RNA干扰抗丙型肝炎病毒的研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)感染严重危害全人类健康,是主要的公共卫生问题之一.据估计全世界HCV阳性率为3%,大约有1.7亿的感染者[1].令人遗憾的是,到目前为止,市场上仍然没有安全、有效的疫苗或抗体来防止HCV感染.目前慢性HCV感染的标准疗法是联合使用聚乙二醇α干扰素和利巴韦林(ribavirin).然而,这种标准疗法的成功却取决于病毒的基因型和治疗之初病毒的载量,仅有约50%的患者会产生持续的病毒学应答,因而不能彻底根除病毒.此外,高昂的价格和严重的不良反应也限制了这种标准疗法的广泛使用.开发新型的、更加安全有效的抗病毒治疗方法具有时空紧迫性和重要现实意义.     

RNA干扰抑制土拨鼠肝炎病毒X基因表达

目的:研究土拨鼠肝炎病毒(WHV)序列特异性siRNA对WHV X基因表达的抑制作用。方法:以WHV全长质粒为模板PCR扩增WHV X基因,克隆到pXF3H载体构建WHX-HA融合蛋白真核表达质粒(pXF3H-WHx);合成siRNA的模板序列,克隆到siRNA表达质粒psiRNA构建shRNA表达质粒(psiWx1、psiWx2);质粒pXF3H-WHx与psiWx1、psiWx2共转染Hela细胞,Western blot检测WHV X蛋白的表达。结果:Hela细胞中WHVX蛋白的表达受siRNA的抑制,psiWx1表达的siRNA抑制90%以上的X蛋白表达,并呈剂量依赖性,但是WHV X基因靶位点中2个突变的核苷酸可使这种干扰作用消失。结论:质粒表达的siRNA序列特异性抑制WHV X蛋白的表达。     

丙型肝炎病毒核心蛋白与转位蛋白相互作用的研究

目的 本文为了探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白（core)在肝肿瘤中起作用的分子机制,研究核心蛋白是否与肿瘤相关蛋白的相互作用。方法 应用酵母双杂交系统3构建HCV核心蛋白诱饵质粒,转化酵母AH109后与含文库质粒的酵母Y187进行配合,在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选。筛选出30个克隆,对既能在四缺营养缺陷培养基上生长（SD／-Trp-Leu-His-Ade),又能在涂有x-α-gal的四缺培养平皿上长出蓝色菌落,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌后测序,进行生物信息学分析。发现一个可以引起染色体转位的基因即与肿瘤发生有关的基因转位蛋白基因（Translin)同源。为了进一步证实转位蛋白基因所表达蛋白能与HCV核心蛋白相互作用,网织红细胞裂解物进行体外翻译、蛋白之间的免疫共沉淀。结果 结果显示,转位蛋白不但在酵母双杂交中能与HCV核心蛋白相互作用,而且在体外翻译后也能相互作用。结论 HCV核心蛋白可以和转位蛋白相互作用,推测此蛋白可能在HCV致癌中起一定作用,部分解释了HCV引起肿瘤的发病机制。     

丙型肝炎病毒核心蛋白对核转录因子stat3活性的调控作用

目的:探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白对核转录因子stat3活性的调控作用。方法:将表达HCV核心蛋白的真核细胞表达质粒pcDNA3.1-core转染人源肝细胞系QSG7701,建立稳定表达HCV核心蛋白的细胞株QSG7701-core,利用免疫细胞化学、Western blot及凝胶电泳迁移实验（EMSA）等方法检测stat3的磷酸化及DNA结合活性。结果:在表达HCV核心蛋白的QSG7701细胞中,stat3的磷酸化水平明显低于空白质粒转染组和未转染组,而总stat3的表达水平3组无明显差别;核内磷酸化的stat3阳性信号明显减弱; stat3的DNA的结合活性明显低于空白质粒转染组和未转染组。结论:在人源永生化肝细胞系中HCV核心蛋白的表达可能具有抑制stat3的磷酸化和DNA结合活性的作用,从而抑制JAK/ stat3信号转导通路活化,这可能是HCV干扰素治疗效果不佳的原因之一。     

