从半合成噬菌体抗体库筛选抗角蛋白人抗体

目的;从半合成噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白抗体并进行鉴定。方法：经表皮角蛋白为抗原,通过吸附－洗脱－扩增过程从半合成噬菌体抗体库中筛选特异性抗角蛋白抗体。用ＥＬＩＳＡ和ＤＮＡ指纹分析对所获抗体进行鉴定。结果：经过４轮筛选,获得２０个能与角蛋白结合的阳性克隆,其中可产生特异性抗蛋白抗体的克隆１８个。经ＤＮＡ指纹分析,判定所获克隆分别包含４个不同的Ｆａｂ段基因。     

人源性抗核抗体Fab片段噬菌体抗体库的构建

目的 构建人源性抗核抗体(ANA)Fab片段噬菌体抗体库.方法 从4名ANA滴度大于1∶10 000的自身免疫病患者外周血淋巴细胞中抽提总RNA,用RT-PCR技术扩增免疫球蛋白分子轻链κ、λ基因及重链Fd基因.将轻链基因片段克隆入pComb3Hss载体以构建轻链文库,随后将重链基因载入κ/λ-pComb3Hss载体,形成κ/λ-Fd-pComb3Hss质粒,然后将重组质粒转化大肠杆菌XL1-Blue.用辅助噬菌体M13 KO7感染XL1-Blue,随机的重组抗体文库即表达于丝状噬菌体表面.结果 扩增了长度为660bp的轻链κ、λ基因及重链Fd基因,并成功构建了库容为2×104的轻链基因抗体库和库容为4×104的人Fab抗体库,获得了噬菌体滴度为2×109CFU/ml的富含人源性抗核抗体Fab片段的噬菌体抗体库.结论 成功构建了人源性抗核抗体Fab片段噬菌体抗体库,为人源性抗核抗体Fab片段的制备以及进一步评价其在肿瘤免疫靶向治疗中的作用奠定了基础.     

从人源大容量噬菌体抗体库中筛选抗生存素抗体

目的从大容量天然噬菌体抗体库中筛选抗生存素(survivin)的人源单链抗体(single chainfragment variable,scFv)并进行鉴定。方法以survivin为抗原,固化在抗原管上,通过吸附—洗脱—扩增过程,从大容量天然噬菌体抗体库中筛选特异性噬菌体抗体,并转染HB2151菌,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导制备成可溶性抗体,采用酶联免疫吸附测定法对其抗原结合活性进行检测,指纹图谱分析法分析抗体基因的种类。结果经过4轮筛选,共获得21个与survivin结合的阳性克隆,其中10个特异性结合的克隆,指纹分析有8种不同的抗survivin的scFv基因,在这8种中有5种获得可溶性表达。结论利用噬菌体抗体库技术获得了特异性的人源抗生存素抗体,为其在今后肿瘤治疗中的应用奠定基础。     

全合成人源性噬菌体抗体库的构建

目的:构建全合成人源性噬菌体抗体库。方法:选择部分使用频率较高的人抗体胚系基因家族的框架区基因进行人工合成,同时人工设计合成半随机CDR3,通过重叠拼接延伸PCR的方法合成抗体基因。然后利用限制性内切酶SfiⅠ、NotⅠ分别双酶切抗体基因和噬菌体展示载体。连接后的重组噬粒通过电击转化的方法转入大肠杆菌TG1,构建抗体库。结果与结论:PCR结果显示,通过优化后的方法能在保证抗体库多样性的前提下,高效地获得抗体基因。经过数十次电击转化构建了库容量为2×109的全合成抗体库,菌落PCR、测序及筛选结果表明,抗体库质量优良,为筛选人源性治疗抗体奠定了基础。     

