改良的胶原酶滑膜细胞分离培养法

目的 探讨一种改良的滑膜细胞培养法。方法 修剪、收集关节滑膜层,依次以胶原酶、０．２％胰蛋白酶、０．２％胰蛋白酶－０．０２％ＥＤＴＡＮａ２消化。１００目筛网过滤,Ｄ－ｈａｎｋｓ洗液网后培养,行显微镜、电镜、ＡＢＣ法免疫组化鉴定。结果 培养的细胞具有成纤维细胞样形态和特征,免疫组化染色显示ｖｉｍｅｎｔｉｎ阳性、ＣＤ６８阴性,纯度达９８％以上,符合Ｂ超滑膜细胞特点,结论 改良的胶原酶消化法是一种有效的     

改良组织块法培养细针活检滑膜组织成纤维样滑膜细胞

 【目的】 探讨体外分离培养细针活检滑膜组织成纤维样滑膜细胞(FLS)的方法｡【方法】 滑膜组织来自接受盲式细针滑膜活检术的活动期类风湿关节炎患者,分别采用消化酶培养法､组织块培养法和改良组织块培养法分离培养FLS｡采用台盼蓝染色进行细胞计数及活性鉴定,并应用倒置相差显微镜､透射电镜､免疫细胞化学染色､流式细胞术对第3 ~ 4代FLS进行鉴定｡【结果】 3种原代分离培养的方法均可成功培养出FLS｡台盼蓝染色示FLS细胞计数约(8.30 ± 1.65) × 105/瓶,活细胞百分率 > 95%｡传代可使FLS达到形态学上的纯化要求,倒置相差显微镜､透射电镜观察均符合FLS的形态结构特征,免疫细胞化学染色示Vimentin阳性､CD68阴性､CK阳性,流式细胞术检测示CD55+ 细胞占(95.34 ± 2.47)%｡改良组织块法培养FLS成功率较高,细胞游出时间较早,所需传代时间较短｡【结论】 改良组织块法特别适合于细针滑膜活检标本FLS的培养,第3 ~ 4代细胞的数目､活性及纯度符合进一步实验的要求｡     

Ⅰ型胶原酶消化组织块法体外培养人牙髓细胞

目的 建立利用Ⅰ型胶原酶消化组织块体外培养人牙髓细胞方法。方法 通过组织块Ⅰ型胶原酶消化法进行人牙髓细胞体外培养，免疫细胞化学法鉴定细胞组织来源，进行细胞传代，酶组织化学法对体外复层生长的人牙髓细胞爬片进行碱性磷酸酶组织化学染色，并检测其矿化能力。结果 采用Ⅰ型胶原酶消化组织块法体外培养的原代牙髓细胞，在第15～20d出现汇合，第4～6代牙髓细胞在连续培养后具有复层生长特性，并具有显著的碱性磷酸酶活性．阳性染色强弱部位呈区域性分布，连续培养的牙髓细胞可形成矿化结节。结论 Ⅰ型胶原酶消化组织块法可以很好地进行人牙髓细胞体外培养，可以用酶组织化学法研究牙髓细胞的生物学特性。     

改良组织块法分离培养兔成纤维样滑膜细胞

目的通过改良组织块细胞培养法,建立一种简单,可行的兔成纤维样滑膜细胞体外培养方法。方法无菌条件下取正常兔膝关节滑膜组织,剔净后剪成碎块,用灭菌滤纸吸掉组织上附着的水分,碎片接种于培养皿,观察细胞生长状况及形态特征。取第3代对数期细胞,用CCK-8法绘制其生长曲线,并用免疫荧光法检测波形蛋白的表达情况。结果体外培养的兔成纤维样滑膜细胞形态为长梭形纤维样,细胞生长力较旺盛,生长曲线为典型的"S"型,免疫荧光检测显示第3代细胞强表达波形蛋白。结论改良组织块法可以分离培养出兔成纤样维滑膜细胞,方法简便,成功率高,满足实验要求。     

胶原酶分离成骨样细胞

0 引言关于成骨样细胞的分离及其体外培养或经生物材料负载进行成骨细胞移植的报道很多,并且取得了一定的成果. 目前,分离成骨样细胞应用最多的方法是酶消化法,其中又以胶原酶的应用最常见. 该法关键是掌握好酶的用量及消化时间,否则可能引起细胞的损伤,失去一些膜受体,影响细胞功能. 如何选择合适的酶浓度及消化时间,国内外学者报道不尽相同,为了获得成骨样细胞的最佳分离效果,我们进行了如下实验.     

