结肠癌患者单核或树突状细胞MICA的表达及其与NK细胞活性的关联

目的:观察结肠癌患者单核或树突状细胞是否表达MHCⅠ类相关抗原A(MICA),并分析MICA+单核细胞的频率是否与患者体内NK细胞的活性相关联。方法:首先利用流式细胞仪检测MICA在外周血单核细胞和由单核细胞诱导而来树突状细胞(DCs)上的表达;并用IL-15和IFNα-刺激树突状细胞,观察MICA表达的变化;然后检测患者外周血NKG2D+、CD16+、CD69+NK细胞的频率及NK细胞的杀伤活性;最后分析MICA+单核细胞的频率是否与NK细胞表达NKG2D及其杀伤活性关联。结果:与健康个体相比,结肠癌患者MICA+单核细胞的频率无显著变化。未成熟DCs表达MICA,但受IL-15和IFNα-刺激后,结肠癌来源的DCs表面MICA的表达无显著上调。结肠癌患者外周血NKG2D+、CD69+NK细胞的频率显著降低,NK细胞的杀伤活性显著降低,而CD16+NK细胞的频率无明显变化。结肠癌患者MICA+单核细胞的频率与NK细胞表达NKG2D无明显关联,但与NK细胞杀伤靶细胞时CD107a的表达正相关。结论:结肠癌患者体内单核细胞表达MICA与NK细胞表达NKG2D无关,但高频率MICA阳性的单核细胞与NK细胞的抗肿瘤活性正相关。     

固相MHCI类相关抗原A刺激的NK细胞对树突状细胞活性的影响

目的:观察固相MHCI类相关抗原A(iMICA)刺激的NK细胞对树突状细胞(DCs)活性的影响.方法:首先取新鲜分离及受固相MICA刺激的异体NK细胞,或IL-2、及IL-2联合iMICA刺激的自体NK细胞与未成熟DCs(iDCs)按5:1比例孵育24 h后,用流式细胞术(FCM)分析HLA-DR+或CD86+频率的DCs.然后取自体NK细胞以iMICA刺激后,按1:5的比例与iDCs孵育24 h后,FCM检测DCs上HLA-DR、CD86的表达.最后在NK细胞与DCs的共培养体系中加人抗IFN-γ抗体,观察DCs上HLA-DR、CD86表达的变化.结果:当NK细胞与iDCs孵育比例为5:1时,异体新鲜分离的与自体活化的NK细胞均能杀伤iDCs;而MICA无协同作用.当NK细胞与iDCs孵育的比例为1:5时,iMICA刺激的NK细胞可促进DCs表达HLA-DR和CD86;而加人抗IFN-γ抗体可抑制 NK细胞诱导DCs表面HLA-DR和CD86表达的上调.结论:异体新鲜分离的或自体活化的NK细胞杀伤iDCs时,无需iMICA的刺激;但当NK细胞的数目明显低于iDCs时,iMICA可刺激NK细胞分泌IFN-γ促进DCs成熟.     

固相MHC Ⅰ类相关抗原A刺激的NK细胞对树突状细胞活性的影响

目的:观察固相MHC I类相关抗原A(iMICA)刺激的NK细胞对树突状细胞(DCs)活性的影响。方法:首先取新鲜分离及受固相MICA刺激的异体NK细胞,或IL-2、及IL-2联合iMICA刺激的自体NK细胞与未成熟DCs(iDCs)按5∶1比例孵育24 h后,用流式细胞术(FCM)分析HLA-DR+或CD86+频率的DCs。然后取自体NK细胞以iMICA刺激后,按1∶5的比例与iDCs孵育24 h后,FCM检测DCs上HLA-DR、CD86的表达。最后在NK细胞与DCs的共培养体系中加入抗IFN-γ抗体,观察DCs上HLA-DR、CD86表达的变化。结果:当NK细胞与iDCs孵育比例为5∶1时,异体新鲜分离的与自体活化的NK细胞均能杀伤iDCs;而iMICA无协同作用。当NK细胞与iDCs孵育的比例为1∶5时,iMICA刺激的NK细胞可促进DCs表达HLA-DR和CD86;而加入抗IFN-γ抗体可抑制NK细胞诱导DCs表面HLA-DR和CD86表达的上调。结论:异体新鲜分离的或自体活化的NK细胞杀伤iDCs时,无需iMICA的刺激;但当NK细胞的数目明显低于iDCs时,iMICA可刺激NK细胞分泌IFN-γ促进DCs成熟。     

