ImmunoAIF△1-480融合蛋白对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤作用

目的:观察免疫促凋亡分子ImmunoAIF△1-480对HER2阳性肿瘤细胞的杀伤作用.方法:利用PCR的方法将九聚精氨酸编码序列(R9)与AIF C-末端结构域编码区重组, 然后将R9-AIF△1-480基因与pCMV-e23sFv载体重组, 构建免疫促凋亡分子ImmunoAIF△1-480真核表达载体.用脂质体法转染CHO细胞, 经G418筛选, 建立稳定转染的细胞株, 通过RT-PCR、Western blot、流式细胞术(FCM)等方法检测重组基因在转染细胞中的表达及其对HER2阳性肿瘤细胞的特异性杀伤活性.结果:经过酶切鉴定与测序证实, 带有ImmunoAIF△1-480基因的真核表达载体构建成功, 经RT-PCR、Western blot可检测到培养上清中免疫促凋亡基因的表达, 用FCM检测发现融合蛋白ImmunoAIF△1-480对HER2阳性肿瘤细胞SGC-7901和SKBR-3有明显的促凋亡活性, 而对不表达HER2分子的ECV-304细胞几乎没有影响.结论:ImmunoAIF△1-480可以特异性杀伤HER2阳性肿瘤细胞.     

免疫促凋亡蛋白Immuno-caspase-6可选择性杀伤HER2阳性SGC-7901胃癌细胞

目的构建融合白喉毒素转位序列的免疫促凋亡蛋白Immuno-caspase-6的真核表达载体,真核表达纯化该重组蛋白后验证其对人表皮生长因子受体2(HER2)阳性细胞的选择性杀伤活性。方法把Kozak序列与单链抗体e23sfv、白喉毒素的促转位片段白喉毒素弗林蛋白酶识别位点(fdt)、caspase-6以及免疫球蛋白Ig G Fc段基因重组,克隆入真核表达载体pc DNA3.1(+)中,命名为pc DNA3.1(+)-AFC。瞬时转染CHO-S细胞,Western blot法检测上清中目的蛋白的表达;收集培养上清并利用蛋白A纯化柱对目的蛋白进行纯化;流式细胞术验证目的蛋白对HER2阳性SGC-7901细胞的杀伤作用。结果成功构建pc DNA3.1(+)-AFR真核表达载体;瞬时转染悬浮CHO-S细胞后,Western blot法证实目的蛋白可分泌性表达于细胞培养上清中,流式细胞术结果显示纯化后的目的蛋白可以显著促进HER2阳性SGC-7901细胞凋亡。结论真核细胞表达的免疫促凋亡蛋白Immuno-caspase-6可选择性高效杀伤HER2阳性SGC-7901细胞。     

HER2靶向免疫促凋亡蛋白e23sFv-Fdt-tBid原核表达载体构建及其基因工程菌种稳定性的鉴定

目的 构建HER2靶向免疫促凋亡蛋白e23sFv-Fdt-tBid的原核表达载体并鉴定其基因工程菌种稳定性.方法 应用PCR技术以pCMV-e23sFv-Fdt-tBid为模板扩增e23sFv-Fdt-tBid片段,并将其克隆人pET-22b原核表达载体;将该表达载体转化BL21大肠杆菌并挑取表达蛋白较高的克隆菌,划线接种传代50次;通过革兰氏染色方法、扫描电镜形态观察、菌种质粒酶切鉴定及蛋白诱导表达的Western blot分析鉴定e23sFv-Fdt-tBid免疫促凋亡蛋白表达工程菌的稳定性.结果 成功构建pET-22b-e23sFv-Fdt-tBid原核表达载体,并在BL21大肠杆菌中诱导表达;革兰氏染色方法、扫描电镜形态观察、菌种质粒酶切鉴定及Western blot法鉴定结果表明基因工程菌种稳定性良好,可以稳定表达免疫促凋亡蛋白e23sFv-Fdt-tBid.结论 成功构建了HER2靶向免疫促凋亡蛋白原核表达载体,鉴定了表达该免疫促凋亡蛋白的基因工程菌种稳定性,为HER2靶向免疫促凋亡蛋白e23sFv-Fdt-tBid的应用研究奠定了基础.     

