结核分枝杆菌和牛分枝杆菌TaqMan荧光PCR检测的建立

目的对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌分别建立荧光PCR快速检测方法。结核分枝杆菌荧光PCR对H37Rv标准菌株、结核分枝杆菌临床分离株的检测结果呈典型阳性反应，牛分枝杆菌荧光PCR对牛分枝杆菌标准菌株、BCG菌株的检测结果呈典型阳性反应，对其它分枝杆菌菌株以及常见微生物样品为阴性反应。两种荧光PCR对对应阳性重组质粒模板的检测灵敏度可达单个基因拷贝，对结核分枝杆菌或BCG标准菌株的检测灵敏度可达单个菌细胞。对临床样品的检测结果显示，荧光PCR对模拟感染奶样、血样的检测灵敏度可达单个菌细胞。所建立的方法，全过程包括血样、奶样、痰液等临床样品的前处理、核酸提取和荧光PCR检测，可在5～6h内完成。采用上述荧光PCR方法从临床采集的疑似病人痰液中检出多份结核分枝杆菌阳性样品。     

利用PCR技术检测537份新疆结核病人痰标本中的结核分枝杆菌

目的 提高聚合酶链反应在检测人结核分枝杆菌中的特异性和敏感性。方法 在聚合酶链反应中对4种DNA片段即结核杆菌特异插入列IS6110,IS1081,和16SrRNA,65kDa摸板进行了比较;为获取较多的细菌DNA,临床痰标本处理采用了国际标准化方法主要包括用一定量的N－乙酰－L半胱胺酸和氢氧化钠处理痰标本;改进了RCR混和液的成份即添加了甘油,dUTP－尿嘧啶糖基化酶。结果 选择IS6110作为结核杆菌特异性摸板用于检测细菌DNA,制备出了6批人结核杆菌PCR检测试剂盒,在对来自新疆结核病研究所的537份痰标本的检测中发现,谝试剂盒检测的特异性为65.97%,敏感性为93.53%。结论 改良TB－PCR试剂盒显示有较高的敏感性,特异性还有待于进一步完善,该试剂盒在临床诊断中有一定的价值。     

噬菌体生物扩增法检测痰结核分枝杆菌的临床研究

目的评价噬菌体生物扩增(PhaB)法检测痰中结核分枝杆菌的应用价值。方法分别应用PhaB法、直接涂片法、集菌涂片法和BACTECMGIT960快速培养法检测2005年8月至10月沈阳市胸科医院53例疑诊肺结核患者痰标本中结核分枝杆菌,并对检测结果进行比较。结果PhaB法、直接涂片法、集菌涂片法、BACTECMGIT960快速培养法检出阳性标本数分别为24,11,17和22份;以培养结果为评价标准,PhaB法的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为86.4%,83.9%,79.2%和89.7%;集菌涂片法和PhaB法联合检测的敏感性为90.9%,特异性为83.9%,阳性、阴性预测值分别为80.0%和92.9%。结论PhaB法检测痰中结核菌操作简便,具有较高的敏感性和特异性,可作为临床结核分枝杆菌的快速检测方法;PhaB法联合集菌涂片法进行检测可进一步提高敏感性,减少漏诊率。     

实时定量PCR技术检测结核分枝杆菌蛋白编码基因表达水平研究

目的运用实时定量PCR(qRT-PCR)检测66株结核分枝杆菌蛋白编码基因(fbpB,psts1,mpt64)的表达水平,探讨结核分枝杆菌耐药菌株与敏感菌株,北京基因型菌株与非北京基因型菌株的蛋白抗原在转录水平的差异。方法根据GenBank提供的序列,设计特异性引物,扩增目的基因片段,克隆入载体,重组质粒经纯化及梯度稀释,应用qRT-PCR检测基因的表达水平。结果北京基因型菌株psts1基因表达水平与非北京基因型菌株比较差异有统计学意义(t=3.721,P<0.01);耐药菌株mpt64基因表达水平与敏感菌株比较差异有统计学意义(t=3.951,P<0.01)。结核分枝杆菌活菌的扩增曲线呈典型的S型,结核分枝杆菌死菌和非结核分枝杆菌呈水平直线,未检测到荧光信号。结论北京基因型结核分枝杆菌psts1基因的表达量低于非北京基因型,结核分枝杆菌耐药菌株mpt64基因的表达量低于敏感株。     

PCR—SSCP技术快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究

目的 应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌ｒｐｏＢ基因突变,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平（ＲＦＰ）耐药性的意义。方法 以结核分枝杆菌Ｈ３７Ｒｖ为对照、５０例耐ＲＦＰ（单耐和多耐）结核分枝杆菌临床分离株、１２例ＲＦＰ敏感菌株、３５例耐ＲＦＰ肺结核患者痰标本,采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测痰标本和菌株中结核杆菌ｒｐｏＢ基因突变。结果 ５０例耐ＲＦＰ菌株中有４５例ＰＣＲ－ＳＳＣＰ条带与     