丙型肝炎病毒核心蛋白抑制肝癌细胞P16、P27的表达

目的：探讨HCV核心蛋白对肝瘤细胞P16、P27表达的影响。方法：将HCV核心基因cDNA插入真核表达载体PBK－CMV的Hind　Ⅲ和BamH I位点间，构建重组质粒PBK－HCVc。再将重组质粒PBK－HCVc和空载体分别导入肝癌细胞株HepG2中，G418筛选，RT－PCR、蛋白印迹鉴定HCV核心蛋白表达。免疫组化，蛋白印迹检测P16、P27蛋白表达；RT－PCR检测P16、P27mRNA。结果：重组质粒PBK－HCVc在HepG2细胞中有稳定表达；表达HCV核心蛋白的细胞HepG2-C的P16、P27在蛋白水平和mRNA水平较转染空载体的细胞HepG2-CMV明显下降。结论：HCV核心蛋白能抑制P16、P27表达，可能与肝细胞的癌变有关。     

丙型肝炎病毒核心蛋白活化NF—κB介导的信号传导途径

目的：研究丙型肝炎病毒核心蛋白（HCV core protein)致病作用的细胞内信号传导途径。方法：将入HCV核心蛋白cDNA克隆至载体pCNX2上,经基因测序及转染Cos-7细胞后检测核心蛋白表达等方法选出构建成功的pCN2-core重组质粒,用该质粒分别与环AMP反应分子（CRE）,血清反应因子（SRF）,血清反应分子（SRE）,活化蛋白－1（AP－1）及核转录因子κB（NF－κB）重组表达质粒共转染Hela细胞,通过检测转染后细胞内荧光素酶活性确定与核心蛋白作用的因子。结果：HCV核心蛋白可激活NF－κB介导的信号传导途径,且随着pCXN2-core转染量的增多,NF－κB被活化的程度也升高,两者呈剂量存关系。结果：HCV核心蛋白通过活化NF－κB介导的细胞内信号传导途径发挥其致病作用。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因的克隆及其高效表达

目的在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白基因片段。方法利用PCR技术，扩增出357bp的HCV核心蛋白基因片段，双酶切后将其插入到原核表达载体pET-32a，构建重组表达质粒pET-32a／HCVc。转化到大肠杆菌BL21中，IPTG诱导表达。SDS-PAGE鉴定表达情况，Western blot鉴定表达产物的抗原性。结果 经IPTG诱导后获得了目的蛋白的融合表达；SDS—PAGE电泳显示其在32000处有一条融和表达条带；Western blot结果显示其具有HCV抗原特异性。结论 HCV核心蛋白在大肠杆菌中获得高效表达，而且表达产物有良好的抗原性。     

丙型肝炎病毒单链RNA免疫活性的研究

目的 筛选丙型肝炎病毒(HCV)单链RNA(single strand RNA, ssRNA)序列中有效的免疫激活序列,并进一步确定与免疫激活序列特异结合的蛋白。方法 筛选并合成4条HCV ssRNA序列中的寡聚核苷酸序列(HCV-ORNs),通过ELISA法检测其诱导的细胞因子表达情况,确定有效免疫激活序列。然后通过改良型凝胶阻滞实验及质谱分析技术筛选与该序列特异结合的蛋白。结果 在4个HCV-ORNs中,ORNHCVtail可有效诱导细胞因子TNF-α、IFN-α升高(P<0.01)。与ORNHCVtail特异结合的蛋白条带经质谱鉴定共鉴定出83种蛋白,其中可能与HCV ssRNA激活免疫反应相关的蛋白包括:TLR3(Toll-like receptor 3),NLRC3(NLR family, CARD domain-containing 3),NLRC4(NLR family, CARD domain-containing 4,又称IPAF)。结论 成功筛选出HCV ssRNA序列中有效的免疫激活序列,并筛选出与其特异结合的蛋白,为HCV激活天然免疫反应的机制研究奠定了基础。     