NEDD9在神经胶质瘤中的表达及基因沉默对人胶质瘤U251细胞增殖与侵袭的影响

目的研究NEDD9在神经胶质瘤中的表达及NEDD9基因沉默对人胶质瘤U251细胞增殖与侵袭的影响。方法选取手术切除的脑胶质瘤组织36例及正常脑组织10例,采用qRT-PCR和Western blot法检测各组脑组织中NEDD9mRNA和蛋白表达情况,构建靶向NEDD9的shRNA重组慢病毒载体,将慢病毒载体转染U251细胞,应用qRT-PCR与Western blot方法检测NEDD9mRNA与蛋白表达,MTT方法检测转染后U251细胞活力的变化,Transwell实验检测细胞侵袭能力的变化。结果脑胶质瘤组织NEDD9的蛋白与mRNA表达水平显著高于正常脑组织。成功建立了稳定沉默NEDD9基因的U251细胞株,与空白对照组及阴性对照组比较,转染NEDD9-shRNA组U251细胞活力与侵袭能力显著降低(P0.01)。结论 NEDD9可能是治疗胶质瘤U251细胞的潜在靶点。     

慢病毒介导的moesin基因沉默对U251细胞增殖与侵袭的影响

目的探讨慢病毒介导的moesin基因沉默对U251细胞增殖与侵袭的影响。方法构建moesin基因沉默shRNA慢病毒载体并鉴定,将慢病毒表达载体稳定转染人胶质瘤细胞U251后,real time PCR方法与Western blot方法检测U251细胞moesin mRNA与蛋白的表达, MTT方法检测U251细胞增殖情况,Transwell实验检测细胞侵袭能力的改变。结果转染moesin基因沉默shRNA慢病毒载体后,人胶质瘤细胞U251 moesin mRNA和蛋白表达水平均明显降低,结果表明成功建立了稳定沉默moesin基因的U251细胞株。与空白对照组比较,在抑制moesin表达后,U251细胞增殖和侵袭能力也明显下降。结论成功建立了稳定沉默moesin基因的U251细胞株,moesin可能参与U251细胞增殖和侵袭的发病过程。     

慢病毒介导的TLR4基因沉默对U251细胞增殖与迁移的影响

目的探讨慢病毒介导的TLR4基因沉默对U251细胞增殖与迁移的影响。方法构建TLR4基因沉默sh RNA慢病毒载体并鉴定,将慢病毒表达载体稳定转染人胶质瘤细胞U251后,real time PCR方法与Western blot方法检测U251细胞TLR4 m RNA与蛋白的表达,MTT方法检测U251细胞增殖情况,transwell实验检测细胞迁移能力的改变。结果 real time PCR方法与Western blot方法检测结果显示,转染TLR4基因沉默sh RNA慢病毒载体后,人胶质瘤细胞U251 TLR4在m RNA和蛋白水平表达均明显降低,结果表明成功建立了稳定沉默TLR4基因的U251细胞株。与空白对照组比较,在抑制TLR4表达后,U251细胞增殖和迁移能力也明显下降。结论成功建立了稳定沉默TLR4基因的U251细胞株,沉默TLR4基因后U251细胞增殖和迁移能力明显下降。     

Zeste基因增强子同源物2通过调控Wnt/β-catenin信号通路影响脑胶质瘤细胞凋亡

目的:探讨zeste基因增强子同源物2(EZH2)通过调控Wnt/β-catenin信号通路对脑胶质瘤细胞凋亡的影响。方法:以RT-q PCR和Western blot检测胶质瘤U87、H4和U251细胞及正常人脑星形细胞(NHA)中EZH2的表达水平。在H4细胞中转染EZH2 siRNA和siRNA control,MTT测定细胞活力,流式细胞术测定细胞凋亡,分光光度计法检测caspase-3的活性,Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白β-连环蛋白(β-catenin)和下游靶分子c-Myc的蛋白表达。用Wnt/β-catenin信号通路激活剂处理转染EZH2 siRNA的H4细胞,流式细胞术测定细胞凋亡,Western blot测定β-catenin和c-Myc的表达。结果:胶质瘤U87、H4和U251细胞中EZH2的mRNA和蛋白水平均明显高于NHA(P0.05),并且H4细胞中EZH2 mRNA和蛋白水平高于U87和U251细胞(P0.05)。EZH2 siRNA可以明显下调H4细胞中EZH2的mRNA和蛋白水平。EZH2表达下调后的H4细胞从48 h开始细胞活力降低,并且细胞凋亡率也明显升高,细胞中caspase-3活性也明显升高(P0.05),同时EZH2表达下调还可以抑制β-catenin和c-Myc的表达。Wnt/β-catenin信号通路的激活剂可以减少EZH2诱导的H4细胞凋亡,降低细胞中caspase-3的活性。结论:EZH2在脑胶质瘤细胞中过度表达,下调其表达可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活而诱导胶质瘤细胞凋亡。     

