靶向Mcl-1的shRNA重组质粒的构建及其对HepG2细胞增殖和凋亡的影响

目的 设计以髓细胞白血病基因-1(Mcl-1)为靶点的短发夹状RNA(shRNA).构建携带此shRNA的重组质粒,探讨脂质体转染该重组质粒对肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响.方法 设计3对针对Mcl-1基因不同位点的shRNA片段的真核表达载体psiRNA-hHlneo-Mcl,用阳离子脂质体法将重组质粒转染至人肝癌细胞株HepG2中,通过RT-PeR及Western blot方法检测转染前后Mcl-1 mRNA及蛋白表达情况,筛选能高效抑制Mcl-1基因表达的shRNA重组质粒并应用MTT和流式细胞仪分析转染后细胞增殖和凋亡变化的情况.结果 成功构建含shRNA片段的重组质粒,依次命名为pMclsi-1、pMclsi-2、pMclsi-3.经测序证实.插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致.重组质粒转染HepG2细胞后,Mcl-1基因的mRNA水平及蛋白水平明显下调,其中以pMclsi-1重组质粒下调效应最强.MTT检测显示pMclsi-1可明显抑制HepG2细胞增殖,流式细胞仪测定转染后24 h细胞凋亡率为6.5%,48 h细胞凋亡率为15.6%,显著高于对照组(3.9%,P<0.05).结论 采用RNAi技术可特异阻断Mcl-1基因的表达,Mcl-1基因有促进细胞增生及抑制凋亡的作用.     

Effect of shRNA interference targeting myeloid leukemia-1 gene on proliferation in lymphoma cell line

目的 研究慢病毒介导的髓细胞白血病基因(Mcl-1)短发夹状RNA(shRNA)干扰对淋巴瘤细胞系SNK-6增殖和凋亡的影响.方法 设计以Mcl-1为靶点的shRNA并构建携带此shRNA的慢病毒载体,转染淋巴瘤细胞系SNK-6,荧光定量PCR(qPCR)及Western blot方法检测病毒感染前后Mcl-1 mRNA及蛋白表达变化,四甲基偶氮唑盐法(MTT法)和流式细胞仪分析细胞增殖和凋亡变化的情况.结果 成功构建Mcl-1-shRNA慢病毒表达载体,并可有效感染淋巴瘤细胞株SNK-6,感染后SNK-6细胞Mel-1基因的mRNA水平及蛋白水平表达明显下调,MTT法检测显示慢病毒介导的Mcl-1基因shRNA干扰与对照病毒组相比可明显抑制SNK-6细胞增殖[(31.6±3.3)％vs(5.8±2.7)％,P＜0.01],流式细胞仪测定感染后细胞凋亡明显高于对照病毒组[(28.9±2.1)％vs(5.3±1.5)％,P＜0.01].结论 慢病毒介导的Mcl-1基因shRNA干扰技术可特异性阻断SNK-6细胞Mel-1基因的表达,抑制细胞的增殖并促进细胞的凋亡.     

靶向Nrf2基因shRNA慢病毒载体的构建及其对肝星状细胞Nrf2基因表达的沉默

目的：设计以NF-E2-related factor2(Nrf2)基因为靶点的短发夹状RNA(shRNA),构建重组慢病毒表达载体并转染大鼠肝星状细胞株HSC-T6,观察其对Nrf2表达的影响。方法应用重组DNA技术,将设计好的4条基因特异性shRNA序列插至慢病毒表达载体pGLV3-GFP中,构建pGLV3-GFP-Nrf2-shRNA-1/2/3/4,并应用脂质体法转染293T细胞,进行病毒包装及滴度测定。采用实时荧光定量PCR( RT-PCR)及Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测转染72 h和96 h后大鼠肝星状细胞株HSC-T6 Nrf2基因的表达情况。结果测序证实慢病毒载体构建成功,并测定滴度为1×109 TU/ml,pGLV3-GFP-Nrf2-shRNA转染后72 h和96 h可抑制Nrf2基因mRNA及蛋白的表达。结论成功构建Nrf2基因的shRNA慢病毒载体,可有效抑制大鼠肝星状细胞株HSC-T6中Nrf2基因的表达。     