人源性脑胶质瘤噬菌体抗体库的构建

为构建人源性脑胶质瘤噬菌体抗体库 ,从脑胶质瘤患者外周血淋巴细胞 (PBL)中提取细胞总RNA ,经逆转录后用套式PCR分别扩增抗体轻链Vκ和重链VH基因。先构建Vκ基因库 ,并使连接Vκ和VH基因的linker与Vκ基因连接 ,再将VH基因克隆入Vκ基因库 ,即构建成功单链抗体 (ScFv)库。随机挑取菌落鉴定 ,测序表明从PBL中扩增出人源性Vκ和VH基因 ,并构建了库容量约为 2× 10 6的ScFv噬菌体抗体库。随机挑取克隆的测序表明 ,测定的VH基因与Kabat的抗体基因库中人抗体VH基因有较高的同源性 ,证明所克隆的基因属人抗体可变区基因。结果表明实验构建成人源性脑胶质瘤噬菌体抗体库 ,为进一步筛选人源性抗脑胶质瘤抗体奠定了基础     

抗体库技术中辅助噬菌体的研究进展

噬菌体抗体库作为噬菌体展示和抗体库2种技术的集合体,可以不需经过免疫而直接获取各种人源抗体,目前已广泛应用于生物学及医学等领域.在通常使用的噬菌粒系统中,使用野生型辅助噬菌体会导致"噬菌体污染",使得仅有很少部分子代噬菌体带有抗体片段,这对抗体库的筛选工作非常不利.近年来,研究人员通过对噬菌体衣壳蛋白基因(g3)部分缺失、引入琥珀突变、构建新型辅助噬菌体或辅助质粒等策略,不仅有效避免了辅助噬菌体污染问题,使抗体展示效率提高了5～20倍,进而通过增加单价抗体展示在每个噬菌体表面,使抗原结合能力提高400倍,并且在第二轮筛选中即可得到有效富集(阳性克隆率超过50%).本文综述了近年来应用在噬菌体抗体库的一些新型的辅助感染系统.     

大容量天然噬菌体抗体库的建立及多样性初步验证

目的:构建超大容量天然噬菌体抗体库.方法:从正常人外周血和新生儿脐血中分离淋巴细胞(>180份),提取RNA,用RT-PCR分别扩增抗体可变区轻重链基因(VH和VL),通过重叠PCR技术将VH和VL连接为单链抗体ScFv形式,克隆插入到pDF噬菌粒载体,转化XL1-Blue细菌得到ScFv初级抗体库,并以高感染复数(MOI≥100)感染Cre 菌株BS1365,利用Cre/LoxP位点特异性重组原理,使VH和VL基因定向同源重组匹配,随后以低感染复数(MOI<1)感染XL1-Blue,获取次级工作库.分别用5种不同抗原进行筛选,所获阳性克隆送测序以获取抗体基因.结果:抗体V区基因得到有效扩增,初级库库容3.6×107,工作库容1.8×1011,5种不同抗原筛选均得到特异性结合噬菌体抗体;测序结果表明,所获取抗体涵盖了不同的基因亚群,进一步证明抗体库具有良好的多样性.结论:经Cre/Loxp定位重组系统成功构建了超大容量天然噬菌体抗体库,初步尝试对5种抗原进行筛选均获成功,提示该抗体库多样性较好,可用于制备人源抗体.     

用抗体捕获法从噬菌体肽库中筛选志贺毒素B亚基结？…

避免生物毒化对志贺毒素Ｂ亚基结构的功能和生物学活性的影响，从呼菌体肽库中筛选与志贺毒素Ｂ亚基结合的短肽分子。方法采用抗体捕获法。结果：经过四轮筛选，ＥＬＩＳＡ结果表明，与ＳｔｘＢ 噬菌体得到了有效富集在８６个随机挑选的克隆中，４９个与ＳｔｘＢ     

噬菌体抗体库技术的研究进展

噬菌体抗体库（ｐｈａｇｅａｎｔｉｂｏｄｙｌｉｂｒａｙ）是将人抗体基因与噬菌粒载体相连，在细菌体内表达而制备人全套抗体（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）。利用抗体库技术可制备人源单克隆抗体，这是目前生物技术领域中的一项重要的新技术。该文综述了其产生，发展和前景。     