大鼠胸主动脉平滑肌细胞胶原酶解法培养与鉴定

目的 探讨复合胶原酶解离大鼠胸主动脉的原代细胞培养方法 及其生长特性.方法 0.2%Ⅰ型胶原酶和0.2%Ⅱ型胶原酶解离大鼠胸主动脉平滑肌,用相差显微镜观察其生长情况,免疫组化鉴定平滑肌细胞的纯度.结果 24h内细胞贴壁生长,1周左右细胞可传代,传代后细胞呈典型的"峰-谷"样生长,第3代细胞用α-actin染色鉴定平滑肌细胞,其纯度为96%.结论 复合胶原酶解离法原代细胞培养是一种简单、周期短、纯化速度快的方法 ;可作为一种可靠的细胞模型.     

人滑膜细胞的体外培养,分离和纯化

采用“组织悬块一次吸入摇匀法”进行细胞培养及“多次消化传代，反复贴壁法”来分离、纯化人滑膜细胞，达到形态学上的纯化要求，减少了操作步骤和污染的机会，为滑膜病理研究提供了一个有力的工具。     

一种新的佐剂性关节炎兔成纤维样滑膜细胞分离培养法

目的 采用悬浮组织块法建立一种新的、操作简单的佐剂性关节炎新西兰大白兔模型成纤维样滑膜细胞体外分离培养法。方法 选择健康新西兰大白兔16只,随机分为2组：正常组和模型组,每组8只。对模型组多点多次注射弗氏完全佐剂制备佐剂性关节炎模型,取膝关节滑膜组织,分别采用悬浮组织块法、组织块贴壁法分离培养佐剂性关节炎兔成纤维样滑膜细胞,观察细胞生长状况及形态特征,用CCK-8法检测细胞活力,免疫荧光法鉴定波形蛋白的表达情况。结果 模型组兔足跗关节及足趾部较正常组明显肿胀,解剖兔足趾部后肉眼可见模型组伴有明显的微血管增生和炎症。H-E染色结果显示,正常组兔膝关节滑膜细胞呈串珠样规则排列,而模型组滑膜细胞排列紊乱,提示佐剂性关节炎新西兰大白兔模型制备成功。悬浮组织块法和组织块贴壁法操作所需时间分别约为25 min、1 h,分离所得细胞的形态、活性相似,波形蛋白阳性率分别为98.01%、98.35%。结论 悬浮组织块法可成功分离培养出佐剂性关节炎兔成纤维样滑膜细胞,操作简单,所需时间短。     

改良组织块法分离培养佐剂性关节炎兔成纤维样滑膜细胞

目的 通过改良组织块细胞培养法,建立一种简单、可行的佐剂性关节炎兔成纤维样滑膜细胞(FLS)体外培养方法并观察细胞生物学特性.方法 通过注射弗氏完全佐剂建立关节炎模型,无菌条件下取佐剂性关节炎兔膝关节滑膜组织,剔净后剪成碎块,用灭菌滤纸吸掉组织上附着的水分,碎片接种于培养皿,观察细胞生长状况及形态特征.取第3代对数期细胞,用噻唑蓝(MTT)法绘制其生长曲线,并用免疫荧光法检测波形蛋白的表达情况.结果 体外培养的佐剂性关节炎兔FLS形态为长梭形纤维样,符合FLS的生长特征,免疫荧光检测显强表达波形蛋白.结论 改良组织块法可以分离培养出兔佐剂性关节炎成纤样维滑膜细胞,方法简便,成功率高,满足实验要求.     

人类关节滑膜A型和B型细胞的分离和体外培养

目的建立一种有效分离、培养高纯度人类关节滑膜Ａ、Ｂ型细胞的方法。方法胶原酶和胰蛋白酶联合消化人关 节滑膜组织碎片,细胞悬液经 １２０目筛网滤过,与 ＣＤ１４ ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ混合孵育后通过磁性 ＭＡＣＳ分离柱收集非粘附细 胞及粘附细胞进行培养。用光镜、电镜、细胞免疫化学、流式细胞仪法鉴定该两种细胞类型。结果分离培养的滑膜细胞 纯度达９８％以上;粘附细胞具有巨噬细胞的特性,抗ＣＤ６８、ＣＤ１４阳性,符合巨噬细胞样滑膜细胞（Ａ型细胞）的特征; 非粘附细胞具有成纤维细胞的特性,抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ阳性,符合成纤维细胞样滑膜细胞（Ｂ型细胞）的特征。结 论胶原酶和胰蛋白酶联合消化,兔疫磁柱法是一种确切有效的分离人类关节滑膜Ａ、Ｂ型细胞的方法。     

