FCY1/HSV-TK双自杀基因体系对前列腺癌杀伤作用的研究

目的构建前列腺特异性膜抗原启动子调控表达的FCYl/TK双自杀基因表达载体,观察其对前列腺癌细胞LNCaP、PC-3的杀伤作用及在荷瘤裸鼠体内的抑瘤作用。方法 PCR扩增基因组DNA中PSMA启动子,利用基因重组的方法,替换真核表达载体plRES中的CMV启动子,再将自杀基因FCYl和HSV-TK分别克隆于载体plRES的两个多克隆位点,构建真核表达载体pPSMA-IRES-FCYl-TK。将该载体转染LNCaP、PC-3细胞,用RT-PCR的方法检测其转录,用MTT法检测前体药物5-氟胞嘧啶、丙氧鸟苷单一或联合使用对转染后的LNCaP、PC-3细胞的杀伤作用。将稳定转染双自杀基因表达载体的前列腺癌细胞注射入荷瘤裸鼠皮下,同时设立对照,计算肿瘤体积,观察生存状态。结果成功构建pPSMA-IRES-FCYl-TK双自杀基因表达载体,经脂质体转染LNCaP、PC-3细胞后,RT-PCR检测到FCYl和TK基因均有转录。MTT法检测表明5-FC与GCV联合使用,其细胞生长抑制率明显高于单独使用5-FC、GCV（P〈0.05）组。荷瘤裸鼠体内抑瘤试验显示：去势与双自杀基因联合治疗组治疗后瘤体体积略有下降,双自杀基因联合治疗组死亡率下降明显。结论 pPSMA-IRES-FCYl-TK的双自杀基因体系对前列腺癌细胞及荷瘤裸鼠肿瘤的杀伤作用,明显优于单自杀基因体系。     

Inhibitory effect of ultrasound microbubbles carrying HSV1-TK gene combined with ganciclovir on prostate cancer cells

目的 观察超声微泡造影剂携单纯疱疹病毒Ⅰ型胸昔激酶(HSV1-TK)基因体外转染及联合前药更昔洛韦(GCV)对前列腺癌细胞株PC-3的抑制效应.方法 超声辐照PC-3细胞,MTT筛选出最适辐照时间;将含有HSV1 -TK基因的质粒通过静电吸附在脂质微泡表面,采用最适超声辐照转染,并用荧光显微镜及Western blot观察TK基因的转入及表达;MTT法观察使用不同浓度的前药更昔洛韦(GCV)后细胞增殖抑制率;流式细胞仪检测最适浓度的前药GCV对转染后的前列腺癌细胞PC-3的周期的影响;MTT法观察HSV1-TK/GCV自杀基因系统对前列腺癌PC-3细胞杀伤效应.结果 MTT检测显示超声强度为1.0 W/cm2,频率为1 MHz,辐照时间30 s时超声辐照对细胞无明显的抑制作用;通过超声辐照后HSV1-TK基因可以顺利转入PC-3细胞中并有稳定的表达.与对照组相比,当前药GCV浓度在100μg/ml时,超声+微泡+TK组细胞杀伤率明显高于其他各组,细胞存活率约32％,低于其他各组(P＜0.05);流式细胞术检测显示大多数细胞被阻断在S期,细胞生长受到明显抑制.结论 以超声辐照微泡造影剂为载体转染自杀基因联合前约GCV,对人前列腺癌细胞有明显杀伤作用.     

携HSV1-TK自杀基因超声微泡造影剂联合前药更昔洛韦对前列腺癌细胞的抑制

目的观察超声微泡造影剂携单纯疱疹病毒Ⅰ型胸昔激酶(HSV1-TK)基因体外转染及联合前药更昔洛韦(GCV)对前列腺癌细胞株PC-3的抑制效应。方法超声辐照PC-3细胞,MTT筛选出最适辐照时间;将含有HSV1-TK基因的质粒通过静电吸附在脂质微泡表面,采用最适超声辐照转染,并用荧光显微镜及Western blot观察TK基因的转入及表达;MTT法观察使用不同浓度的前药更昔洛韦(GCV)后细胞增殖抑制率;流式细胞仪检测最适浓度的前药GCV对转染后的前列腺癌细胞PC-3的周期的影响;MTT法观察HSV1-TK/GCV自杀基因系统对前列腺癌PC-3细胞杀伤效应。结果 MTT检测显示超声强度为1.0 W/cm2,频率为1 MHz,辐照时间30 s时超声辐照对细胞无明显的抑制作用;通过超声辐照后HSV1-TK基因可以顺利转入PC-3细胞中并有稳定的表达。与对照组相比,当前药GCV浓度在100μg/ml时,超声+微泡+TK组细胞杀伤率明显高于其他各组,细胞存活率约32%,低于其他各组(P<0.05);流式细胞术检测显示大多数细胞被阻断在S期,细胞生长受到明显抑制。结论以超声辐照微泡造影剂为载体转染自杀基因联合前药GCV,对人前列腺癌细胞有明显杀伤作用。     

