液泡型ATP酶C亚基ATP6V0C在人前列腺癌细胞系中的表达及其意义

目的探讨液泡型ATP酶C亚基ATP6V0C在不同转移潜能人前列腺癌细胞系中的表达及其意义。方法采用半定量RT-PCR、荧光实时定量RT-PCR和Western blot法检测ATP6V0C在人不同转移潜能前列腺癌细胞系PC-3M-1E8、PC-3M(高转移潜能)和PC-3M-2B4、PC-3(低转移潜能)中的表达。结果 ATP6V0C在PC-3M-1E8、PC-3M细胞系中的mRNA及蛋白表达量均明显高于在PC-3M-2B4、PC-3细胞系中的表达,其中,ATP6V0C在PC-3M-1E8中的表达最高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 ATP6V0C在高转移潜能人前列腺癌细胞系中的表达明显高于低转移潜能人前列腺癌细胞系,证明其和肿瘤的转移密切相关,有可能成为判断人前列腺癌侵袭和转移的重要指标及治疗前列腺癌的新靶点。     

鞘糖脂微结构域1相关磷酸化蛋白基因的筛选及其对转移性前列腺癌细胞生物学行为的影响

目的 筛选肿瘤转移相关新基因,探讨鞘精脂微结构域1相关磷酸化蛋白基因(PAG1)转染对人前列腺癌细胞系PC-3M的高转移亚系PC-3M-1E8体外生物学行为的影响.方法 利用PC-3M高转移亚系PC-3M-1E8、低转移亚系PC-3M-284,人肺巨细胞痛细胞系(PG)高转移亚系PG-BE1和低转移亚系PG-LH7 cDNA制作4张基因芯片,筛选出PC-3M和PG高、低转移亚系共同差异表达基因.对在两个转移亚系共同表达下调的PAG1基因做进一步研究,采用即时定量PCR及Western blot验证PAG1在PC-3M细胞系中的表达.构建pcDNA3.0-PAG1真核表达载体,稳定转染PC-3M-1E8细胞.MTT比色实验及软琼脂集落形成实验检测肿瘤细胞体外增殖能力;流式细胞术检测肿瘤细胞周期及凋亡;Matrigel穿膜实验检测肿瘤细胞体外侵袭能力.结果 基因芯片初步筛选出PC-3M高、低转移亚系差异表达基因共327个,上调基因123个,下调基因204个.PG高、低转移亚系差异表达基因共281个,上调基因167个,下调基因114个.PC-3M与PG高转移亚系共同表达下调基因9个、上调基因8个.即时定量PCR及Western blot证实PAG1在PC-3M高转移亚系中表达低于低转移亚系.MTT比色及软琼脂集落形成实验显示转染pcDNA3.0-PAG1组细胞增殖速度明显低于转染空载体组和未转染组(均P<0.05).细胞周期检测转染pcDNA3.0-PAG1组比转染空载体组和未转染组处于G_0～G_1期的细胞百分数明显增加(P<0.05).转染pcDNA3.0-PAG1组与转染空载体组和未转染组相比凋亡细胞百分率无显著差异(P>0.05).体外穿膜侵袭实验结果表明转染pcDNA3.0-PAG1组比转染空载体组和未转染组穿膜细胞数目明显减少,分别为(35.1±4.9)、(127.6±6.6)和(135.0±5.0)个(P<0.05).结论 利用同一母系来源的高、低转移亚系制作基因芯片可以摒除转移无关基因的干扰,筛选出差异表达的肿瘤转移相关基因.PAG1基因稳定转染能抑制人前列腺癌高转移亚系PC-3M-1E8细胞的体外增殖能力和侵袭能力,PAG1基因可能是一个潜在的肿瘤增殖、侵袭和转移的抑制基因.     

A20在前列腺癌细胞中的表达

目的:探讨A20(肿瘤坏死因子可诱导的初级应答基因)在前列腺癌各细胞系中的表达及意义。方法:RT-PCR检测体外培养的前列腺癌细胞PC-3,PC-3M,Du145,LNcap和22RV1中A20 mRNA的表达,Western blot检测A20蛋白质(锌指蛋白A20)的表达。结果:RT-PCR和Western blot检测显示A20在前列腺癌5种细胞系中均表达,但表达水平有差别,在PC-3和PC-3M细胞中A20在mRNA和蛋白质表达水平均显著高于其余3种细胞系(P<0.01)。结论:A20在各前列腺癌细胞系中的表达不尽相同,对A20表达的研究对于下一步研究该基因在前列腺癌发生发展中的作用有重要意义。     