原代人脐静脉内皮细胞分离和培养方法的改进

目的建立一套高效、方便、可靠的脐静脉内皮细胞的体外分离和培养方法。方法取剖腹产新生婴儿脐带,加入Ⅰ型胶原酶消化分离人脐静脉内皮细胞,内皮专用培养基EGM-2培养传代。应用相差显微镜观察细胞形态。DiL-Ac-LDL染色证实细胞具有内皮功能。免疫荧光染色证明新分离细胞表达FⅧ相关抗原。流式细胞仪检测细胞表面表达CD31。结果原代培养细胞培养10～15d左右长成单层,细胞呈多角形,铺路石样排列。DiL-Ac-LDL染色阳性,证实细胞具内皮吞噬功能。免疫荧光检测证明细胞特异性表达FⅧ相关抗原。流式细胞仪检测证明细胞表面高表达CD31。结论通过酶灌注法消化脐静脉血管获得细胞,操作简便、高效,EGM-2培养基可保证内皮细胞具有较高纯度,细胞形态学观察和细胞生物学鉴定证明获得人脐静脉血管内皮细胞。     

SD大鼠肝枯否细胞分离培养的改良方法与鉴定

目的枯否细胞(Kupffer cells,KC)是肝内巨噬细胞群,活化的KC参与多种生物、病理学反应过程。然而,KC分离、培养技术进展缓慢。为研究KC致炎、抗炎活化机制,旨在建立经济、简便、有效、稳定分离培养SD大鼠肝KC的方法。方法选用健康雄性SD大鼠,采用0.05%IV型胶原酶灌注肝,经25%和50%percoll密度梯度离心,提取肝KC。荧光显微镜下观察细胞自发荧光情况,锥虫蓝拒染实验鉴定细胞活力,倒置显微镜下观察KC培养过程中细胞形态变化,吞噬墨水、latex珠实验以及免疫细胞化学染色法鉴定细胞纯度。结果大鼠肝KC得率为(3.22±0.31)×107(n=24),细胞活力为(92.35±0.13)%,细胞纯度均在(94.62±0.24)%。结论该方法简单、可行,为进一步研究KC功能和作用机制奠定基础。     

改良组织块法培养SD大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞

目的应用改良植块法体外培养大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞。方法15只SD雄性大鼠,随机分成3组,每组5只,分别采用组织块法、酶消化法及改良组织块法分离大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,在含双抗及20%胎牛血清DMEM,37℃、5%CO2、95%空气的细胞培养箱静置中培养,相差显微镜观察细胞形态及扩增情况,用α-平滑肌肌动蛋白(a-SM-Actin)及结蛋白(desmin)免疫组织化学染色,鉴定细胞类型。结果α-平滑肌肌动蛋白在阴茎海绵体平滑肌细胞阳性率为96.3%,在成纤维细胞中阳性率为23.8%,结蛋白在阴茎海绵体平滑肌细胞阳性率为74.4%,在成纤维细胞中呈阴性。三组间结蛋白阳性细胞率具有显著差异,改良组织块法组结蛋白阳性细胞率高于组织块法和酶消化法组。结论结蛋白是鉴定海绵体平滑肌细胞的特异性指标,改良组织块法可获纯度更高、结构和功能良好的阴茎海绵体平滑肌细胞。     

改良人牙龈上皮细胞原代培养方法

目的：建立稳定的人牙龈上皮细胞的原代培养方法,为牙周组织的细胞学研究提供可靠的细胞来源,对原有的原代培养方法进行了改良,期望达到培养成功率高、原代培养时间短且操作简便的效果。方法： 选择行“冠延长术”的牙周相对健康者9人,取冠延长术切除的领圈牙龈组织进行牙龈上皮细胞的原代培养,培养方法包括改良酶消化法和组织块法。改良酶消化法使用2.5 g/L DispaseⅡ酶（Ⅱ型分离酶）浸泡组织块过夜,将上皮与结缔组织分离,再用0.025%（质量分数）不含EDTA（乙二胺四乙酸）的胰蛋白酶静置消化上皮碎片10 min,不弃去上皮碎片直接离心并重悬细胞,不仅降低了酶的消化浓度,减少了消化时间,还简化了重悬细胞的过程;组织块法相对以往方法并无改良。观察两种方法所培养原代细胞的生长过程,在培养成功后对细胞进行免疫细胞化学染色鉴定,并比较两种方法的成功率和培养时间。结果： 改良后的酶消化法能够比较快地培养出细胞特征明确的人牙龈上皮细胞,成功率达88.9%,且细胞成片状生长,10~14 d后可传代,传至3代后细胞形态逐渐不规则直至凋亡,而组织块法原代培养成功率虽然相同,但时间更长,17~22 d后才可传代。经免疫细胞化学染色,角蛋白染色阳性。结论： 改良酶消化法能够快速培养出原代人牙龈上皮细胞并传代,可作为细胞学研究的稳定细胞来源。     