AFP增强子驱动的HSV-TK/GCV自杀基因系统对肝癌细胞杀伤的实验研究

目的 探讨人AFP增强子驱动的单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)自杀基因系统体外靶向杀伤肝癌细胞效应.方法 构建人AFP增强子驱动的pAFP-CDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒,脂质体转染肝癌细胞,检测TK mRNA和蛋白表达.MTT法检测GCV对肝癌细胞的杀伤作用.结果 成功构建pAFP-CDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒,在AFP阳性HepG2细胞中检测到TK mRNA和蛋白表达,添加GCV 可特异性地杀伤HepG2细胞,而AFP阴性的SMMC7721细胞生长不受影响.结论 AFP增强子驱动的TK/GCV自杀基因系统可以靶向杀伤AFP阳性肝癌细胞.     

CD-TK双自杀基因系统对前列腺癌细胞的杀伤作用

目的 探讨CD-TK融合双自杀基因对前列腺细胞的杀伤作用.方法 应用缺陷性腺病毒载体将CD-TK融合双自杀基因以及绿色荧光蛋白基因(GFP)转染RM-1细胞,以GFP是否表达作为间接鉴定转染成功的标志,以RT-PCR鉴定作为是否转染的标准.联合前药5-FC和/或GCV作用于转染了CD-TK基因的RM-1细胞,以MTT法检测自杀基因系统对转染后的RM-1细胞的杀伤作用,以未转染的RM-1细胞作对照.结果 以腺病毒感染RM-1细胞72 h后,在荧光显微镜下可见每个细胞都能发出淡绿色荧光,表明该基因已转染到RM-1细胞中,RT-PCR可检测到转染双基因的RM-1细胞含有CD-TK基因.与对照组相比较,当GCV浓度为125 μg/ml时,转染了CD-TK基因的RM-1细胞的存活率为47.27%;与对照组相比较,当5-FC浓度为160 μg/ml时,RM-1细胞的存活率为71.56%;而两种前药联合应用时RM-1细胞的存活率为18.45%,低于单一用药组(P＜0.05).结论 CD/5-FC、TK/GCV自杀基因系统对前列腺癌细胞具有较强的杀伤作用,而应用CD-TK融合自杀基因系统明显优于单一的自杀基因系统.     

肝癌特异性HSV-TK/CD基因表达质粒的构建及其杀伤活性

[目的]构建肝癌特异性双自杀基因表达质粒.[方法]用平端连接方法将pUH-3质粒中822 bp的pALBeAFP片段(含有416 bp的白蛋白启动子pALB和406 bp的甲胎蛋白增强子eAFP)代替pCEA-CD/TK质粒的CEA启动子,用PCR法鉴定插入方向,构建肝癌特异性双自杀基因表达质粒pALBeAFP-CD/TK.将pALBeAFP-CD/TK转染HepG2等4种肝癌细胞,MTT法测定前药GCV、5-FC对HepG2细胞的杀伤作用.[结果]获得pALVeAFP-CD/TK克隆,RT-PCR证实HepG2细胞转染pABeAFP-CD/TK后可表达自杀基因,pALBeAFP-CD/TK转染可使前药GCV、5-FC特异性地杀伤HeFG2细胞.[结论]肝癌特异性HSV-TK/CD基因表达质粒构建成功.     

由Ｅｇｒ-１调控ＴＫ基因灭活胰腺癌细胞的实验研究

目的:观察对放射敏感的早期生长反应基因-1(early growth response-1,Egr-l)启动子调控单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase,TK)基因是否对胰腺癌细胞的杀伤作用有增敏效应.方法:以细菌内同源重组法构建含TK基因的腺病毒载体pAdEgr-1-TK,转染人胰腺癌细胞株PC-3,60Co-γ射线照射后,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量分析各不同照射剂量组TK基因的mRNA的表达.加入前药丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV),MTT法检测其对胰腺癌细胞的杀伤作用.结果:经60Co-γ射线照射后,与对照组胰腺癌细胞(0.86±0.11)相比,前药GCV可明显提高对转染pAdEgr-1-TK胰腺癌细胞的杀伤效率(0.08±0.03)(P＜0.001).结论:由Egr-l启动子调控的TK自杀基因在γ射线作用下可以显著提高杀伤胰腺癌细胞的能力.     