丙型肝炎病毒核心蛋白生物学功能研究进展

目的：概述丙型肝炎病毒核心蛋白的主要生物学功能。方法：查阅并参考国外近年20多篇相关献资料。结果：综述了丙型肝炎病毒核心蛋白T、B细胞表位及对细胞周期的影响。结论：核心蛋白是丙型肝炎病毒疫苗研究的靶区域,与病毒持续性感染、肝细胞肝癌的发生密切相关,对其深入研究有助于探讨丙型肝炎病毒的致病机制及其防治。     

丙型肝炎病毒核心蛋白与JNK／SAPK信号转导通路

丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白是一种多功能的病毒核衣壳蛋白,对细胞信号转导途径具有明显作用,从而影响相关的靶基因。JNK／SAPK信号转导通路在细胞分化、细胞凋亡、应激反应以及多种人类疾病的发生与发展中起着至关重要的作用,是正常与疾病状态时细胞的一个重要调节靶点。     

Hepatitis C virus core protein inhibits RNA interference mediated by shRNA

目的 研究丙型肝炎病毒编码的蛋白对RNA干扰的抑制作用,筛选出有作用的RNA干扰抑制因子.方法 构建丙型肝炎病毒不同蛋白质的真核表达质粒,加入萤火虫荧光素酶基因的RNA干扰体系,共转染HeLa细胞,检测萤火虫荧光素酶活性以观察RNA干扰效果的变化,筛选出有作用的RNA干扰抑制因子.在针对内源性GFP的RNA干扰体系中进一步确证该种抑制作用.利用共转染方法观察该蛋白抑制RNA干扰的剂量效应关系、在不同细胞系中的作用以及对siRNA介导的RNA干扰是否有相同的拮抗作用.结果 加入核心蛋白后,萤火虫荧光素酶活性恢复到80％,与空白对照比较有显著性差异(P＜0.05).在绿色荧光蛋白RNA干扰体系中,核心蛋白使绿色荧光蛋白的表达强度明显增加.该种对抗RNA干扰的作用在HepG2、HEK293和HeLa细胞中均存在,且呈剂量依赖关系.在siRNA介导的RNA干扰体系中,加入核心蛋白后萤火虫荧光素酶活性无显著性变化(P＞0.05).结论 核心蛋白能够对抗shRNA介导的RNA 干扰作用,但不能对抗siRNA介导的RNA干扰作用,这种作用具有普遍性.核心蛋白对抗RNA干扰的作用可能有利于提高丙型肝炎病毒在宿主细胞内的生存能力并导致持续感染,亦可能在丙型肝炎病毒致病机制中发挥重要作用.     

丙型肝炎病毒核心蛋白对Dicer切割功能的影响

目的 探讨核心蛋白与Dicer的相互作用及其对Dicer功能的影响.方法 构建丙型肝炎病毒核心蛋白真核表达质粒,采用免疫荧光染色和Western blot检测核心蛋白的表达,Western blot检测核心蛋白对细胞内Dicer表达的影响,免疫共沉淀技术检测真核细胞内核心蛋白与Dicer的相互作用.体外转录合成dsRNA,检测核心蛋白对Dicer切割dsRNA作用的影响.结果 在细胞内,核心蛋白能够明显恢复被shRNA抑制的虫荧光素酶基因的表达(P＜0.05),而对siRNA引发的RNAi无拮抗作用.在真核细胞内,加入核心蛋白后,Dicer的表达量无明显改变,并能检测到两者相互结合.在体外抑制实验中,重组表达的Dicer能切割dsRNA产生siRNA;核心蛋白加入后,dsRNA的切割受到抑制.结论 核心蛋白在真核细胞内可以结合Dicer,并通过抑制Dicer对dsRNA的切割作用,抑制RNA干扰作用.     