肿瘤转移抑制基因LASS2/TMSG1全长及其截短体对人前列腺癌细胞生物功能的影响

目的构建肿瘤转移抑制基因LASS2/TMSG1全长及其截短体质粒,探讨其对人前列腺癌细胞生长、迁移、侵袭等生物学功能的影响。方法构建LASS2/TMSG1基因全长以及3个截短体的慢病毒质粒(pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro),并将其稳定转染到人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8中,采用Western blot法鉴定稳定转染的效果;然后采用软琼脂集落形成实验、细胞划痕修复试验、Transwell体外侵袭实验等分析LASS2/TMSG1基因全长以及3个截短体对人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8生物学功能的影响。结果 LASS2/TMSG1蛋白和缺失Homeobox(Hox)结构域的截短蛋白,可以有效抑制PC-3M-1E8细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P均0.001);缺失TLC结构域的LASS2/TMSG1蛋白则丧失抑制前列腺癌细胞生长的功能。结论 LASS2/TMSG1蛋白的TLC结构域是抑制前列腺癌细胞生长的关键功能域。     

DNA甲基转移酶在前列腺癌中的表达及其对体外细胞增殖及侵袭能力的影响

目的探讨DNA甲基转移酶(DNMTs)在前列腺癌(PCa)组织及前列腺癌细胞系中的表达情况及其对体外前列腺癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的影响。方法收集24例患者的前列腺组织样本,其中前列腺癌组织样本12例,良性前列腺增生组织样本12例。免疫组织化学染色检测DNMT1、DNMT3b的表达。通过Western blot及RT-qPCR检测前列腺癌细胞系(DU145、PC-3)及人正常前列腺上皮细胞系(RWPE-1)中DNMT1、DNMT3b的表达。采用siRNA分别下调DU145细胞系中DNMT1、DNMT3b表达,检测DU145细胞生物学行为的改变。结果 DNMT1、DNMT3b在前列腺癌组织中的表达高于前列腺增生组织(P0.05)。DNMT1、DNMT3b在DU145、PC-3细胞系中的表达高于RWPE-1细胞系(P0.05),且DNMT1、DNMT3b在DU145中的表达高于PC-3(P0.05)。下调DU145细胞中DNMT1、DNMT3b的表达,可显著抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,减弱细胞迁移及侵袭能力(P0.05),其中DNMT1抑制组效果最显著。结论 DNA甲基转移酶(DNMT1、DNMT3b)在前列腺癌中的表达高于正常前列腺,其中DNMT1对细胞生物学行为影响最显著。     

鞘糖脂微结构域1相关磷酸化蛋白基因影响高转移人前列腺癌细胞体外生物学行为的机制探讨

目的 探讨鞘糖脂微结构域1相关磷酸化蛋白(PAG1)基因对高转移人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8细胞体外生物学行为影响的机制.方法 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导JM109细菌中GST-Raf1-Ras结合域(GST-Raf1-RBD)融合蛋白的表达,其中Raft-RBD能特异性的与活性Ras(GTP-Ras)结合,聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色观察融合蛋白诱导表达结果.GST-pull down实验检测稳定转染PAG1基因、转染空载体及未转染的PC-3M-1E8细胞中活性Ras水平.Western blot检测Ras信号通路相关蛋白表达变化.用异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)耦联的鬼笔环肽标记F-肌动蛋白,激光扫描共聚焦显微镜观察肿瘤细胞形态和细胞内F-肌动蛋白排列变化.收集人前列腺及前列腺腺癌组织标本,通过免疫组织化学PV9000法检测PAG1蛋白的表达.结果 GST-Raft-RBD融合蛋白诱导表达结果显示,经IPTG诱导后在相对分子质量约33 000处出现较亮的GST-Raf1-RBD融合蛋白条带.GST-pull down结果显示PC-3M-1E8细胞稳定转染PAG1基因后,活性Ras蛋白表达明显减少,总Ras蛋白表达无明显变化.Western blot检测结果显示PC-3M-1E8细胞稳定转染PAG1基因后,磷酸化胞外信号调节激酶(ERK)表达明显减少,总ERK表达无明显变化;细胞周期素D1(cyclin D1)表达明显减少;p21WAF1/CIP1蛋白及磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)表达无明显变化.TRITC耦联的鬼笔环肽标记F-肌动蛋白结果显示稳定转染PAG1基因的PC-3M-1E8细胞F-肌动蛋白骨架结构紊乱,丝网状结构不明显,细胞呈长梭形,细胞表面伪足明显较少.免疫组织化学检测结果显示正常前列腺组织PAG1蛋白表达阳性率较高,前列腺腺癌组织中随着Gleason分级的增加,PAG1蛋白表达阳性率降低.结论 PC-3M-1E8细胞中PAG1表达上调能降低Ras活性,抑制ERK活化,进一步抑制cyclin D1的表达而引起细胞周期阻滞,抑制细胞增殖.PAG1表达上调可引起PC-3M-1E8细胞运动、侵袭和转移能力降低.正常前列腺组织中PAG1蛋白表达阳性率较高,前列腺腺癌组织中PAG1蛋白的表达与肿瘤细胞的分化程度及恶性程度相关.     

miR-125b在前列腺癌1E8细胞运动转移中的作用及其分子机制的初步探讨

目的 研究 miR-125b在前列腺癌高低转移潜能细胞中的表达差异及其对高转移细胞株1E8细胞的运动转移中的作用和可能的分子机制.方法 realtime PCR法检测前列腺癌高低转移潜能配对细胞系中 miR-125b的表达差异.通过划痕实验及transwell实验观察1E8细胞及转染 miR-125b 抑制剂及其阴性对照后该细胞运动转移能力的变化.结果 realtime PCR结果显示高转移潜能1E8细胞中miR-125b表达水明显高于低转移潜能2B4细胞;下调miR-125b会减弱1E8细胞的运动转移能力.结论 miR-125b可促进前列腺癌细胞的运动转移能力.     