NKG2D配体的表达直接影响NK细胞对不同发育阶段DC的杀伤

目的:探讨NKG2D配体在不同发育阶段树突状细胞(DC)表面的表达及其对自然杀伤(NK)细胞杀伤活性的影响.方法:用细胞因子(rh IL-4、rhGM-CSF、TNF-α)体外诱导培养单核细胞来源的未成熟树突状细胞(iDC)和成熟树突状细胞(mDC)并鉴定形态和表型,免疫磁珠法分离纯化NK细胞.流式细胞术(FCM)检测iDC和mDC表面NKG2D配体MICA/B、ULBP1-3的表达.用LDH释放法检测NK细胞对iDC和mDC的杀伤活性以及抗NKG2D单克隆抗体(mAb)阻断NK细胞后的杀伤活性.结果:培养的iDC和mDC具有典型的细胞形态和免疫表型特征.iDC表面表达MICA、MICB、ULBP1、ULBP3,表达率分别为(32.39±8.30)%、(17.75±3.40)%、(26.71±6.48)%、(38.37±6.89)%;mDC表面表达MICA 、ULBP3,表达率分别为(7.82±2.67)%、(8.36±2.42)%,比iDC表面相应配体表达率低(P<0.01).各效靶比NK细胞对iDC的杀伤活性均比对mDC的杀伤活性高,差异有统计学意义(P<0.01).抗NKG2D mAb阻断NK细胞后对iDC杀伤活性比阻断前减弱(P<0.05);对mDC的杀伤活性与阻断前相比无统计学意义(P>0.05).结论:NKG2D配体在iDC表面表达高,介导了NK细胞对iDC的杀伤,而对mDC的杀伤无影响,是NK细胞对iDC选择性高杀伤的分子机制之一.     

板蓝根多糖促进NKG2D 配体表达增强NK 细胞对食管癌细胞的杀伤作用及机制研究

目的:研究板蓝根多糖(RIP)影响NK细胞对食管癌细胞杀伤作用的分子机制。方法:MTT法检测细胞增殖率,Western blot检测增殖相关蛋白CyclinD1、p21和p27的表达,ELISA法检测培养上清中IFN-γ和TNF-α的表达,流式细胞术检测NKG2D配体MICA、MICB、ULBP1和ULBP2的表达,钙黄绿素释放法(CARE-LASS)检测NK细胞对食管癌细胞的杀伤率。结果:RIP可促进NK-92细胞增殖,抑制食管癌Eca-109细胞增殖,且具有显著剂量依赖性。食管癌可促进NK细胞中TNF-α和IFN-γ的表达。RIP可促进食管癌细胞Eca-109中NKG2D配体MICA、MICB、ULBP1和ULBP2的表达,促进与食管癌细胞联合作用后NK细胞中TNF-α和IFN-γ表达,提高NK-92细胞对食管癌Eca-109细胞的杀伤活性。结论:RIP通过提高食管癌Eca-109细胞中NKG2D配体表达,促进NK-92细胞中TNF-α和IFN-γ表达,增强NK-92细胞对食管癌细胞的杀伤作用。     