丙型肝炎病毒核心蛋白对HePG2细胞增殖和细胞周期的影响

目的 观察核心蛋白对细胞增殖和细胞周期调控的影响。方法 观察表达HCV核心蛋白的细胞株HePG2-C和作为对照的细胞株HePG2-CMV的细胞形态;绘制细胞生长曲线;检测细胞周期;用流式细胞仪、免疫组化染色检测PCNA,P16,P27,P53;半定量RT－PCR检测P16,P27,P53mRNA。结果 转染重组质粒PBK－HVCC的HePG2-C细胞与转染空载体PBK－CMV的HePG2-CMV细胞相比细胞形态未见明显变化。生长曲线显示HePG2 细胞在转染PBK-HCVC和空载体PBK－CMV后,生长速度无明显变化。检测转染空载体的细胞HePG2-CMV 81.3%进入G0／G1期,7．7％进入S期;而转染PBK－HCV C的细胞HePG2-C73%进入G0／G1期,13．7％进入S期。在进一步分子机制的探讨中发现HePG2-C细胞PCNA、P53表达显著增加,P16、P27表达显著降低。 同样的变化也发生在转录水平。结论 HCV核心蛋白可能通过调节某些基因的转录与表达,增加细胞DNA合成,扰乱细胞周期,进而参与致癌过程。     

维生素E脂质体纳米颗粒转运siRNA抑制丙型肝炎病毒核心蛋白表达的实验研究

目的 研究携带针对丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)RNA的小干扰RNA(siRNA)的维生素E(Vitamin E)脂质体纳米颗粒在体外靶向抑制HCV复制的作用.方法采取“薄膜水化法”制备Vitamin E脂质体纳米颗粒,应用激光粒度分析仪测量纳米颗粒VE-DC/siRNA的颗粒大小及zeta电位,应用透射电子显微镜观察VE-DC形态及分散性.以Huh7.5.1细胞株作为载体.CCK-8法检测纳米颗粒的细胞毒性,琼脂糖凝胶电泳检测纳米颗粒携带siRNA的血清稳定性,蛋白印迹技术和免疫荧光技术检测该siRNA纳米颗粒的转染效率及对HCV的抑制作用.结果 Vitamin E脂质体纳米颗粒形态呈球形,粒度分布为(125.5-9.0)nm,zeta电位为(39.1±4.8)mV,分散均一.相较同浓度商品化脂质体,VE-DC/siRNA对细胞的毒性相对较小.血清稳定性实验显示,VE-DC/siRNA在24 h后siRNA无降解,较裸siRNA稳定性显著提高.携带siRNA的Vitamin E脂质体纳米颗粒可以较高效率进入Huh7.5.1细胞内,并抑制HCV核心蛋白的表达.结论 Vitamin E脂质体纳米颗粒可以转运siRNA至Huh7.5.1细胞,并抑制HCV核心蛋白的表达.     

小干扰RNA(siRNA)对小鼠乙型肝炎病毒复制和表达影响的实验研究

目的建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,并在此基础上观察小干扰RNA(siRNA)对小鼠乙型肝炎病毒复制和表达的影响。方法用水动力学方法,向小鼠尾静脉注射1.5倍的HBV真核表达质粒pHBV1.5建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染模型,明确感染后,再将其与针对乙型肝炎病毒核心区的siRNA表达载体(psiHBV4)共注射,于注射后第6天取血测血清HBsAg,HBeAg(MEIA),通过RT-PCR检测肝组织HBVC区mRNA转录子的水平。同时设立PBS对照组,空载体对照组和无关干扰对照组。结果注射后第6天血清中HBsAg,HBeAg在pHBV1.5感染组中高表达。psiHBV4干扰组中HBeAg的表达受到了明显的抑制,与感染组比较差异有显著性(P<0.01),RT-PCR显示肝内HBVCmRNA水平亦明显降低。而无关干扰对照组则无相应的干扰作用。结论RNAi能特异,高效的抑制小鼠体内HBV的复制和表达,同时通过水动力学方法,成功建立了小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,为进一步研究乙型肝炎病毒奠定了基础。     