人源抗HBsAg噬菌体抗体的筛选、鉴定及基因序列分析

目的筛选与鉴定人源抗乙肝表面抗原(HBsAg)噬菌体抗体,并对其进行基因序列分析。方法利用噬菌体表面递呈技术,从人的外周淋巴细胞中分离和扩增抗体基因,构建抗体组合文库,经亲和淘洗从该文库中筛选人源抗HBsAg噬菌体抗体,通过ELISA及竞争抑制实验鉴定其活性和特异性,并分析获得的抗HBsAg人源抗体重链和轻链基因序列。结果从第3轮淘洗洗脱下来的噬菌体感染细菌长出的菌落中挑出30个,进行ELISA检测,取A490值最高(1.47±0.08)的一株进行竞争抑制试验,结果A490为0.35±0.10,抑制率为76%,所筛出的噬菌体抗体为HBsAg的特异性抗体,酶切分析显示其包含重链和轻链基因,序列分析表明重链可变区(VH)属人免疫球蛋白VHⅠ亚群,轻链可变区(VL)属于VκⅠ和VκⅢ亚群。结论从所构建的抗体库中,筛选出能特异结合HBsAg的抗HBsAg噬菌体抗体,说明通过噬菌体抗体库筛选人源抗HBsAg噬菌体抗体在技术上是可行的,这为抗HBsAg基因工程抗体的应用以及设计针对乙型肝炎的新型靶向治疗策略奠定了基础。     

启动子控制严密性对抗体库多样性影响的研究

目的：比较阿拉伯糖（arabinose,Ara)启动子和Lac启动子的控制严密性,探讨启动子控制严密性对抗体库多样性的影响,寻找适合构建抗体库的启动子。方法：（1）以Ara启动子和Lac启动子驱动抗HBS、TNF－α及角蛋白的人Fab段,比较其本底表达。（2）比较两种启动子表达载体对宿主菌生长的影响。（3）观察两种启动子在抗体库扩增过程中对含有抗体基因的克隆重组率的影响。结果：证实（1）本底表达在Lac启动子载体远高于Ara启动子载体;（2）经相应诱导物诱导后二者表达水平相似。（3）相同条件下,含有Lac启动子的抗体表达载体的细菌与Ara启动子相比处于生长劣势。（4）在抗体库扩增过程中,含Lac启动子的抗体库中抗体基因克隆的重组率逐步下降,而使用Ara启动子基本无变化。结论：启动子控制严密性差会导致抗体克隆重组率下降而影响抗体库的多样性,Ara启动子更适合于构建噬菌体抗体库。     

基因工程技术制备抗IL-2蛋白抗体Fab片段及其鉴定方法的建立

目的利用基因工程技术制备人源性抗IL-2蛋白的可溶性Fab抗体片段,并鉴定其抗原结合活性及特异性。方法用固相化的IL-2蛋白从人天然噬菌体抗体库中筛选出表达抗IL-2蛋白Fab抗体片段的阳性克隆,酶切及连接反应构建可溶性表达噬菌粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE鉴定抗体表达情况、ELISA鉴定其抗原结合活性和特异性。结果成功筛选并表达了抗IL-2蛋白的Fab段抗体,在SDS-PAGE中形成47kD的条带,Western blot证明为抗人Fab段抗体;ELISA证实该抗体片段具有良好的抗原特异性和抗原结合活性,与牛血清白蛋白、IL-4无交叉反应。结论成功表达并鉴定了人源性抗IL-2蛋白的可溶性Fab片段,构建了一种制备基因工程抗体的有效途径,为基因工程抗体在肿瘤免疫治疗方面的临床应用研究奠定了基础。     