沉默id1基因表达对食道癌细胞Eca-109生物学行为的影响

目的 探讨靶向沉默分化抑制因子1基因(id1)的短发夹RNA(shRNA)表达质粒载体对食道癌细胞生物学行为的影响.方法 设计针对id1基因的shRNA序列,合成序列并克隆入pGFU6/neo质粒中.重组质粒转染食道癌细胞,RT-PCR检测id1基因mRNA的表达,Western blot检测Id1、p16及增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白表达.台盼蓝染色、克隆形成实验检测细胞生长,流式细胞仪检测细胞增殖以及各周期分布.结果 重组质粒经酶切鉴定和测序,证实表达干扰质粒构建成功.转染重组质粒的食道癌细胞id1 mRNA和蛋白的表达明显下降 (P<0.05),食道癌细胞增殖受到抑制,G0/G1期细胞比例增加,而S期的细胞比例明显下降(P<0.05).结论 构建的id1 shRNA表达质粒能有效下调id1基因的表达和抑制食道癌细胞增殖.     

靶向Nrf2基因shRNA慢病毒载体的构建及其对肝星状细胞Nrf2基因表达的沉默

目的 设计以NF-E2-related factor2(Nrf2)基因为靶点的短发夹状RNA(shRNA),构建重组慢病毒表达载体并转染大鼠肝星状细胞株HSC-T6,观察其对Nrf2表达的影响。方法 应用重组DNA技术,将设计好的4条基因特异性shRNA序列插至慢病毒表达载体p GLV3-GFP中,构建p GLV3-GFP-Nrf2-shRNA-1/2/3/4,并应用脂质体法转染293T细胞,进行病毒包装及滴度测定。采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)及Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测转染72 h和96 h后大鼠肝星状细胞株HSC-T6 Nrf2基因的表达情况。结果 测序证实慢病毒载体构建成功,并测定滴度为1×109TU/ml,p GLV3-GFP-Nrf2-shRNA转染后72 h和96 h可抑制Nrf2基因mRNA及蛋白的表达。结论 成功构建Nrf2基因的shRNA慢病毒载体,可有效抑制大鼠肝星状细胞株HSC-T6中Nrf2基因的表达。     

shRNA沉默ADAM17基因对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响

目的 利用shRNA干扰沉默人乳腺癌细胞MCF-7的解聚素-金属蛋白酶17(adisintegrin and metalloproteinases 17,ADAM17)基因,观察其对细胞增殖的影响.方法 针对ADAM17基因设计合成具有特异性的ADAM17-shRNA,经脂质体LipofectamineTM 2000转染MCF-7细胞.实验设对照组(空白PBS)、干扰组(转染干扰无义序列ADAM17-shNC)、实验组(转染ADAM17-shRNA),采用Reahime PCR检测各组细胞AD-AM17 mRNA的表达水平,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞的增殖活性,流式细胞仪检测细胞周期变化.结果 实验组ADAM17 mRNA的相对表达量显著低于对照组和干扰组,差异有统计学意义(P＜0.05);实验组的MCF-7细胞增殖活性较其他两组明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05);实验组的MCF-7细胞进入S期(23.60±1.09)％和G2/M期(6.30±0.82)％的比例降低,绝大多数细胞停留在G0/G1期(65.17±1.35)％,细胞周期延缓,与对照组、干扰组相比较差异具有显著性意义(P＜0.05).结论 ADAM17-shRNA对人乳腺癌细胞MCF-7的ADAM17基因具有沉默作用,从而抑制MCF-7细胞的增殖活性,延缓细胞周期进展.     