IFN-γ上调的单核细胞表面MHC-I类链相关分子促进NK细胞活化

目的:研究IFN-γ诱导上调表达的单核细胞MHC-I类链相关分子(MICs)分子对NK细胞的活化作用.方法:采用密度梯离离心法分离人外周血单个核细胞(PBMC),以免疫磁珠法从PBMC中特异性分选单核细胞及NK细胞,以细胞因子IFN-γ、TNF-α刺激单核细胞后,再将单核细胞与NK细胞共培养,以流式细胞术(FCM)检测NK细胞表面CD69分子及胞内IFN-γ表达,以51Cr释放试验检测NK细胞对K562细胞的杀伤效应.结果:IFN-γ上调人单核细胞表面MICs表达;IFN-γ刺激的单核细胞能促进异体NK细胞CD69及胞内IFN-γ表达,能增强NK细胞对K562细胞的杀伤效应;单核细胞的这种效应至少部分依赖于IFN-γ上调的MICs分子,因为用抗MIC抗体封闭或用细胞小室阻断细胞接触,可以明显地抑制NK细胞的活化.结论:IFN-γ上调人单核细胞表面MICs分子介导了NK细胞的活化.     

传染性单核细胞增多症患儿NKG2D表达变化初探

目的 观察传染性单核细胞增多症(infectious mononucleosis,IM)患儿自然杀伤(NK)细胞和CD8+T细胞NKG2D表达,探讨导致Epstein-Barr病毒(EBV)感染免疫功能紊乱的可能机制.方法 传染性单核细胞增多症患儿29例,同龄健康对照组25例.流式细胞术检测外周血NK细胞、CD8+T细胞表面激活性受体NKG2D及抑制性受体NKG2A表达,CD14+单核细胞(MC)表面NKG2D配体MHC Ⅰ相关分子A(MICA)与人巨细胞病毒蛋白UL16的结合蛋白1(ULBP-1)表达;酶联免疫吸附试验(EHSA)检测血浆游离MICA (sMICA)、IL-7、IL-12、IL-15、IFN-γ及TGF-β等细胞因子浓度.结果 (1)IM组患儿NK细胞及CD8+T细胞表面NKG2D表达明显低于对照组(P＜0.05),其中3例拟诊EBV-相关噬血细胞综合征(EBV-HLH)患儿表达下调最为显著;(2)IM组患儿CD14+ MC MICA与ULBP-1表达与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05);(3)IM患儿细胞因子IL-15与TGF-β较对照组降低,IL-7、IL-12、IFN-γ及sMICA较对照组升高;(4)IM患儿NK细胞NKG2A表达明显高于对照组(P＜0.05),CD8+T细胞NKG2A表达与对照组相比无明显差异(P＞0.05).结论 EBV感染患儿NK细胞、CD8+T细胞NKG2D表达过度下调可能是导致免疫功能紊乱的原因之一,IL-15及IL-12等细胞因子调控失衡,sMICA血浓度增高等多种因素可能与其NKG2D表达下调有关.     

通过肿瘤致敏的DCs活化的CD8+ T细胞可有效地杀死肿瘤细胞

目的：探索肿瘤裂解物负载的DCs诱导活化的初始T细胞介导细胞免疫及活化的T细胞杀死肿瘤细胞的能力。方法:应用黏附法分离外周血中的淋巴细胞和单核细胞,应用GM-CSF+IL-4刺激单核细胞并诱导为iDCs,然后进行分组，应用相应的细胞因子等刺激iDCs转化为mDCs,其中肿瘤裂解物冲击DCs组:冻融抗原负载+TNF-α+IL-1β; 无肿瘤裂解物冲击组: TNF-α+IL-1β。再分别用上述DCs与淋巴细胞进行混合培养以刺激混合淋巴细胞中的T细胞转化为细胞毒性T细胞, 并进行分组, 肿瘤裂解物冲击DCs组: 肿瘤裂解物冲击DCs+IL-2+IL-7；无肿瘤裂解物冲击DCs组: 无肿瘤裂解物冲击DCs+IL-2+IL-7；对照组: IL-2+IL-7。结果:成功获得iDCs,并高表达CD86、CD80和HLA-DR；相对于其它组，肿瘤裂解物冲击DCs组mDCs更显著上调CD83，且更有效地刺激淋巴细胞增殖； 肿瘤裂解物冲击DCs组的CTLs也高表达CD95(Fas)且TNF-α和IFN-γ的表达水平显著提高(P<0.05)。结论: 肿瘤裂解物冲击DCs可有效促进T细胞活化、增殖；并显著增强相应CTLs的杀死靶细胞的能力，这为发展DCs+CTLs的免疫治疗肿瘤提供了一种新而且简便的生物治疗模式。     