MiR-429通过CRKL靶向作用对U87胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的研究miR-429对人U87胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响及可能机制。方法培养人U87胶质瘤细胞,应用LipofectamineLTX试剂将pre-miR-429质粒载体以及anti-miR-429质粒载体分别稳定转染人U87胶质瘤细胞;应用Real-time-PCR验证转染效率;应用CCK-8试剂盒检测miR-429对人U87胶质瘤细胞增殖能力的影响;应用Real-time PCR和Western blot检测人U87胶质瘤细胞中接头蛋白CRKL(v-crk avian sarcoma virus CT10oncogene homolog-like,CRKL)的mRNA和蛋白表达含量变化;将CRKL分别转染至U87胶质瘤细胞和miR-429过表达的U87胶质瘤细胞,应用CCK-8试剂盒检测人U87胶质瘤细胞增殖,应用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化,应用Western blot法检测凋亡相关蛋白caspase-3和Bcl-2的蛋白表达变化。结果与对照组相比,miR-429过表达显著抑制了人U87胶质瘤细胞增殖,明显诱导了凋亡发生,显著降低了CRKLmRNA和蛋白在人U87胶质瘤细胞的表达水平,caspase-3的表达水平显著上调,Bcl-2的表达水平显著降低。CRKL过表达显著增强了人U87胶质瘤细胞增殖能力并且抑制了细胞凋亡,caspase-3的表达水平显著下调,Bcl-2的表达水平显著增强;CRKL过表达有效阻断了miR-429上调caspase-3、降低Bcl-2的作用,有效阻断了miR-429抑制U87胶质瘤细胞增殖和诱导凋亡的作用。结论 MiR-429抑制CRKL从而降低人U87胶质瘤细胞的增殖能力,诱导细胞凋亡。     

以寡聚精氨酸为PTD的嵌合基因的表达及其对HER2阳性SGC-7901胃癌细胞的杀伤作用

目的:构建以寡聚精氨酸(R9)为蛋白质转导结构域的嵌合抗体/caspase-3的真核表达载体,并检测瞬时转染该载体对HER2阳性SGC-7901肿瘤细胞及HER2阴性HeLa肿瘤细胞生长的影响。方法:用PCR法获得融合了R9的活性caspase-3基因片段,并将其克隆入含有HER2单链抗体e23sFv基因的真核表达载体,以脂质体法转染SGC-7901细胞及HeLa细胞,用间接免疫荧光、细胞计数等方法,检测其在两种细胞中的表达及其对两种细胞生长的影响。结果:成功构建了以R9为蛋白质转导结构域的嵌合抗体/caspase-3基因真核表达载体pCMV-e23sFv-R9-casp3,瞬时转染该质粒发现SGC-7901细胞和HeLa细胞均以分泌形式表达e23sFv-R9-casp3蛋白,但SGC-7901细胞生长受到明显抑制,细胞形态发生改变,出现核浓缩等凋亡特征;而HeLa细胞生长未受抑制,细胞形态无明显变化。结论:以分泌形式表达的嵌合蛋白,其HER2抗体部分能够介导靶向识别,R9可以辅助效应分子活化、转位至细胞液,活性caspase-3能高效杀伤细胞。     

MACC1基因在脑胶质瘤中的表达及其对U87细胞凋亡和增殖的影响

目的 探讨MACC1基因与脑胶质瘤的相关性及其表达改变对胶质瘤U87细胞凋亡和增殖能力的影响.方法 荧光定量PCR检测45例脑胶质瘤及相应癌旁组织MACC1基因的表达;设计并合成MACC1基因特异性的siRNA,转染U87细胞;Western blot检测转染后MACCI蛋白的表达;双标流式细胞法检测细胞凋亡;MTT法...     