靶向rPTTG的shRNA慢病毒载体构建及沉默效率评价

目的构建并筛选能高效沉默大鼠垂体瘤转化基因（rPTTG）的shRNA慢病毒重组载体。方法设计并合成4组特异性针对大鼠PTTG基因的shRNA序列将其构建到慢病毒载体pGCL GFP中;评估慢病毒重组载体在大鼠肾细胞中的转染效率并运用real time PCR技术检测各组重组载体对目的基因的沉默效果。结果PCR及测序结果显示,目的片段插入正确,重组载体构建成功,慢病毒重组载体转染效率达70%以上;4组shRNA序列均有基因敲减效果,并且第4组shRNA(4# shRNA)序列效果最为明显（＞80%）。结论成功构建了高效沉默rPTTG基因的慢病毒载体;验证了慢病毒载体作为RNAi载体工具转染效率的可靠性;实验显示4# shRNA能高效抑制内源性rPTTG基因表达。     

大鼠TGF-β1基因shRNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠转化生长因子-β1(TGF-β1)基因短发卡RNA干扰慢病毒载体,并通过感染大鼠原代逼尿肌细胞进行鉴定。方法:根据大鼠TGF-β1基因设计合成3对shRNA序列,将其分别连接至带荧光标签和抗性基因的慢病毒载体pHBLV上,通过转化至DH5α感受态细胞,提取阳性克隆后用DNA测序进行鉴定,选择序列正确的克隆大量扩增并提取重组的慢病毒质粒。将重组慢病毒质粒和慢病毒包装的辅助质粒转染至293T细胞进行慢病毒包被,抗性筛选后通过荧光法对病毒进行滴度测定。用慢病毒感染大鼠原代逼尿肌细胞,通过qRT-PCR和Western blot检测TGF-β1 mRNA和蛋白的表达水平。结果:设计的3种大鼠TGF-β1 shRNA干扰慢病毒载体经测序鉴定构建成功。使用该病毒感染大鼠原代逼尿肌细胞,qRT-PCR和Western blot结果显示,与空白对照组和阴性对照组相比,3种TGF-β1 shRNA感染组的细胞TGF-β1在mRNA和蛋白水平均有不同程度的下调,其中TGF-β1 shRNA 2的蛋白敲低效率最好(57%)。结论:本研究成功构建了大鼠TGF-β1 shRNA干扰慢病毒载体,并在大鼠原代逼尿肌细胞中进行了鉴定,为进一步的基因治疗研究提供了可能性的基础。     

shRNA转染对异位内膜细胞survivin基因的靶点抑制作用

目的 构建靶向人survivin基因的短发夹状RNA(shRNA)慢病毒载体,观察其对异位内膜细胞survivin基因的抑制作用.方法 设计干扰人survivin基因shRNA序列,合成、退火形成双链寡核酸后克隆到pGCL-GFP载体,PCR鉴定和测序分析及阳性克隆质粒抽提,在脂质体的介导下将慢病毒包装辅助质粒和survivin基因重组慢病毒载体导入293T细胞包装病毒,测定病毒滴度.感染人异位子宫内膜细胞,采用RT-PCR测定细胞中survivin mRNA的表达,并与未转染及空转染细胞进行比较.结果 慢病毒载体PCR和测序结果与预期结果一致,经包装产生的病毒滴度为8×10 8U/ml.Survivin shRNA慢病毒载体感染人异位内膜细胞后,Survivin mRNA水平为0.15±0.03,明显低于阴性对照组0.42±0.06和空白对照组0.48±0.08(P<0.01);而阴性对照组与空白对照组相比无统计学差异.结论 成功构建针对survivin基因的shRNA慢病毒载体,体外感染人异位内膜细胞后可有效抑制survivin基因的表达,为研究子宫内膜异位症分子病冈和基因治疗提供了新的平台.     