肝癌特异性HSV-TK／CD基因表达质粒的构建及其杀伤活性

[目的]构建肝癌特异性双自杀基因表达质粒。[方法]用平端连接方法将pUH-3质粒中822bp的pALBeAFP片段(含有416bp的白蛋白启动子pALB和406bp的甲胎蛋白增强子eAFP)代替pCEA-CD／TK质粒的CEA启动子，用PCR法鉴定插人方向，构建肝癌特异性双自杀基因表达质粒pALBeAFP-CD／TK。将pALBeAFP-CD／TK转染HepG2等4种肝癌细胞，MTT法测定前药GCV、5-FC对HepG2细胞的杀伤作用。[结果]获得pALBeAFP-CD／TK克隆，RT-PCR证实HepG2细胞转染pALBeAFP-CD／TK后可表达自杀基因．pALBeAFP-CD／TK转染可使前药GCV、5-FC特异性地杀伤HepG2细胞。[结论]肝癌特异性HSV-TK／CD基因表达质粒构建成功。     

胞嘧啶脱氨酶和胸苷激酶融合双自杀基因系统对膀胱癌细胞体外杀伤作用

目的探讨胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对膀胱癌细胞的杀伤作用。方法利用含有CD-TK双自杀融合基因及绿色荧光蛋白(GFP)基因的复制缺陷腺病毒感染膀胱癌细胞株Mb49细胞,RT-PCR检测CD及TK表达,MTT法测定感染病毒Mb49细胞对GCV和/或5-FC敏感性及旁观者效应。结果RT-PCR可检测到腺病毒感染的Mb49细胞中CD及TK表达,腺病毒感染的Mb49细胞对GCV和/或5-FC敏感性增强,且细胞存活率随前药浓度增加而明显降低,联合应用杀伤效果更强。在混合培养细胞中转染细胞为10%时,GCV组、5-FC组、GCV 5-FC组细胞存活率分别为(79.55±0.88)%、(77.17±3.38)%、(49.21±1.78)%,有较强的旁观者效应。结论腺病毒载体能有效转导CD-TK融合双自杀基因在膀胱癌细胞中表达,CD-TK融合双基因系统对膀胱癌细胞有更强杀伤效果和更明显的旁观者效应,优于单基因系统,值得进一步研究。     

CD-TK融合自杀基因对前列腺癌细胞的杀伤作用

目的：探讨CD-TK融合自杀基因体系对前列腺癌PC-3m细胞的杀伤作用。方法：应用逆转录病毒载体将CD-TK融合基因转染PC-3m细胞，经RT-PCR鉴定后，用MTT法检测丙氧鸟苷(GCV)、5-胞嘧啶(5-FC)前体药物单一或联合应用对转染PC-3m细胞的杀伤作用，以未转染PC-3m细胞为对照。同时应用流式细胞仪、电镜等检测药物作用前后的变化。结果：GCV对转染PC-3m细胞有较强的直接细胞毒作用，而5-FC治疗有显著旁观者效应；联合用药具有协同作用。结论：CD-TK融合基因治疗对前列腺癌细胞具有显著杀伤作用，明显优于单一自杀基因治疗，深入研究意义较大。     

pEGFP—AFP—TK真核表达载体的构建及其抗肝癌细胞效应

目的 构建AFP启动子介导的HSV／TK重组真核表达载体,并研究其荷瘤效应。方法PCR扩增AFP基因启动子、HSV—TK基因,将上述片断插入EGFP—N1载体的多克隆位点,从而构建甲胎蛋白启动子调控下HSV—TK基因重组表达载体pEGFP—AFP—TK。将其注射移植性H22肝癌模型C57BL／6J小鼠,并设转染空质粒pcDNA3．1组,观察两组的抗肿瘤效应。结果肝癌特异性真核表达载体pEGFP—AFP—TK构建成功,该真核表达载体免疫荷瘤小鼠后,pEGFP—AFP—TK组肿瘤细胞生长受到抑制,且该组生存期长于pcDNA3．1组（P〈0．05）。结论在受试动物体内可有效的诱导特异性抗肿瘤免疫应答。     