丹参酮ⅡA联合NK细胞杀伤急性髓系白血病细胞的机制研究

目的 探讨丹参酮ⅡA联合自然杀伤（NK）细胞对急性髓系白血病细胞杀伤作用的机制。方法 采用浓度分别为0、8、16、32、64μmol/L的丹参酮ⅡA处理NK细胞和HL-60细胞,用噻唑蓝（MTT）实验检测细胞增殖变化。钙黄绿素-AM释放法检测杀伤率;酶联免疫吸附法（ELISA）法检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)含量;流式细胞术检测NKG2D配体MICA、MICB、ULBP1及ULBP2表达率。结果 丹参酮ⅡA呈剂量效应抑制急性髓系白血病细胞增殖、促进NK细胞增殖,丹参酮ⅡA浓度为32μmol/L增殖率较高。丹参酮ⅡA+NK细胞组的杀伤率较丹参酮ⅡA组、NK细胞组明显增加。丹参酮ⅡA+NK细胞+HL-60细胞组的TNF-α、IFN-γ含量较丹参酮ⅡA+NK细胞组、NK细胞+HL-60细胞组、NK细胞组明显增加;丹参酮ⅡA+NK细胞、NK细胞+HL-60细胞组的TNF-α、IFN-γ含量较NK细胞组明显增加。丹参酮ⅡA+HL-60细胞组的NKG2D配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2表达率较HL-60细胞组明显增加。结论 丹参酮ⅡA联合NK细胞对急性髓系白...     

NK 细胞联合红花多糖对结肠癌细胞的杀伤作用及机制研究

目的:观察自然杀伤细胞(NK)联合红花多糖(SPS)杀伤结肠癌细胞的协同效应并初步探讨作用机制。方法:四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测SPS对结肠癌细胞增殖的影响;钙黄绿素-AM释放法分析NK与SPS对结肠癌细胞的杀伤效率;ELISA及流式细胞术(FCM)分析TNF-α、IFN-γ及NKp46、MICA、MICB、ULBP1的表达水平。结果:SPS对结肠癌细胞的增殖抑制率与作用时间和浓度成正比,促NK细胞增殖的最高阈值浓度为0.625 mg/ml;NK与SPS联合组的杀伤效率及TNF-α/IFN-γ分泌显著高于NK组和SPS组(P0.05);各实验组NK细胞的NKp46、MICA、MICB、ULBP1表达均升高(P0.05)。结论:NK细胞与SPS对体外杀伤结肠癌细胞具有协同作用,其作用机制可能与SPS调控NK细胞TNF-α、IFN-γ分泌及活化性受体和活化性配体表达水平有关。     

人外周血树突状细胞-乳腺癌细胞融合细胞

目的：探讨树突状细胞—肿瘤细胞融合细胞的形态特性，为研制融合细胞疫苗提供形态学依据。方法：将免疫磁珠法分离的人外周血树突状细胞与人乳腺癌细胞株MCF7融合，瑞氏—姬姆萨染色观察；扫描电镜观察树突状细胞、融合细胞的表面超微结构。结果：树突状细胞与MCF细胞按10：1比例融合后，一个乳腺癌细胞可以与一个或多个树突状细胞相融合；扫描电镜下可见分离的树突状细胞表面有突起，树突状细胞/MCF7融合细胞具两种亲代细胞的表面超微结构特点。结论：树突状细胞与人乳腺癌细胞融合后无明显的形态改变。     