慢病毒载体介导的E2F-1基因沉默对人胶质瘤U251细胞生物学特征的影响

目的探讨慢病毒载体介导的E2F-1基因沉默对人胶质瘤U251细胞生物学特征的影响。方法构建靶向E2F-1的shRNA重组慢病毒载体,将慢病毒载体转染U251细胞,real-time PCR与Western blot在m RNA与蛋白水平鉴定转染结果,MTT方法检测转染后U251细胞活力的变化,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡的变化,transwell实验检测细胞侵袭能力的变化。结果 real-time PCR方法与Western blot检测结果均表明成功建立了稳定沉默E2F-1基因的U251细胞株。与空白对照组及阴性对照组比较,转染E2F-1-shRNA的U251细胞活力显著降低,细胞周期被阻滞于G0/G1期,细胞凋亡率显著升高,侵袭能力显著降低(P0.01)。结论转染E2F-1-shRNA能够显著降低U251细胞增殖侵袭能力。     

MACC1表达沉默对胶质瘤细胞U87增殖凋亡的影响

目的探讨MACC1基因表达沉默对脑胶质瘤细胞U87增殖凋亡的影响。方法应用RT-PCR和Western blot检测55例不同病理级别胶质瘤标本MACC1表达;转染MACC1siRNA到U87细胞沉默MACC1基因表达,Western blot检测MACC1,Bcl-2/Bax,caspase-3,c-Met蛋白的表达;MTT法检测细胞生长增殖能力;流式细胞术检测细胞周期及凋亡情况。结果MACC1基因在胶质瘤标本组织表达随病理级别升高而增多;MACC1表达沉默后U87生长增殖能力明显下降,细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞凋亡显著增加,MACC1蛋白表达明显下降,Bcl-2/Bax比值降低,caspase-3表达上调,c-Met表达下降。结论下调MACC1表达可促进胶质瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖,MACC1可能成为胶质瘤基因治疗的新靶点。     

RNA干扰沉默Aurora A基因表达对胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰技术抑制人胶质瘤U251细胞中Aurora A基因的表达,研究其对U251细胞增殖及凋亡的影响。 方法 设计并合成特异性针对Aurora A基因的siRNA,转染至U251细胞中,采用RT-PCR和Western blotting检测Aurora A mRNA和蛋白的表达情况,同时利用四甲基偶氮唑盐(MTT)实验和流式细胞仪观察转染后U251细胞增殖抑制率和细胞凋亡,透射电镜观察细胞凋亡超微结构改变。 结果 转染Aurora A siRNA后,U251细胞Aurora A mRNA表达受到抑制(P<0.01),蛋白表达水平降低;U251细胞增殖的抑制率和细胞凋亡率显著增高 (P<0.01),且U251细胞发生了显著的凋亡形态改变。 结论 体外合成的针对Aurora A基因的特异性siRNA成功地抑制了U251细胞中Aurora A基因的表达,并能抑制胶质瘤细胞增殖、促进凋亡,提示Aurora A可能成为胶质瘤基因治疗的新靶点。     

miR-200b通过靶向CRKL抑制胶质瘤U251细胞增殖

目的研究hsa-miR-200b对人U251胶质瘤细胞增殖的影响及相关作用机制。方法将miR-200b过表达和表达沉默质粒分别稳定转染至胶质瘤U251细胞,qRT-PCR验证转染效率,CCK-8法检测U251细胞增殖水平变化,qRTPCR以及Western blot方法检测的CRKL的m RNA和蛋白表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证miR-200b与CRKL基因3’UTR的结合位点。将CRKL过表达和表达沉默质粒载体分别稳定转染至U251胶质瘤细胞,使用CCK-8法检测U251细胞增殖水平变化。分别建立miR-200b和CRKL的稳定双转染U251细胞系,使用CCK-8法检测对各组细胞增殖水平的变化。结果与对照组相比,miR-200b过表达显著抑制胶质瘤U251细胞的增殖并且抑制CRKL在U251胶质瘤细胞的m RNA和蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验验证了miR-200b与CRKL基因3’UTR的结合位点;CRKL过表达显著增强胶质瘤U251细胞增殖能力;CRKL过表达有效阻断了miR-200b抑制胶质瘤U251细胞增殖的作用。结论 miR-200b能够通过靶向下调CRKL抑制胶质瘤U251细胞增殖。     

