人可溶性TRAIL cDNA的克隆及新型原核表达载体的构建

目的 克隆人可溶性TRAIL（sTRAIL)cDNA并构建其原核表达载体，为制备新型抗癌分子创造条件。方法 提取HL－60细胞总RNA，经RT－PCR扩增编码人TRAIL114－281氨基酸残基的cDNA序列，将其克隆至pUC19进行序列测定，然后构建于新型原核表达载体pQE-80L中。结果 RT－PCR扩增得到了504bp的DNA片段，序列分析表明与GeneBank中报道的编码人TRAIL 114－281氨基酸残基的cDNA序列安全一致。结论 sTRAIL cDNA的克隆及其原核表达载体的构建，为进一步制备具有抗肿瘤活性的sTRAIL奠定了基础。     

肿瘤抗原基因MAGE-3的克隆、原核表达与纯化

目的: 克隆人MAGE-3基因并进行原核表达和分离纯化. 方法: 通过RT-PCR从人黑色素瘤细胞株中扩增MAGE-3全长cDNA,经PCR扩增MAGE-3基因3′端324 bp片段,克隆入pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达质粒pGEX/MAGE-3,对含有该质粒的大肠杆菌DH5α进行诱导表达和分离纯化.结果: 经RT-PCR扩增出大小约950 bp的基因片段,以此为模板经PCR扩增出约320 bp片段,测序结果与GenBank公布的MAGE-3序列一致,成功构建了pGEX/MAGE-3原核表达质粒,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达Mr约42 000的GST融合蛋白,纯化的蛋白纯度为89%.结论: 成功克隆了人MAGE-3基因全长cDNA并对其3′端324 bp片段编码的108个氨基酸的蛋白进行了原核表达和分离纯化,为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础.     

Eotaxin原核表达载体的构建及初步表达

目的：获得人嗜酸性粒细胞趋化因子Eotaxin基因，构建其原核表达载体，并初步表达成熟的Eotaxin，为进一步构建其N-端突变体，检测其生物学活性作准备。方法：提取外周血单个核细胞细胞总RNA，经RT-PCR扩增编码人Eotaxin全长cDNA序列，并将其克隆至T载体进行序列测定，然后构建于原核表达载体pET30a^＋中，并转入大肠杆菌表达。结果：RT-PCR扩增得到了400bp左右的DNA片段，序列分析发现其中包含了GenBank中报道的编码EotaxincDNA序列，并获得了正确表达。结论：EotaxincDNA的克隆及其原核表达载体的构建及表达，为进一步构建其N-端突变体，纯化和检测其生物学活性奠定了基础。     

人β-防御素3的cDNA克隆和表达载体的构建

目的 克隆人β-防御素3(hβD-3)cDNA并构建其原核表达载体，为更深入的抗菌肽活性研究及制备新型肽类抗生素创造条件。方法 从人扁桃体组织中提取总RNA，经RT-PCR扩增编码hβD-3成熟肽的cDNA序列，将其克隆至pUC18载体进行序列测定，然后构建于新型原核表达载体pQE-80L中。结果 RT-PCR扩增得到约135bp的目的DNA片断，序列分析与GenBank中报道的编码hβD-3成熟肽的cDNA序列完全一致。结论 hβD-3eDNA的克隆和原核表达载体的构建，为进一步制备抗耐药菌的肽类抗生素奠定了基础。     

十二指肠钩虫金属蛋白酶组织抑制剂同源物Ad-TIMPL-1基因克隆及其原核表达

目的克隆十二指肠钩虫金属蛋白酶组织抑制剂同源物(TIMPL)Ad-TIMPL-1基因并进行原核表达。方法分别用3’RACE及RT-PCR技术从十二指肠钩虫成虫cDNA中扩增编码Ad-TIMPL-1的cDNA3’末端及5’末端序列;序列经拼接后进行初步生物信息学分析;将Ad-TIMPL-1成熟肽编码序列克隆至原核表达载体pET-32a,构建重组表达质粒;重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达情况。结果成功克隆获得了编码Ad-TIMPL-1的全长cDNA序列并登记到GenBank(accession no.EF495071);Ad-TIMPL-1完整阅读框为396bp,编码132个氨基酸残基组成的蛋白,含16个氨基酸残基组成的信号肽;成功构建了原核表达重组质粒pET-32a/Ad-TIMPL-1,并在大肠杆菌中得到了表达。结论本研究首先从十二指肠钩虫中克隆到了Ad-TIMPL-1基因并进行了原核表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

人TNFRI cDNA的克隆及酵母表达载体的构建

本实验利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)以人单核淋巴细胞系U937细胞总RNA为模板,扩增出人TNFRI型受体胞外区约224个氨基酸残基的cDNA序列,将此片段为模板,采用剿式PCR技术扩增出编码TNFRI胞外区约180个氨基酸的DNA序列,将其克隆于载体PDM18-T进行序列测定,随后构建于新型酵母表达载体PGBKT7-DNA-BD,为进一步通过酵母双杂交获得拮抗TNFRI的具有生物学活性的多肽奠定了基础.     