小鼠肺癌细胞与树突状细胞融合的研究

目的 使肺癌细胞表达共刺激分子,探讨其作为疫苗的可能性。方法 小鼠骨髓细胞在体外经GM－CSF和TNF－α诱导,使之成为成熟树突状细胞（BmDC)。将其与小鼠Lewis肺癌细胞AL9901融合,并以S－P免疫细胞化学染色法检测融合细胞和BmDC上有关分子的表达。结果 通过GM－CSF和TNF－α诱导获得BmDC,以诱导5d时收获为佳。获得的BmDC能高表达B7－1和CD40分子,与肺癌细胞融合后,获得的融合细胞仍能高表达B7－1和CD40分子。结论 通过将小鼠肺癌细胞与树突状细胞融合,使肺癌细胞获得了BmDC表达的B7－1和CD40分子,从而提高了其免疫原性,为制备肺癌疫苗奠定了基础。     

人脐血单个核细胞向神经细胞分化

目的：观察培养前后人脐血单个核细胞(MNCs)的形态学及免疫反应性变化，探讨其能否向神经细胞的分化及机制。方法：密度梯度离心脐血中单个核细胞，接种并用。EGF和bFGF刺激细胞生长，倒置显微镜下观察培养前后细胞形态变化，并行免疫细胞化学鉴定。结果：培养前脐血MNCs胞体小呈圆形，nestin阳性细胞、AP2阳性细胞散在分布(阳性率为1．5％和3．4％)无GFAP阳性细胞着色。培养14d后，细胞群中相邻细胞突起连成网状；AP2、GFAP染色阳性细胞成片状分布(阳性率33．5％和24．6％)，未见nestin阳性细胞。结论：脐血细胞中可能有多能干细胞，经体外培养后能分化为具有一定形态的神经细胞。     

Diversity of tissue-resident NK cells

Although natural killer (NK) cells were initially named for their spontaneous tumor-killing capacity, their concept has been greatly expanded with more than 40 years of extensive investigation. Currently, NK cells are known as a heterogeneous population of innate lymphoid cell (ILC) family, consisting of different subsets with unique phenotypic and functional features. Recent studies have shown that tissue-resident NK (trNK) cells, which are distinct from conventional NK (cNK) cells, preferentially distribute in non-lymphoid tissues, such as the liver, uterus, salivary gland, and adipose. In this review, we provide a comprehensive overview of the current knowledge about the phenotype, function and development of trNK cells across different tissues and describe the similarities and differences between diverse trNK cells and cNK cells, with a particular focus on the tissue-specific characteristics of different trNK cells.     

人羊膜上皮细胞上清液对人肝癌BEL-7402细胞的体外抗肿瘤作用

目的探讨人羊膜上皮细胞(h AECs)上清液对体外培养的肝癌细胞系BEL-7402细胞迁移、增殖与凋亡的影响。方法 BEL-7402细胞随机分为5组,其中对照组不加h AECs上清液,其余4组加入体积分数分别为6.25%、12.5%、25%和50%的h AECs上清液作用24 h后,通过划痕实验、MTT试验和流式细胞术检测BEL-7402细胞迁移、增殖和凋亡;Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达量。结果 h AECs上清液能剂量依赖性地抑制BEL-7402细胞迁移、增殖并诱导凋亡(P0.05);25%和50%h AECs上清液组BEL-7402细胞caspase-3和caspase-8蛋白的切割片断蛋白定量明显高于对照组(P0.05)。结论 h AECs上清液对体外培养的BEL-7402细胞具有一定的抗肿瘤作用。     