白藜芦醇诱导佐剂性关节炎大鼠滑膜细胞凋亡

目的：探讨白藜芦醇对佐剂性关节炎( AA)大鼠滑膜细胞增殖和凋亡的影响。方法0．1 ml弗氏完全佐剂注射SD大鼠左后足跖皮内复制AA模型,28 d后,采用组织块培养法分离、培养大鼠踝关节滑膜细胞, CCK-8法检测白藜芦醇对滑膜细胞增殖的影响;Hoechst 33258荧光染色、琼脂糖凝胶电泳观察滑膜细胞凋亡情况。结果 CCK-8法表明白藜芦醇可以抑制滑膜细胞增殖,并且呈剂量依赖性趋势;高浓度白藜芦醇(20、50μmol/L )能诱导滑膜细胞凋亡, Ho-echst 33258染色观察到细胞核出现凋亡小体,电泳呈现出阶梯状条带。结论白藜芦醇可能会通过抑制AA大鼠滑膜细胞的增生,促进滑膜细胞的凋亡而达到治疗类风湿性关节炎的作用。     

培养细胞超薄切片制备方法改进

目的探讨培养细胞超薄切片的制备方法。方法取肝癌患者手术标本进行原代培养后分为常规组和改良组,比较2组培养细胞的超微结构特征。结果常规组细胞结构模糊,有大量细胞自溶、皱缩和挤压现象。改良法超薄切片显示细胞结构清晰可见,自溶及皱缩现象少。结论改良法能更好地显示细胞的超微结构,是制备培养细胞超薄切片的好方法。     

一种肠肌间神经丛胶质细胞无血清原代培养法的建立

目的 肠胶质细胞（enteric glial cell,EGC）在肠道多种生理及病理过程的调节中发挥重要作用,为了深入研究EGC的功能,排除在体及组织水平中神经体液因素的影响,获得一种简便高效的原代EGC分离培养方法非常必要。方法 取小鼠结肠纵行肌-肌间神经丛组织,经消化分离肠胶质细胞,采用含血清和无血清培养基交替培养法去除成纤维细胞后常规传代;运用细胞免疫荧光染色法检测原代EGC纯度;运用胞内钙成像技术实时观察EGC内Ca²⁺浓度（[Ca²⁺]i）变化以检测细胞活性。结果 每次实验获得的EGC至传代前细胞量可达约6.8×10⁵;无血清培养后成纤维细胞污染显著降低;胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）阳性的EGC占细胞总数的98.44%±1.07%,钙结合蛋白S100β阳性EGC占93.61%±3.16%,GFAP与S100β双阳性EGC占93.09%±2.99%;96.00%±4.00%的细胞在ATP诱导下发生胞内钙瞬变。结论 结合无血清培养可有效去除成纤维细胞污染,得到纯度较高、活性较好的肌间神经丛EGC。     

一种高选择性、高效的牛视网膜微血管内皮细胞培养方法

目的 建立一种高效、可行、特异性高的牛视网膜微血管内皮细胞(BREC)培养方法.方法 取新鲜牛眼,分离视网膜并用DMEM进行冲洗、匀浆剪碎,过75μm筛,将滤网上滤渣转移至50 ml离心管,用I型胶原酶、DNaseI及蛋白酶等多种酶混合液消化20 min,人血清中和后,过46μm网筛并冲洗,离心5 min,将组织扣在培养皿中,转入15 ml离心管,用10％人血清含生长因子ECGS的DMEM培养液培养于25 cm2,选择性培养视网膜血管内皮细胞,接种于明胶包被培养瓶中,采用ECGS配合肝素培养液促进内皮细胞生长,观察细胞形状生长特性,并用免疫化学荧光方法进行鉴定.结果 选择性培养视网膜微血管内皮细胞成单层、镶嵌铺路石状生长,Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测为阳性纯度均大于95％以上,将细胞种在凝固的基质胶表面,12～18 h形成官腔结构.结论 本方法过程简单、可靠,培养的内皮细胞纯度高,生长状态良好,稳定传代,为视网膜血管生成疾病研究建立了模型.