RT-PCR一步法克隆人肝再生增强因子基因

目的 采用RT－PCR一步法，克隆人肝再生增强因子（hALR）编码序列。方法 按文献报道人肝再生增强因子核苷酸序列合成引物，提取人胎肝组织总RNA，利用一步RT－PCR法扩增人肝再生增强因子编码区基因；将PCR扩增片断克隆到pBV221质粒，构建原核表达载体。结果 获得长约400bp的hALPcDNA编码区基因，序列分析表明与文献报道一致。结论 通过RT－PCR一步法成功克隆人肝再生增强因子基因，为制备人ALR基因工程产品及研究其多种生物学作用奠定了基础。     

Bal b／c小鼠甘露聚糖结合凝集素—C基因的克隆与鉴定

目的：获得小鼠甘露聚糖结合凝集素－C（MBL－C）基因的全长编码区cDNA。方法：利用RT－PCR方法，从Balb/c小鼠的肝细胞中分离出MBL－C基因cDNA片段，将其克隆入PUC－T载体并测序，对基因结构及其与人MBL基因的同源性进行比较分析。结果：扩增得到的Bal b/c小鼠MBL－C基因cDNA全长735bp，编码245个氨基酸残基，包含了完整的编码区基因序列，经核苷酸序列比较分析发现，扩增得到的Bal b/c小鼠BL－C基因与Genbank中发表的序列具有100％的同源性，与人的MBL基因的同源性为71．4％。结论：成功地克隆到完整的Bal b/c小鼠MBL－C编码区基因，为进一步在整体水平研究MBL分子的天然免疫功能提供了必要的条件。     

人全长TALL-1在大肠杆菌中的表达

目的在克隆人TALL-1(TNF- and apoptosis ligand-related leukocyte expressed ligand 1)全长 cDNA的基础上,用大肠杆菌进行表达并鉴定其生物学活性.方法采用RT-PCR技术,从HL-60细胞中扩增编码人TALL-1的cDNA,克隆于高效原核表达载体pQE-80L中,以IPTG诱导表达,Ni-NTA层析纯化后,进行生物学活性检测.结果 RT-PCR扩增得到了858 bp的DNA片段,测序结果与GenBank中报道的编码TALL-1的cDNA序列一致,并在大肠杆菌中获得了高效表达,活性检测发现它能抑制U937细胞的生长.结论成功克隆了人TALL-1全长cDNA,并获得了高效表达及纯化,纯化产物具有生物学活性,这为进一步的功能研究及临床应用奠定了基础.     

人神经营养因子NT3-cDNA基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的：克降人NT3cDNA基因，构建pIRES2-EGFP-NT3。方法：用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法从人新鲜的肝脏手术标本提取总RNA，并经反转录PCR获得NT3-cDNA。将质粒pUC19双酶切并纯化回收大片段，与纯化后的NT3-cDNA连接构成pUC-NT3-cDNA，转化大肠杆菌XL10，挑选白色克隆作酶切鉴定、测序。将测序正确pUC-NT3-cDNA及pIRES2-EGFP分别双酶切，前者回收774bp的片段并纯化，后者纯化回收大片段，将回收的774bp片段与纯化的大片段连接成pIRES2-EGFP-NT3，转化大肠杆菌XL10，挑选白色克隆作PCR及双酶切鉴定。结果：成功地从人的肝脏组织中克隆了NT3-cDNA，并构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3。结论：重组质粒pIRES2-EGFP-NT3的构建为进一步NT3基因转染致聋豚鼠耳蜗试验奠定了基础。     

人白细胞介素-10 cDNA的克隆、测序和真核表达载体的构建

目的 克隆、测序人白细胞介素－10 cDNA开放阅读框架。方法 刀豆蛋白A活化的人外周血核细胞培养后用于提取总RNA,以随机引物行逆转录反应合成hIL-10 cDNA第一链,并以hIL-10 特异性引物行PCR扩增,将PCR产物克隆至pUC18中测序并构建真核表达载体pcDNA3.1hIL-10。结果 PCR扩出550bp特异性片段,经克隆至pUC18后测序表明序列同源性与GenBank报道完全一致,并克隆鉴定了真核表达载体pcDNA3.1hIL-10。结论 成功克隆了人白细胞介素－10 cDNA开放阅读框架,序列分析证实与ＧenBank录入序列同源性达１００％,并成功构建了真核表达载体pcDNA3.1hIL-10。     