慢病毒介导的shRNA干扰大鼠施万细胞RSC96 MYH14基因的表达

目的 应用RNA干扰技术构建大鼠肌球蛋白重链14（MYH14）基因重组慢病毒载体并鉴定。方法 根据MYH14 mRNA序列设计合成单链引物形成双链寡核苷酸序列,连接入经AgeⅠ和BamHⅠ双酶切线性化的GV298慢病毒质粒载体中,菌液经PCR鉴定并测序验证。取测序正确的菌液提取质粒转染大鼠施万细胞RSC96,利用免疫荧光法观察转染效率,蛋白质印迹法筛选有效敲低MYH14的shRNA质粒,CCK-8法检测转染后RSC96细胞的活力。结果 合成3对MYH14-shRNA序列并将其克隆到GV298载体中,构建了重组质粒MYH14-shRNA1、2、3,经菌液PCR鉴定和测序筛选出测序正确的载体MYH14-shRNA1和MYH14-shRNA2。免疫荧光检测结果显示转染72 h时RSC96细胞荧光表达最强;蛋白质印迹法检测结果显示,与阴性对照（scramble序列）组相比,MYH14-shRNA2转染后RSC96细胞中MYH14蛋白的表达水平降低（0.57±0.15 vs 1.11±0.06,P<0.01）,而MYH14-shRNA1转染后MYH14蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。MYH14-shRNA2转染RSC96细胞24 h后的细胞活力与阴性对照组相比差异无统计学意义（1.09±0.16 vs 1.00±0.15,P>0.05）。结论 成功构建大鼠MYH14基因重组慢病毒干扰载体,该载体能有效下调RSC96细胞中MYH14的表达。     

shRNA干扰沉默RNPC1a基因对SUM1315细胞增殖、迁移及侵袭的影响

目的:研究RNPC1a基因对SUM1315细胞增殖?迁移及侵袭的影响?方法:应用脂质体技术将RNPC1a 短发夹RNA(shRNA)转染至SUM1315细胞,通过嘌呤霉素筛选出稳定细胞株,采用实时荧光定量PCR和Western blot方法检测其干涉效率,并用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞的增殖情况,划痕实验及Transwell细胞侵袭实验检测其迁移和侵袭能力?结果:经qRT-PCR和Western blot方法证实稳定转染RNPC1a shRNA的SUM1315细胞中RNPC1a的mRNA和蛋白水平较对照组均明显下降(P < 0.05),同时RNPC1a干扰后细胞的增殖?迁移及侵袭能力均减弱(P < 0.05)?结论:RNPC1a shRNA能有效地降低SUM1315细胞中RNPC1a基因的表达,RNPC1a基因沉默可以抑制SUM1315细胞的增殖?迁移及侵袭?     

简易部分肝切除自体肝移植大鼠模型的建立

目的:建立一种简易的大鼠部分肝切除自体肝移植模型.方法:采用SD大鼠,在既往自体肝移植模型基础上进行简化和改进,摒弃传统的门、腔及颈内静脉置管转流方法,改进冷灌注方法,建立了研究大鼠部分肝切除自体余肝移植模型.结果:手术过程大大简化,成功率为96.7％.门静脉、下腔静脉置管时间不超过1min,无肝期为16～18(中位时...     

小鼠骨桥蛋白(OPN)基因RNA干扰慢病毒载体的构建及体内抑制效果鉴定

 目的 构建骨桥蛋白(osteopontin,OPN)基因RNA干扰慢病毒载体并在小鼠体内鉴定其抑制效果。方法 参照OPN GenBank上的序列,对OPN基因沉默位点进行分析,设计针对OPN信使RNA的小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)OPN shRNA及阴性对照(negative control shRNA,NC shRNA)序列,合成pSicoR GFP shRNA重组体。经鉴定序列无误后,与pCMV VSV G 和pCMV dR8.91辅助质粒包装并转染293FT细胞,得到有效滴度为5×109 TU/mL的病毒原液。经尾静脉将构建的慢病毒载体注射入小鼠体内,qRT PCR及Western blot检测小鼠肝脏OPN mRNA及蛋白的抑制效果。结果 成功构建针对OPN的shRNA慢病毒载体,经纯化、浓缩得到滴度为5×109TU/mL病毒原液。与正常对照组、阴性对照组相比,实验组OPN mRNA及蛋白表达水平明显下降;正常对照组、实验组OPN mRNA及蛋白表达水平无明显差别。结论 利用RNA干扰技术,借助慢病毒载体,成功构建小鼠肝脏OPN基因低表达模型。为进一步研究OPN在胆石症等疾病中的作用提供了有力工具。     