前列腺特异性膜抗原启动子调控的重组质粒的构建及表达

目的 探讨前列腺特异性膜抗原(PSMA)启动子调控目的基因表达的前列腺细胞特异性,为前列腺癌靶向性基因治疗作前期铺垫。方法 采用PCR方法从前列腺癌细胞DNA中扩增PSMA启动子序列,将其克隆到含有报告基因——增强绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒载体,脂质体介导基因转染不同癌细胞并观察EGFP在不同细胞的表达情况。结果 成功构建质粒pEGFP-PSMAm,质粒转染结果显示PSMA表达阳性的LNeap细胞中存在GFP的有效表达。结论 PSMA启动子调控EGFP表达的重组质粒的构建证明了PSMA启动子的基因转录启动与细胞PSMA的表达相关,即具有前列腺细胞特异性。     

mGITRL真核表达质粒的构建及其在Lewis细胞中的表达

目的:构建含小鼠GITRL基因的真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL,体外转染小鼠肺癌细胞株Lewis细胞。方法:利用PCR方法扩增mGITRL基因,克隆至pIRES2-eGFP载体,选择阳性克隆并进行序列测定。以电穿孔法转染Lewis细胞,通过G418筛选,获得稳定表达细胞株。结果:构建了真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL,基因测序与GenBank中发表的序列完全一致,体外转染Lewis细胞,经G418筛选,体外传代30代以上,RT-PCR及流式细胞仪检测该细胞株稳定表达mGITRL。结论:成功构建了真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL,并在小鼠Lewis细胞中稳定表达,为进一步研究GITRL的生物学功能提供研究基础。     

人PSMA基因启动子表达载体pGL3-PSMP的构建

目的：构建含人前列腺特异性膜抗原（prostate specific membrane antigen,PSMA）基因启动子表达载体pGL3-PSMP。方法：PCR扩增人PSMA上游1175bp启动子序列,克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic,构建前列腺特异性表达载体pGL3-PSMP,重组子经双酶切、测序鉴定。将构建载体用脂质体转染体外培养的前列腺癌细胞株PC-3M,应用双荧光素酶测定系统检测荧光素酶的表达活性。结果：序列测定表明,克隆获得的1175bp的DNA序列与GenBank报道的一致,且插入方向正确。含人PSMA基因启动子的报告基因荧光素酶的表达活性显著提高,比pGL3-Basic高10倍多。结论：成功构建了含人PSMA基因启动子的荧光素酶表达载体。     

GFP-SUMO-3融合蛋白的重组及其在LNCaP细胞中的表达和定位

目的：构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-SUMO-3,观察GFP-SUMO-3融合蛋白在人前列腺癌细胞LNCaP中的表达与定位。方法：采用PCR扩增SUMO-3基因全长cDNA编码区序列,克隆入pEGFP-N1真核表达载体。重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3通过酶切和测序鉴定正确后,脂质体法将重组质粒转染至LNCaP中,利用GFP抗体通过Western blotting检测 GFP-SUMO-3融合蛋白的表达,通过荧光显微镜观察其在细胞中的表达及分布。结果：重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3经BamHⅠ和Xho Ⅰ双酶切鉴定,得到大小分别为4 700和312 bp的条带,与预期结果一致。测序结果显示,GFP在N端,是阅读框正确的SUMO-3的基因序列。在LNCaP细胞中过表达GFP-SUMO-3融合蛋白,Western blotting得到相对分子质量为39 000的蛋白表达条带,与GFP-SUMO-3大小相符。荧光显微镜观察,转染重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3　的细胞中呈绿色荧光,主要在细胞核内表达,与DAPI重合。结论：成功构建重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3,并表达代绿色荧光蛋白的SUMO-3融合蛋白,鉴定出SUMO-3在LNCaP细胞中的核定位性。     