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR快速检测

目的建立一种鉴别结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR快速检测方法。方法根据已发表的结核分枝杆菌23SrRNA和牛分枝杆菌特殊基因序列,设计并合成了两对可扩增结核分枝杆菌和牛分枝杆菌特异性基因片段的引物,建立二重PCR快速检测结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的方法,测定其特异性和敏感性,并对238份牛临床样品的DNA分别进行了检测。结果该方法对牛分枝杆菌能扩增出838bp和631bp的特异性基因片段,结核分枝杆菌只扩增出838bp基因片段而扩增不出631bp的特异性基因片段,对参试的其它牛菌株的DNA扩增结果均为阴性。敏感度检测可达到50pg的DNA含量。临床样品检测结核分枝杆菌阳性有21份,牛分枝杆菌阳性有1份,其它临床样品扩增结果全部为阴性。结论本方法可作为牛分枝杆菌的快速检测和流行病学调查的工具。     

结核分枝杆菌和牛分枝杆菌TaqMan(R)荧光PCR检测的建立

目的 对结核分枝杆菌和牛分枝杆菌分别建立荧光PCR快速检测方法 .结核分枝杆菌荧光PCR对H37Rv标准菌株、结核分枝杆菌临床分离株的检测结果 呈典型阳性反应,牛分枝杆菌荧光PCR对牛分枝杆菌标准菌株、BCG菌株的检测结果 呈典型阳性反应,对其它分枝杆菌菌株以及常见微生物样品为阴性反应.两种荧光PCR对对应阳性重组质粒模板的检测灵敏度可达单个基因拷贝,对结核分枝杆菌或BCG标准菌株的检测灵敏度可达单个菌细胞.对临床样品的检测结果 显示,荧光PCR对模拟感染奶样、血样的检测灵敏度可达单个菌细胞.所建立的方法 ,全过程包括血样、奶样、痰液等临床样品的前处理、核酸提取和荧光PCR检测,可在5～6h内完成.采用上述荧光PCR方法 从临床采集的疑似病人痰液中检出多份结核分枝杆菌阳性样品.     

PCR—SSCP技术快速检测结核分枝杆菌三种基因突变

聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)是快速检测基因突变的重要方式之一[1].应用此法对辽宁省90例涂阳患者痰标本分离结核分枝杆菌进行rpoB、rpsL、56例katG基因突变检测,与传统耐药结果比较分析,寻找结核分枝杆菌耐药性与基因突变的关系.     

结核分枝杆菌分子生物学检测方法新进展

应用分子生物学技术检测结核分枝杆菌,克服了传统检测方法的诸多不足,能够对难以培养、生长缓慢的结核分枝杆菌进行更加敏感、特异、准确、快速的鉴定和药物敏感性评价。本文概述了目前国内外几种结核分枝杆菌分子生物学检测方法的原理、应用现状及评价。     

应用免疫磁珠分离-改良罗氏培养技术检测痰结核分枝杆菌的研究

目的通过免疫磁珠分离技术(immunomagnetic beads separation techniques,IMBS)富集痰液中的结核分枝杆菌,提高痰液培养的阳性率,以期用于结核病的快速诊断。方法制备兔抗结核杆菌IgG抗体,并将其结合于免疫磁珠表面。采集71例确诊结核病患者的痰液标本,通过免疫磁珠分离技术捕获、富集吸附结核分枝杆菌后用改良罗氏培养基培养,并与传统改良罗氏(L-J)培养法和痰涂片抗酸染色法作比较。结果 71例结核病患者痰涂片抗酸染色检查阳性26例,阳性率36.6%;传统改良L-J培养阳性34例,阳性率47.9%;免疫磁珠分离技术捕获、富集结核分枝杆菌后进行改良L-J培养阳性48例,阳性率67.6%。三者阳性率差异有统计学意义(P<0.05),改良L-J培养和痰涂片检查阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。结论采用免疫磁珠分离技术捕获、富集痰液中的结核分枝杆菌后进行培养,可显著提高痰培养的阳性率,该方法可用于结核病的快速诊断。     

应用PCR-SSCP技术检测痰中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变的研究

目的应用PCR-SSCP技术检测痰样本中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变,探索其临床应用价值。方法以结核分枝杆菌标准株H₃₇R_V为对照,应用套式PCR扩增目的基因,并使用SSCP技术直接检测100例耐药患者和10例敏感患者痰样本中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变并进行基因测序,将SSCP结果及测序结果与细菌培养药敏结果进行比较分析。结果PCR-SSCP直接检测痰样本中的结核分枝杆菌katG基因突变的敏感性和特异性分别是55.9%和70.0%,rpoB为76.0%和90.0%,embB为46.4%和60.0%。结论PCR-SSCP操作快速、简单,敏感性和特异性较高,可用来直接检测临床痰样本中结核分枝杆菌katG、rpoB、embB基因突变。     