乙酰辅酶A羧化酶1对胶质瘤细胞系U87细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的 探讨乙酰辅酶A羧化酶1（ACC1）对人胶质瘤细胞系U87细胞增殖、迁移及侵袭的作用。 方法 Western blotting检测人胶质瘤细胞系U87、U251及U373中ACC1的表达;构建ACC1过表达质粒载体,将过表达ACC1质粒载体瞬时转染至U87细胞中;Western blotting检测转染后U87细胞中ACC1表达情况;MTT实验检测过表达ACC1对U87细胞增殖的影响;Transwell迁移和侵袭实验分别检测过表达ACC1对U87细胞迁移和侵袭的影响;划痕实验检测过表达ACC1对U87细胞划痕愈合能力的影响;Western blotting检测相关蛋白表达变化。 结果 与人胶质瘤细胞系U251和U373相比,U87细胞中ACC1表达较低;ACC1过表达抑制U87细胞增殖（P<0.01）;ACC1过表达抑制U87细胞迁移、侵袭和划痕愈合能力（P<0.01）;ACC1过表达迁移和侵袭相关蛋白波形蛋白(vimentin)、纤维连接蛋白(fibronectin)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)表达下调（P<0.01）,凋亡抑制蛋白Bcl-2和细胞周期蛋白(cyclin) B、cyclin D表达下调（P<0.01）,p-STAT3蛋白表达下调（P<0.01）,细胞周期蛋白P21表达上调（P<0.01）。 结论 过表达ACC1可能通过抑制STAT3活性,抑制人胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。     

缺氧诱导因子通过FOXC1促进脑胶质瘤细胞侵袭

目的:探究在缺氧情况下,缺氧诱导因子(HIF)能否改变胶质瘤细胞内叉头框蛋白C1(FOXC1)的表达水平,并对胶质瘤细胞的侵袭产生影响。方法:通过RT-qPCR和Western blot实验检测正常氧条件及缺氧条件下胶质瘤细胞系U87和U251中FOXC1的mRNA和蛋白表达水平以及HIF-1α和HIF-2α的蛋白水平变化。缺氧情况下,在胶质瘤U87和U251细胞系中分别转染HIF-1αsiRNA和HIF-2αsiRNA,通过Western blot检测转染HIF-1αsiRNA和HIF-2αsiRNA后U87和U251细胞中FOXC1的蛋白水平变化。体外Transwell实验比较正常氧条件和缺氧情况下U87细胞和U251细胞的侵袭能力,检测转染FOXC1 siRNA后胶质瘤细胞系U87和U251侵袭能力改变及与侵袭能力相关标志蛋白(N-cadherin、E-cadherin和vimentin)的表达水平。结果:缺氧条件下,FOXC1的mRNA和蛋白表达明显升高,HIF-1α和HIF-2α的蛋白水平也明显升高,并随缺氧程度的增加而升高(P0.05);缺氧情况下,将HIF-1αsiRNA转染至胶质瘤细胞系U87和U251后,发现细胞系中FOXC1的蛋白表达水平较阴性对照组无明显变化;转染HIF-2αsiRNA后,U87细胞系和U251细胞系中FOXC1的蛋白表达水平较阴性对照组明显降低(P0.05);缺氧条件下,胶质瘤细胞系U87和U251的侵袭能力较正常氧条件下强(P0.05)。但转染FOXC1 siRNA后,U87和U251细胞的侵袭能力较阴性对照组明显减弱,且侵袭相关标志蛋白N-cadherin和vimentin的表达降低,Ecadherin的表达升高(P0.05)。结论:缺氧情况下,HIF-2α通过升高FOXC1的表达,进而增强恶性胶质瘤细胞的侵袭能力。     

肾上腺素对U251细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨肾上腺素对人胶质瘤细胞系U251细胞增殖、凋亡、周期的作用。方法:应用RT-PCR方法检测U251细胞中β-肾上腺素能受体(β-AR) mRNA的表达。MTT法检测肾上腺素对U251细胞增殖的影响;克隆形成实验检测肾上腺素对U251细胞克隆形成的影响; Annexin V-FITC/PI检测肾上腺素对U251细胞凋亡的影响;流式细胞术检测肾上腺素对U251细胞周期的影响; Western Blot检测周期、凋亡和自噬相关蛋白表达变化。结果:人胶质瘤细胞U251表达β-AR;肾上腺素以浓度依赖性的方式抑制U251细胞增殖(P 0. 05);肾上腺素抑制U251细胞的克隆形成(P 0. 05);流式结果显示,随着肾上腺素浓度的增加,细胞的凋亡率明显增加(P 0. 05),G_0/G_1期细胞比例显著增加(P 0. 05),G_2/M期细胞比例下降(P 0. 05);肾上腺素处理U251细胞48 h,细胞周期蛋白Cyclin D表达下调,促凋亡蛋白Bax表达上调,自噬相关蛋白LC3-II/LC3-I比值升高。结论:肾上腺素可能通过激活细胞自噬抑制人胶质瘤细胞的增殖,使细胞阻滞在G_0/G_1期。     