慢病毒介导基于microRNA系统的HBs RNAi技术抑制HBV复制

目的:构建HBs基因RNAi慢病毒载体,观察其对HBV复制和抗原表达的作用。方法:针对已经筛选确定的HBs基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经MluⅠ和ClaⅠ酶切后的pGCLM-GFP载体连接产生慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用pGCLM-GFP、pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染包装细胞293T,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。培养HepG2.2.15细胞系,用慢病毒（MOI=1和MOI=10）对肝癌细胞进行感染,感染后细胞培养上清进行ELISA、Western印迹、HBV DNA定量分析。结果:PCR和测序结果证实,成功构建HBs shRNA的慢病毒载体。包装慢病毒后浓缩病毒悬液的滴度为5×108~2×109 TU /ml。慢病毒HBs RNAi后,对HBV复制和抗原表达的抑制作用显著。感染4 d后,抑制效应开始出现,一直持续到第9天,抑制效应达到高峰(P<0.05)。相对于阴性对照,HBs shRNA作用后细胞上清中HBsAg分泌量下降70％以上(P<0.05),而Western印迹和real-time PCR结果进一步证实了上述结果,在蛋白水平和mRNA水平都得到了进一步验证。经HBV DNA定量,发现慢病毒RNAi后DNA水平也显著下降(P<0.05)。结论:成功构建HBs基因RNAi慢病毒载体,以HBs基因为靶点的慢病毒介导的基于microRNA系统的RNAi技术能有效抑制HBV的复制和抗原表达。     

套式聚合酶链反应检测丙肝病毒核酸

对７０例血清谷丙转氨酶（ＡＬＴ）异常、疑是丙型肝炎（ＨＣＶ）患者血清标本，用ＨＣＶ基因５＇非编码区引物作套式聚合酶链反应（套式ＰＣＲ），扩增产物为２６０ｂｐ，结果显示５２例丙型肝炎病毒核酸（ＨＣＶ－ＲＮＡ）阳性，１８例阴性，阳性率为７４．２％。１０例助血员血样ＨＣＶ－ＲＮＡ均为阴性。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析，阳性ＰＣＲ产物为ＨＣＶ－ＲＮＡ所特异。作者认为，采用高保守区核苷酸序列引物作套式ＰＣＲ检测ＨＣＶ－ＲＮＡ，可提高实验的敏感性和特异性。     

丙肝病毒核心抗原检测在丙肝病毒感染诊断中的作用研究

目的探讨丙肝核心抗原检测在丙肝感染诊断中的作用。方法收集175例丙肝抗体检测标本同时检测HCVAb、HCV游离抗原、HCV总抗原、HCVRNA。结果 75例HCVAb阳性反应标本,检出HCV游离抗原阳性17例,HCV总抗原阳性54例,HCVRNA阳性50例;100例HCVAb阴性反应标本,检出HCV游离抗原阳性1例,HCV总抗原阳性2例,HCVRNA阳性1例。结论 HCV核心抗原是HCV早期感染的标志之一,检测HCV核心抗原有利于HCV感染的早期诊断。     

瞬时转染和稳定转染对RNAi抑制乙型肝炎病毒S基因表达的影响

目的:构建针对乙型肝炎病毒(HBV)S基因的siRNA表达载体Psuper-S1和Psuper-S2,观察瞬时转染及稳定转染对RNAi抑制HBV基因表达作用的影响.方法:设计并合成针对HBV S基因的siRNA寡核苷酸,经退火形成双链后克隆入Psuper载体,构建成功的siRNA表达载体分别瞬时转染和稳定转染表达HBV的2.2.15细胞,对所得细胞上清中的HBsAg和HBeAg进行定量检测,RT-PCR检测siRNA对靶基因Mrna的抑制效果,并比较两种转染方式对RNAi抑制HBV基因表达作用的影响.结果:在稳定转染并经潮霉素筛选所得的单克隆细胞株中,Psuper-S1和Psuper-S2均能明显抑制HBsAg及HBeAg的分泌(P<0.01),抑制率分别为83%和78%,RT-PCR结果证实HBV的Mrna明显降低,而瞬时转染细胞在蛋白质水平上及Mrna水平上的结果则比稳定转染的结果逊色.结论:针对HBV S基因的siRNA能稳定、高效、特异地抑制HBV基因的表达,转染效率对于靶基因的RNA干涉作用有明显的影响.