沉默 HepG2 细胞核糖核酸酶抑制因子的 shRNA 逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的 构建针对人核糖核酸酶抑制因子（hRI）的shRNA逆转录病毒载体,为探讨hRI抗肿瘤作用机制打下基础。方法 用亚克隆法将目的 片段pkd—dsRI和pkd从表达载体pKD—dsRI克隆到pLNCX上,用双酶切筛选得到阳性克隆后,用脂质体法将其转染到人肝癌细胞HepG2细胞中,用800mg／L G418筛选2周,产生稳定的细胞克隆后,用RT—PCR检测细胞中核糖核酸酶抑制因子mRNA表达的变化。结果 双酶切鉴定为阳性克隆。RT—PCR表明,对比空白组（0．790±0．014）和空载体组（0．904±0．027）,干扰组hri基因表达（0．361±0．048）明显下调,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论 成功构建了针对hRI的shRNA逆转录病毒载体。     

Effects of over-expression of ANXA10 gene on proliferation and apoptosis of hepatocellular carcinoma cell line HepG2

The effects of over-expression of ANXA10 gene on proliferation and apoptosis of hepatocellular carcinoma cell line HepG2 were elucidated.The human ANXA10 gene was subcloned into the lentiviral vector,PGC-FU,to generate the lentiviral expression vector,PGC-FU-ANXA10.The corrected ANXA10 was confirmed by endoenzyme digestion,and sequencing.Recombinant lentiviruses were produced by 293T cells following the co-transfection of PGC-FU-ANXA10 with the packaging plasmids pHelper1.0 and pHelper2.0.The resulting recombinant lentiviruses carrying ANXA10 were then used to infect human embryonic kidney epithelial cells,and lentiviral particles were produced.The ANXA10 expression in 293T cells was detected by using fluorescent microscope and Western blotting.HepG2 cells were infected,and divided into PGC-Fu-ANXA10 group,PGC-Fu group and HepG2 cell group.The changes of ANXA10 mRNA and protein expression were detected by using RT-PCR and Western blotting respectively.Flow cytometry and MTT assay were performed to examine the changes in cell apoptosis and proliferation respectively.The recombinant PGC-FU-ANXA10 vector was successfully constructed,the ANXA10 protein was detected by using Western blotting,and virus titer was 2×108 TU/mL.The recombinant lentiviruses were effectively infected into HepG2 cells in vitro and the infection efficiency was 70%.At 72 h after infection,the ANXA10 mRNA and protein expression levels in PGC-Fu-ANXA10 group were significantly higher than in PGC-Fu group and HepG2 cell group (P<0.05);the in vitro growth inhibition rate of HepG2 cells in PGC-Fu-ANXA10 group was 24.65%,significantly higher than that in PGC-Fu group and HepG2 cell group (P<0.05),but there was no significant difference between PGC-Fu group and HepG2 cell group;the apoptosis rate in PGC-Fu-ANXA10 group,PGC-Fu group and HepG2 cell group was (51.92±1.41)%,(19.00±1.12)% and (3.59±0.89)% respectively.The apoptosis rate in PGC-Fu-ANXA10 group was significantly higher than in PGC-Fu group and HepG2 cell group (P<0.05).The reco     

