精子形态、氧化应激水平和核DNA损伤的影响.方法 根据WHO的标准(1999年),随机选取正常精液样本、异常精液样本各30例.分别检测精子冷冻前后正常形态率、丙二醛(MDA)浓度和DNA损伤率.结果 ①两组精液精子冷冻前后变化:冷冻后正常精液组中精子正常形态率降低明显,MDA值升高显著(P<0.05);DNA损伤率升高,但差异无统计学意义.而冷冻后异常精液组中精子正常形态率明显降低,MDA值显著升高,DNA损伤率升高(P<0.05);②两组精液之间冷冻损伤的比较:冷冻对异常精液正常形态精子损伤、DNA损伤明显高于正常精液组(P<0.05);③精子正常形态率与MDA浓度呈负相关(r=-0.525),MDA浓度与DNA损伤率呈正相关(r=0.692).结论 冷冻可导致异常精液的正常形态率下降,脂质过氧化损伤、DNA损伤率升高.而在正常精液中则导致精子正常形态率的下降,脂质过氧化损伤的增加.     

人脐带血间充质干细胞的体外培养及影响因素

目的:建立人脐带血的间充质干细胞(MSCs)体外培养、扩增的方法。方法:无菌条件下取正常足月的脐带血,分离单个核细胞,以含5%胎牛血清的低糖DMEM作为培养基进行培养和纯化获得贴壁细胞,测定MSCs的生长曲线,用流式细胞技术分析细胞的表面抗原。结果:脐血中的单个核细胞在适当的条件下分离、培养,获得的MSCs均一稳定地表达相关的抗原标记CD29、CD44、CD105,但不表达CD34、CD45、CD106和HLA-DR。结论:脐带血中含有的MSCs可在体外培养、扩增,能够作为间充质干细胞的一种有效来源。     

腺病毒CD-80基因转导B16-F10细胞的体外生物学特征

目的 探讨含hB7-1基因的重组腺病毒hCD80rAd对B16－F10肿瘤细胞体外生物学特性的影响。方法 以腺病毒为载体，将CD80基因导入B16－F10肿瘤细胞后，以PCR方法检测基因导入，以电镜、FACS等方法观察对其体外生物学特性的影响。结果 重组腺病毒的滴度可达10^10PFU/mL,200MOIs rAd可使95％以上的B16－F10细胞被感染。转染CD80基因后，B16－F10细胞的生长能力、克隆形成能力等均无变化，电镜下，细胞表面结构及胞内超微结构有轻微变化。结论 重组腺病毒hCD80rAd可以有效地将hCD80基因导入肿瘤细胞而不会引起明显的生物学特性改变，制备肿瘤苗是可行的。     

采用不同载体的玻璃化冷冻对人卵巢组织冻存效果的比较研究

目的比较采用不同载体的玻璃化冷冻方案对人卵巢组织的卵泡形态、冻融后体外培养时卵泡生长和激素分泌能力的影响,寻找临床上简便易行且保存效果上佳的人卵巢组织玻璃化冷冻方案。方法将16例患者的卵巢组织切割成皮质小条后随机分配到新鲜组和不同载体玻璃化组,包括冷冻管组、最小微滴组、不锈钢网筛组和固相表面玻璃化组。观察各组卵巢组织卵泡形态;冻融后的卵巢组织行体外培养,比较卵泡生长情况以及培养液中雌二醇和孕酮的浓度。结果冻融后各组原始卵泡正常形态率均低于新鲜组,差异有统计学意义（P〈0.05）。冷冻管组、最小微滴组、不锈钢网筛组和固相表面组,原始卵泡形态正常率分别为（64.57±11.84）%、（78.36±7.62）%、（77.21±6.51）%和（84.70±5.03）%。固相表面组原始卵泡形态正常率明显高于其他玻璃化组（P〈0.05）。体外培养液中雌二醇和孕酮的平均水平随培养时间逐渐升高。固相表面玻璃化组两种激素平均浓度明显高于其他玻璃化组。培养后卵巢组织中原始卵泡所占比例均较新鲜组下降,生长卵泡比例升高。固相表面玻璃化组培养后生长卵泡比例明显高于其他玻璃化组。结论固相表面玻璃化冷冻可以保存大部分原始卵泡的正常形态,并能较好地保存其体外生长和性激素分泌功能。该技术简便易行且冷冻效果好,适合人卵巢组织玻璃化冷冻的临床使用。