抗HBsAg-碱性磷酸酶双功能抗体融合蛋白分子的构建

为构建带有碱性磷酸酶活性的双功能基因工程抗体,我们将已克隆的大肠杆菌碱性磷酸酶基因重组到抗ＨＢｓＡｇ Ｆａｂ段的Ｆｄ羧基端,构建了重组融合蛋白表达载体ｐＨＢＦＡＰ,转化大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ,经ＩＰＴＧ诱导表达后,采用ＥＬＩＳＡ法检测到培养上清中存在与ＨＢｓＡｇ的结合活性和碱性磷酸酶的催化活性,显示抗ＨＢｓＡｇ－碱性磷酸酶双功能抗体分子在大肠杆菌中获得了表达。     

A型肉毒神经毒素轻链人源性抗体的筛选、表达与检测

目的 从全合成人源性噬菌体单链抗体库中筛选抗A型肉毒神经毒素轻链(BoNT/A LC)特异性单抗,并进行全抗的表达、纯化与鉴定.方法 根据大肠杆菌密码子偏好性优化并合成BoNT/A LC序列,克隆至pTIG质粒,转化BL21(DE3) plysS感受态细胞,IPTG诱导表达后Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白.利用纯化的轻链蛋白从噬菌体抗体库中经“吸附-洗脱-扩增”程序淘选富集抗体并进行特异性筛选.PCR扩增抗体轻重链可变区分别连入L293-CL和H293载体,瞬时共转染293-F细胞,培养上清经Protein A柱纯化,通过SDS-PAGE、Western印迹和ELISA检测抗体纯度和特异性.结果 可溶性表达的BoNT/A LC占全菌蛋白的36.8％,纯化后蛋白纯度达99％.从噬菌体抗体库中筛选到10株单抗,选择其中特异性最好的两株单抗Lab1、Lab2制备了全抗,Western印迹和ELISA检测结果显示其可特异性识别结合BoNT/A LC蛋白.结论 该研究得到了两株特异性的BoNT/A LC抗体,可能用于A型肉毒毒素检测和肉毒中毒治疗.     

基孔肯雅病毒中和表位的筛选及表达

目的:寻找基孔肯雅病毒中和表位,并将其表达为重组融合蛋白.方法:对噬菌体展示12肽库进行了生物淘洗,随机挑取噬菌体克隆,使用 ELISA方法筛选并鉴定阳性克隆,分析阳性克隆的DNA序列,将其翻译成氨基酸序列进行同源性比较.将其中一个表位连同M13噬菌体PⅢ蛋白结构域Ⅰ～Ⅱ的编码序列用PCR技术扩增后插入原核表达载体pQE30,用IPTG诱导融合蛋白表达.结果与结论:从经过3轮淘洗的噬菌体中随机挑选123个克隆,从中筛选到20个阳性克隆,其中包含7种不同的氨基酸序列,这些序列缺乏同源性,表明该单抗表位应为构象型表位.在室温培养条件下成功地在大肠杆菌周质腔表达了一种可溶性的表位融合蛋白,经亲和层析得到了纯化的表位融合蛋白.     

大肠癌P~(53)蛋白测定与临床生物学意义的相关研究

目的　探讨P53 蛋白表达与大肠癌的关系及临床生物学意义。方法　采用免疫组织化学技术对 32例大肠癌组织及 16例正常大肠组织中的p53 蛋白的表达进行观察和比较。结果　P53 在正常大肠组织中表达阴性 ,P53 蛋白在大肠癌组织中表达阳性率为 5 3 13%。P53 蛋白在大肠癌组织中的表达与患者的性别、年龄、肿瘤大小、部位、大体分型、浸润深度、组织学类型、Ducks’分期及局部淋巴结转移无明显关系 (P >0 .0 5 )。P53 蛋白表达与大肠癌伴肝转移相关 (P <0 .0 5 )。结论　P53 蛋白在大肠癌组织中表达阳性 ,尤以伴肝转移者为著。p53 蛋白过度表达提示预后不良。