人S-腺苷蛋氨酸脱羧酶α亚基的克隆、表达与纯化

目的：构建人S 腺苷蛋氨酸脱羧酶(SAMDC)的α亚基的原核表达载体，诱导该质粒在大肠杆菌中表达并纯化表达的重组蛋白。方法：从大肠癌细胞中提取总RNA，RT PCR方法扩增人SAMDCα亚基的cDNA片段801?bp，经TA克隆及亚克隆方法构建原核表达载体pTriEx 4 SAMDC α。将重组表达质粒转化入E.coli JM109(DE3)中，经IPTG诱导表达，SDS PAGE电泳和Western blot鉴定表达蛋白，并通过6×His•Tag，利用亲和层析法纯化表达的融合蛋白。结果：酶切鉴定和DNA测序显示，人SAMDC α亚基的cDNA片段成功插入表达载体pTriEx 4且方向正确，SDS PAGE电泳显示表达出32kD的外源蛋白。Western blot检测结果显示，表达出的蛋白为6×His•Tag的融合蛋白，且Ni NTA亲和层析法纯化了该重组蛋白。结论：成功构建、表达且纯化了重组SAMDC α亚基，为制备抗SAMDC抗体、研究SAMDC基因与结直肠肿瘤的关系提供了必要的工具。     

大鼠内皮抑素cDNA的克隆与鉴定

目的获取大鼠内皮抑索的cDNA片断，并构建融合蛋白的原核表达载体。方法以大鼠脑组织总RNA为模板，采用RT—PCR法从中扩增内皮抑素基因。并将获得基因重组入pThiohis表达载体，重组子经双酶切、PCR及测序鉴定。结果从大鼠脑组织中成功扩增内皮抑素的cDNA片断，并将其克隆入pThiohis载体，经双酶切、PCR及测序鉴定，产物大小及基因序列与预期值相符。结论成功构建大鼠内皮抑素基因的重组克隆pThiohis-Endo。     

小鼠BPI_(36-259)抗菌蛋白在原核细胞中的表达及其抗血清的制备

目的采用原核表达系统获得小鼠BPI36-259目的抗菌蛋白,免疫家兔制备目的蛋白特异性抗血清。方法利用生物信息学方法预测小鼠BPI功能片段,构建pUC57-muBPI1-281质粒;PCR扩增获得mu BPI36-259基因片段,构建pET28a-mu BPI36-259重组质粒;用IPTG诱导重组质粒转化的E.coli BL21(DE3)感受态细胞,获得以包涵体形式表达为主的mu BPI36-259目的蛋白;用变性目的蛋白免疫家兔获得兔抗鼠BPI36-259蛋白特异性抗血清;用间接ELISA法检测血清抗体特异性及其效价。结果成功构建了pET28a-mu BPI36-259重组质粒,转化E.coli BL21(DE3)获得以包涵体表达形式为主的目的蛋白;用变性目的蛋白免疫家兔获得小鼠BPI36-259蛋白特异性抗血清(效价1∶10000)。结论在原核细胞中成功获得了以包涵体表达形式为主的抗菌蛋白,免疫家兔获得的特异性抗血清可用于小鼠BPI36-259目的抗菌蛋白的检测。     

人脑胶质细胞来源神经营养因子基因的克隆及测序

为研究人脑胶质细胞来源的神经营养因子（ｇｌｉａｌｃｅｌｌｌｉｎｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ, ＧＤＮＦ） 在神经系统疾病中的作用,根据ＧＤＮＦ 的ｃＤＮＡ 序列设计并合成引物,以流产胎儿脑组织为来源,分别提取ＲＮＡ 和基因组ＤＮＡ 作模板,经ＲＴ ＰＣＲ 和ＰＣＲ 技术扩增人ＧＤＮＦ 基因片段,采用ＤＮＡ 重组技术将其克隆于ｐＧＥＭ Ｔ Ｅａｓｙ 载体中并测序。结果：ＲＮＡ 和基因组ＤＮＡ 体外扩增得到的片段均是４１０ ｂｐ ,两者无差异。ＰＧＥＭ ＧＤＮＦ 经酶切鉴定正确,测序结果与Ｇｅｎｅｂａｎｋ 比较基本相同。由于ＲＮＡ 和基因组ＤＮＡ 扩增得到的片段大小相同,证实该基因片段内无内含子插入,该片段可用于真核及原核表达。     

利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒

目的:利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒,为制备PEP-1-CAT融合蛋白进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定基础。方法:设计并合成两端分别带SalⅠ和BglⅡ酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT全长cDNA。将扩增的CAT cDNA与dATP反应,利用Taq DNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CAT cDNA的3′末端加"A"并纯化,然后应用TA克隆策略将纯化后的CAT cDNA插入至中间载体pGEM-T Easy Vector中,经PCR、限制性酶切分析鉴定重组子pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核苷酸,两端分别引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1,然后酶切鉴定。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经SalⅠ-BglⅡ和XhoⅠ-BamHⅠ双酶切,利用同尾酶(SalⅠ与XhoⅠ,BglⅡ与BamHⅠ)能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CAT cDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。结果:获得pET15b-PEP-1-CAT重组子,经测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CAT cDNA序列一致。结论:pET15b-PEP-1-CAT的成功构建为产生融合蛋白H is tag-PEP-1-CAT进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定了基础。