腺病毒介导的HSV—tk／GCV自杀基因系统靶向性治疗前列腺癌的实验研究

目的：观察腺病毒介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,丙氧鸟苷（HSV—tk／GCV）自杀基因系统在人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控下对人前列腺癌细胞的靶向性体外杀伤效应。方法：利用不同感染复数（MOI）的重组腺病毒携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因感染前列腺癌细胞LNCaP和人成纤维细胞MRC-5,荧光显微镜下观察其感染效率：利用携带不同启动子的重组腺病毒Ad—hTERT-HSV／TK以及Ad—CMV—HSV／TK感染LNCaP和MRC-5细胞,加入不同浓度GCV,MTY法观察受转染细胞的存活率。结果：重组腺病毒Ad—hTERT—EGFP能特异地转染LNCaP,其转染效率随重组病毒的MOI增加而升高（P〈0．01）,MOI为1时转染率为8．3％,MOI为1000时转染率达100％;应用GCV处理后,Ad—CMV—HSV／TK对LNCaP和MRC-5细胞均有杀伤作用,而Ad—hTERTp—HSV／TK只杀伤LNCaP（P〈0．001）,随着MOI和GCV浓度的增加,LNCaP细胞存活率明显降低（P〈0．01）,MOI为1和GCV浓度为1μmol/L时存活率为95．4％。MOI为100和GCV浓度为1000μmol／L时存活率仅为6．1％,并有旁观者效应。结论：重组腺病毒携带EGFP报告基因可准确、简便地确定转染效率;hTERT启动子调控的重组腺病毒介导的HSV—tk／GCV自杀基因系统对人前列腺癌细胞有靶向杀伤作用。     

MDR1启动子调控的双自杀基因真核表达载体的构建及其在K562/A02细胞中的表达

目的：构建多药耐药基因（MDR1）启动子调控的CD-TK双自杀基因真核表达载体用于耐药白血病的靶向性基因治疗。方法：采用PCR方法从K562/A02细胞基因组DNA中扩增MDR1启动子，将其连接到双自杀基因CD TK的上游，构建pcDNA3 MDR1 Promoter CD-TK真核表达载体，用脂质体介导法将构建好的载体转染入K562、K562/A02细胞，PCR鉴定CD、TK基因的整合，RT-PCR鉴定CD、TK基因的表达。结果：PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确，通过连接成功构建含正确目的基因的表达载体pcDNA3-MDR1-Promoter-CD-TK。转染入细胞后PCR结果显示，CD、TK基因均整合入K562、K562/A02细胞中，RT-PCR结果显示,562/A02/CD TK细胞CD、TK基因有特异性条带表达，而K562/CD TK细胞无特异性条带。结论： MDR1启动子调控的CD TK双自杀基因真核表达载体的成功构建及其在K562/A02细胞中的特异性表达为耐药白血病的靶向性基因治疗提供了实验基础。     

PSA增强子启动子调控Smac基因表达载体的构建

目的 构建携带Smac基因、人前列腺特异性抗原(PSA)增强子(PSAE)/PSA启动子(PSAP)调控的前列腺特异性真核表达载体.方法 切除含Smac基因的真核表达载体pcDNA 3.1-Smac内部的人巨细胞病毒/T7启动子序列,替换为在前列腺组织特异性表达的PSAE、PSAP调控序列.构建的质粒经双酶切凝胶电泳及测序鉴定.结果 成功构建携带Smac基因人PSAE-PSAP调控的前列腺特异性真核表达载体pcDNA3-PSAE-PSAP-Smac质粒.结论 新构建的载体为前列腺癌的靶向基因治疗奠定了基础.     

重组表达载体pIRES-CD、pIRES-TK的构建及其在ACC-2细胞中的表达

目的：运用分子生物学技术扩增CD、TK基因,进行其DNA序列分析,并构建真核表达质粒pIRES-CD及pIRES-TK,将其共同转染ACC-2细胞,为进一步研究双自杀基因对ACC-2细胞杀伤作用奠定基础。方法：根据CD和TK基因DNA的序列分别设计、合成引物,构建克隆载体pMD18-T-CD和pMD18-T-TK,并进行DNA序列分析;构建以内部核糖体进入位点 (IRES)相连的CD和TK基因的真核表达质粒pIRES-CD及pIRES-TK,用电穿孔法以真核表达质粒共同转染ACC-2细胞,用RT-PCR检测CD和TK的表达。结果：克隆DNA片段和GeneBank上报道的CD、TK序列基本一致,且经酶切鉴定,CD、TK基因成功插入真核表达质粒IRES,R-PCR检测表明,以真核表达质粒pIRES-CD及pIRES-TK共同转染的ACC-2细胞能表达CD和TK。结论：成功扩增了CD、TK的DNA片段,并进行了序列分析;成功构建CD和TK基因的重组真核表达质粒pIRES-CD及pIRES-TK,将其转染ACC-2细胞后能分泌性表达CD和TK,为肿瘤基因治疗的研究提供一定途径。