人肿瘤转移抑制基因TMSG-1单克隆抗体的制备、鉴定及在肿瘤检测中的应用

目的　明确人肿瘤转移抑制基因TMSG- 1蛋白分子量大小和细胞定位,制备和鉴定TMSG- 1单克隆抗体,并探讨其在临床肿瘤标本检测的价值。方法　采用多肽固相合成法 (Fmoc法 )合成 15肽TMSG -1抗原片段,并与匙孔槭血蓝蛋白 (mcKLH)偶联,免疫BALB/C小鼠,采用细胞融合、ELISA法检测和快速有限稀释法筛选和制备单克隆抗体,并应用Western印迹和免疫组织化学ABC法染色进行抗体鉴定和肿瘤检测。结果　筛选出抗TMSG- 1抗体的单克隆杂交瘤细胞系C8,免疫球蛋白亚类测定为IgM。半抗原竞争抑制实验证实该抗体是特异的抗TMSG- 1抗体。Western印迹显示不转移癌细胞亚系 2B4和LH7有明显的相对分子质量为 45 .000蛋白条带,而高转移亚系 1E8和BE1则条带很弱。细胞免疫组织化学染色显示 2B4和LH7强阳性,为细胞膜和细胞质着色;而 1E8和BE1则为阴性。石蜡切片ABC法检测 52例乳腺癌和 41例结肠癌组织中TMSG- 1蛋白表达发现:未转移的癌组织多为中度阳性或强阳性,中度以上阳性率分别为 36% (乳腺癌 )和 52. 4% (结肠癌 );而转移的癌组织多为弱阳性或阴性, 中度以上阳性率分别为 7 .4% (乳腺癌 )和 35% (结肠癌 ),统计学分析表明TMSG 1在未转移癌组织中的表达显著高于转移性癌组织 (P<0 .05)。结论　成功制备了抗人肿瘤转移抑制基     

应用RNA干扰技术研究激素非依赖性高转移潜能前列腺癌细胞中survivin的表达及意义

目的研究 survivin 在激素非依赖性高转移潜能前列腺癌中的表达及其与前列腺癌的生物学行为及侵袭和转移潜能的相关性。方法应用 RNA 干扰技术构建 survivin 真核表达载体,转染人激素非依赖性前列腺癌高转移亚系 PC-3M-1E8细胞系。通过细胞生长曲线、肿瘤细胞裸鼠异种接种、软琼脂集落形成实验检测体内、体外细胞生长能力;流式细胞术检测 survivin RNA 干扰质粒对细胞周期及细胞凋亡的影响,Western blot 检测 caspase3活性片段,观察 survivin 抑制细胞凋亡的情况;Matrigel 穿膜实验检测肿瘤细胞体外侵袭能力。结果稳定转染 survivin RNA 干扰质粒的 PC-3M-1E8细胞中 survivin 的 mRNA 及蛋白水平明显降低,蛋白水平与阴性对照组相比,约下降78%～80%,差异有统计学意义(P<0.01);体外培养细胞生长速度及裸鼠体内肿瘤生长速度均明显减慢,锚着不依赖性生长的能力(软琼脂克隆形成数:14.33±3.51)与阴性对照组(52.33±6.81)及空白对照组(54.00±6.00)相比明显降低(P<0.01);凋亡细胞比例明显增加,空白对照组、阴性对照组及干扰阳性组的凋亡比例分别为5.88±0.99、6.97±1.60、16.40±1.95,干扰阳性组的凋亡比例显著高于对照组(P<0.01),并伴有 caspase3活性片段的表达增加;细胞阻滞在 G_0/G_1期(干扰阳性组、阴性对照组及空白对照组的细胞 G_0/G_1期的比例分别为52.71±1.10、43.59±1.83及43.65±3.44,P<0.05),并在细胞形态学上出现多核巨细胞现象;细胞体外侵袭能力明显降低,干扰阳性组的细胞(38.67±6.59)与阴性对照组(46.07±9.97)及空白对照组(47.87±9.58)相比穿膜细胞数明显减少(P<0.05)。结论 survivin 在激素非依赖性高转移潜能前列腺癌中高表达,并与细胞凋亡、细胞生长及肿瘤侵袭有关。抑制 survivin 的表达可能成为临床治疗激素非依赖性前列腺癌的方法之一。