小鼠睾丸支持细胞对大脑皮质细胞的体外营养作用

目的通过观察睾丸支持细胞(SCs)对大脑皮质细胞体外的营养作用,探讨移植的SCs在体内对神经组织营养作用的方式。方法将原代分离的小鼠大脑皮质细胞单独培养(对照组)或与小鼠SCs共培养(实验组),比较两组中神经元、神经干细胞(NSC)及神经胶质细胞的生长情况。结果实验组的神经元数及其突起数、神经元特异性烯醇化酶光密度(P<0.01)和神经胶质细胞数均较对照组高,两组各时期的神经元胞体面积也不相同(P<0.05),实验组于第3天出现NSC的集落形成。结论SCs在体外对大脑皮质的神经元、NSC和神经胶质细胞均有较强的营养作用,在中枢神经系统疾病的细胞移植治疗中将具有很大的应用价值。     

胚胎干细胞向神经细胞诱导分化的研究

胚胎干细胞具有全能性和无限增殖的能力 ,有望成为组织工程和细胞治疗的重要种子细胞来源。如何将胚胎干细胞向特定细胞诱导分化已成为重要的课题。目前已有将胚胎干细胞诱导分化为神经细胞 ,并将其应用于动物模型治疗的报道。这些工作对今后神经系统疾病和损伤的治疗意义重大     

Hepatic progenitor cells, stem cells, and AFP expression in models of liver injury

Adult hepatocytes and liver-cell progenitors play a role in restoring liver tissue after injury. For the study of progenitor cells in liver repair, experimental models included (a) surgical removal of liver tissue by partial hepatectomy; (b) acute injury by carbontetrachloride; (c) acute injury by d-galactosamine (GalN) and N-nitrosomorpholine (NNM); and (d) chemical hepatocarcinogenesis by feeding NNM in low and high doses. Serological and immunohistological detection of alpha-fetoprotein gene expression served to follow pathways of cellular differentiation. Stem cells were not required in models of surgical removal of parenchyma and in carbon tetrachloride intoxication of adult hepatocytes. In contrast, regeneration of liver occurred through biliary epithelial cells in injuries induced by GalN and NNM. These biliary epithelial cells, collectively called oval cells, are most probably derived from the canals of Hering. Proliferating bile duct cells reached a level of differentiation with reactivation of foetal genes and significant alpha-1-fetoprotein (AFP) synthesis signalling a certain degree of retrodifferentiation with potential stemness. Due to the same embryonic origin of bile ducts and hepatocytes, biliary epithelium and its proliferating progeny (oval cells) have a defined role in liver regeneration as a transit and amplification compartment. In their early proliferation stage, oval cells were heavily engaged in DNA synthesis ([3H]thymidine labelling). Pulse-chase experiments during experimental hepatocarcinogenesis exhibited their development into hepatocytes with high risk for transformation and leading to foci of altered hepatocytes. Hepatocellular carcinomas may arise either from proliferating/differentiating oval cells or from adult hepatocytes; both cell types have stem-like properties. AFP-positive and AFP-negative carcinomas occurred in the same liver. They may represent random clonal origin. The heterogeneity of phenotypic marker (AFP) correlated with a process of retrodifferentiation.     

血液细胞重编程为诱导性多能干细胞的研究进展

诱导性多能干细胞（iPSCs)技术能够将已分化的体细胞反转为多能细胞,因其不存在伦理、排斥等问题,在再生医学领域具有广阔的应用前景。尽管已经建立了来源于多种体细胞的诱导性多能干细胞,但是能实际应用于临床、取材便利、诱导安全的供体来源仍然具有局限性。我们从血液细胞作为供体细胞进行重编程的特点、优势及应用等方面进行了综述。     

Magnetic enrichment of antibody-secreting cells

AMino acid polymer antigens have been covalently coupled to sheep erythrocytes (SRBC) and these have been used in the high gradient magnetic separation (HGMS) technique to enrich murine lymph node cells which had specific receptors for antigen. The method was rapid and provided excellent cell recovery including the fraction retained on the HGMS column. The system could be operated to enrich preformed rosettes, or as an affinity column when preloaded with antigen-coupled SRBC. A 10-fold enrichment of plaque-forming cells was observed in either mode. The HGMS system employed a conventional electromagnet and the fractionation procedure required about 30 min for a sample of up to 10(8) cells.