HER2靶向免疫促凋亡蛋白e23sFv-Fdt-tBid真核表达载体的构建及其稳定表达细胞株的建立

目的:构建HER2靶向免疫促凋亡蛋白e23sFv-Fdt-tBid真核表达载体,并运用Flp-InTM定点整合表达系统建立稳定表达该细胞的CHO工程细胞株。方法:应用PCR技术以pcMV-e23sFv-Fdt-tBid为模板扩增e23sFv-Fdt-tBid片段,并将其克隆入pcDNA5/FRT载体中;通过Flp-InTM定点整合表达系统将e23sFv-Fdt-tBid整合入Flp-lnTM CHO细胞的基因组中一个单拷贝位点上,以适当的潮霉素B筛选定点整合e23sFv-Fdt-tBid cDNA的细胞克隆;通过基因组PCR技术和Westernblot技术检测e23sFv-Fdt-tBid基因的整合及该蛋白表达。结果:成功构建了pcDNA5/FRT-e23sFv-Fdt-tBid表达载体;成功通过Flp-InTM定点整合表达系统建立稳定表达e23sFv-Fdt-tBid蛋白的CHO工程细胞株;成功通过基因组PCR技术及基因组PCR技术和Western blot技术检测了e23sFv-Fdt-tBid基因的整合及该蛋白表达。结论:成功地构建了HER2靶向免疫促凋亡蛋白e23sFv-Fdt-tBid真核表达载体并建立了稳定表达该蛋白的CHO工程细胞株,为该蛋白的应用研究奠定了重要基础。     

Sorcin的表达影响人胶质瘤细胞对顺铂的敏感性

 目的： 研究可溶性耐药相关钙结合蛋白(sorcin)在人胶质瘤细胞对顺铂敏感性中的作用。方法：构建pSilencerTM 3.1-H1-sorcin siRNA表达质粒;质粒转染人胶质瘤U251细胞;RT-PCR和Western blotting法检测sorcin mRNA和蛋白表达的变化;MTT法检测U251细胞的生存率;Western blotting检测耐药相关蛋白的表达变化。结果：经酶切和测序鉴定,成功构建pSilencerTM3.1-H1-sorcin siRNA表达载体;将该表达载体转染U251细胞,RT-PCR和Western blotting结果显示sorcin mRNA和蛋白表达量降低（P<0.05）;MTT结果显示,抑制sorcin表达可增强U251细胞对顺铂的敏感性（P< 0.05）;同时发现抑制U251细胞的sorcin表达能降低耐药相关蛋白P-糖蛋白(P-gp)和多药耐药相关蛋白1(MRP1)的蛋白水平（P< 0.05）。结论：抑制sorcin表达增强U251细胞对顺铂的敏感性,其作用机制可能与降低耐药相关蛋白P-gp和MRP1的表达有关,提示sorcin可能与胶质瘤细胞顺铂耐药有关。     

livinβ-siRNA表达载体的构建及其在人星形胶质瘤细胞中的稳定表达

目的构建livinβ-siRNA表达载体,并观察其在人星形胶质瘤细胞(U251)中对livinβ基因表达的抑制。方法根据livinβ序列设计2条livinβ-siRNA特异性序列,PCR扩增方法合成2条siRNA链,与质粒pGenesil-11重组构建livinβ-siRNA表达载体,脂质体法转染人星形胶质瘤细胞(U251),RT-PCR和Western blot检测细胞中livinβ基因及蛋白表达。结果对重组质粒的双酶切鉴定和测序结果证明,livinβ-siRNA表达载体pGenesil-11-livinβ-siRNA构建成功;RT-PCR检测转染组细胞中livinβmRNA表达水平明显低于对照组及空载体组,Western blot检测转染组细胞中livin蛋白表达水平明显低于对照组及空载体组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论本实验成功构建了livinβ-siRNA表达载体pGenesil-11-livinβ-siRNA,并且该载体能在真核细胞人星形胶质瘤细胞(U251)中稳定表达,并能抑制livinβ基因表达。