构建可诱导表达MST1基因的慢病毒载体及其在肝癌细胞系Huh-7中的表达

 目的 构建可诱导表达MST1基因的慢病毒载体,为进一步研究MST1与肝癌之间的关系提供理想的模型。方法 克隆MST1基因到慢病毒载体pLVPT-tTRKRAB中,2种慢病毒载体（pLVPT-tTRKRAB-MST1和pLV-tTRKRAB-Red）与包装质粒通过293FT细胞系介导,分别包装成病毒颗粒,先后2次去感染肝癌细胞系Huh-7。培养7 d后,使用强力霉素（doxcycline）进行诱导,用Western blot检测MST1表达情况。结果 构建了可诱导MST1真核表达病毒载体并获得相应的病毒,病毒可以高效感染目的肝癌细胞系Huh-7。在强力霉素诱导条件下,肝癌细胞系Huh-7可以表达MST1。结论 成功构建出可诱导表达MST1基因的慢病毒载体,并获得在强力霉素诱导条件下可以表达MST1的肝癌细胞亚系。     

逆转录病毒载体介导的RNAi抑制Bmi-1基因表达对MCF-7细胞的影响

目的:研究RNA干扰(RNAi)抑制Bmi-1基因表达后对乳腺癌细胞株MCF-7凋亡和增殖的影响.方法:将表达Bmi-1短发夹RNA(shRNA)的重组逆转录病毒载体pSuper-retro/Bmi-1si瞬时转染MCF-7乳腺癌细胞株,携带针对绿色荧光蛋白干扰序列的载体pSuper-retro/GFPsi作为阴性对照.用RT-PCR和Western Blot分别从mRNA,蛋白水平检测Bmi-1的表达;MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测MCF-7细胞周期和凋亡的变化.结果:pSuper-retro/Bmi-1si明显抑制MCF-7细胞Bmi-1 mRNA及蛋白表达.与空白对照组及阴性对照组相比较凋亡细胞数无明显增加;抑制Bmi-1基因表达使MCF-7细胞G1/S周期转换及细胞增殖速率受抑制.结论:表达shRNA的重组逆转录病毒载体pSuper-retro/Bmi-1si能显著抑制乳腺癌细胞株MCF-7中Bmi-1基因表达,从而有效抑制MCF-7细胞增殖,为乳腺癌的基因治疗提供了实验依据.     

Prohibitin基因的shRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建靶向prohibitin基因的shRNA真核表达载体．方法：根据prohibitin mRNA序列,利用Ambion网上设计软件设计两条针对该基因不同靶点的shRNA干扰序列,克隆到线性化的质粒载体上,并进行酶切鉴定和测序．结果：酶切结果表明构建的shRNA已插入载体,经测序证明与设计一致．结论：成功构建两个靶向prohibitin基因的shRNA真核表达载体,为下一步研究prohibitin基因在肿瘤细胞中的作用和后续的的体内外实验奠定了基础．     

过表达Mxi1对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响

目的：构建含有Max结合蛋白1（Mxi1）基因的重组慢病毒载体,并探讨过表达Mxi1基因对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响。方法：利用DNA重组技术将Mxi1基因克隆至慢病毒载体,经酶切和测序鉴定后,将重组质粒与慢病毒辅助包装元件质粒共转染293T 细胞,获得含 Mxi1基因的重组慢病毒。重组慢病毒感染人胃癌SGC-7901细胞,荧光显微镜下观察感染效率,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测Mxi1、cyclinB1和caspase-8的基因表达,免疫印迹法（Western blot）检测Mxi1蛋白的表达。CCK-8比色法和流式细胞术分别检测Mxi1 基因对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响。结果：成功构建含 Mxi1基因的慢病毒表达载体,RT-PCR和Western blot检测到Mxi1 基因和蛋白的表达。RT-PCR结果显示,过表达Mxi1 的SGC-7901细胞与空白对照细胞及过表达空病毒对照细胞相比,细胞内cyclinB1的mRNA表达水平明显降低,而caspase-8的 mRNA表达水平显著升高。CCK-8实验和流式细胞术检测结果显示,过表达Mxi1的SGC-7901细胞与空白对照细胞及过表达空病毒对照细胞相比,细胞增殖活性明显降低,细胞凋亡率显著升高。结论：成功构建Mxi1慢病毒载体且有效转染SGC-7901细胞,过表达Mxi1 可以抑制胃癌细胞增殖并促进其凋亡。