实时荧光定量PCR法分析结核分枝杆菌对异烟肼耐药的分析

目的利用实时荧光定量PCR技术快速检测异烟肼耐药结核分枝杆菌。方法收集到医院就诊的结核病疑似患者痰液样本,提取痰液样本的总DNA,利用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术对结核分枝杆菌感染进行快速筛查,并与传统药敏试验进行比较,对两者的灵敏度、特异性、一致性进行比较分析。结果检测346例结核病人临床分离培养样本,药敏试验检出257例异烟肼敏感标本,101例异烟肼耐药标本;实时荧光定量PCR法共检测出异烟肼敏感和耐药标本225例98例,灵敏度为86.64%,特异性为93.92%,一致率为93.12%。结论跟传统药物敏感性实验相比,实时荧光定量PCR法检测速度快速、特异性强、灵敏度较高,可用于结核分枝杆菌耐异烟肼突变的快速检测,适于耐多药结核病的快速筛查。     

TaqMan-MGB荧光定量PCR快速检测结核分枝杆菌katG基因突变

目的 建立一种特异、灵敏、快速检测结核分枝杆菌katG基因突变的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。方法 根据结核分枝杆菌katG基因主要发生315位点突变的特点,设计一对特异性TaqMan-MGB探针和引物,通过反应条件优化,建立荧光定量PCR方法;用克隆到PMD18-T载体上katG基因阳性标准品及不同菌株来评价该方法的特异性、敏感性和重复性。结果 灵敏度高,检测目的基因的最低检测下限10copies/μl,比常规PCR灵敏高100倍;特异性高,检测16株非结核分枝杆菌标准株和7种常见呼吸道感染细菌的标准株均为阴性;与测序法相比,野生型和突变型探针的敏感性和特异性均为100%。重复性好,批内批间CT值变异系数均小于1%。结论：TaqMan-MGB荧光定量PCR的方法能特异、灵敏、快速检测结核杆菌菌株katG 315位点突变。     

利用荧光定量RT-PCR和PCR方法检测结核分枝杆菌复合群

目的建立一种新的检测结核分枝杆菌复合群的荧光定量试验方法(R/P分析),探讨R/P分析检测临床标本中结核分枝杆菌复合群的应用价值。方法根据结核分枝杆菌复合群基因保守序列设计引物和探针构建质粒标准品。运用R/P分析检测54例确诊结核病人临床样本,检测的结果同时与培养法、荧光定量PCR法进行比较。结果不同临床标本用R/P分析诊断结核病,其敏感性高于荧光定量PCR法和培养法,阳性检出率分别为96.3%、83.3%和55.6%。结论 R/P方法是一种快速、特异的直接检测方法,它可以区分结核分枝杆菌复合群的死菌与活菌,因此可以更好的指导医生进行治疗,更准确地做出公共卫生决策。     

基于PCR熔解曲线技术的结核分枝杆菌Spoligotyping基因分型的临床应用研究

目的 利用基于PCR熔解曲线技术的结核分枝杆菌Spoligotyping基因分型方法(McSpoligotyping)对结核分枝杆菌分离株进行基因分型,以评价其在结核病流行病学调查中的应用价值。方法 对广西2017年结核耐药监测点收集的949株结核分枝杆菌,采用McSpoligotyping分型方法对其进行基因分型。首先,通过对其中的361株菌株的McSpoligotyping 分型结果与全基因组测序(WGS)结果的一致性比较来评价McSpoligotyping分型方法。其次,对949株菌株分型数据与SITVITWEB数据库进行比对,获取间隔区寡核苷酸国际型别(spoligotype intemational type,SIT)编号,将分型结果提交到https://www.miru-vntrplus.org/MIRU/index.faces 网站进行聚类分析。结果 McSpoligotyping分型与WGS结果一致率为94.18%(340/361),在结果不一致标本中,出现不一致较多间隔序列在第5间隔。在949株菌株中新发现基因型为121株,已定义基因型为828株;其中已定义基因型共分为84种基因型,主要归属于5种基因家族(BEIJING、T、H、EAI、LAM)和3个家系(Lineage 1、Lineage 2、Lineage 4);5种基因家族主要流行为BEIJING和T基因家族,家系中主要流行为Lineage 2。949株菌株中的822株聚为49个簇(2~528株),最大一簇为Beijing家族SIT1基因型,其余的127株菌表现为独特的基因型。结论 利用PCR熔解曲线技术可快速对MTB进行基因分型,此技术较传统方法操作简便、耗时短,对结核病疫情处置及结核病分子流行病学研究具有重要意义。     

结核分枝杆菌Ag85B mRNA定量检测作为化疗监测指标的初步研究

目的　探讨痰标本中结核分枝杆菌Ag85B mRNA分子作为肺结核患者化疗反应监测指标的可行性和临床价值。方法 应用定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对15例初治涂阳肺结核患者应用标准短程化疗方案治疗过程中2、4、7、14、306、0d痰标本的结核分枝杆菌Ag85B mRNA进行系列检测,并与培养法(CFU)作比较。结果 痰标本中结核分枝杆菌Ag85B mRNA在治疗的前2d下降明显且与CFU的下降基本一致,治疗7 d Ag85B mRNA检测阴性11例,治疗14d阴性的12例,治疗30d除1例阳性外,其余均为阴性,治疗60d时全部阴性。结论 结核分枝杆菌Ag85B mRNA在接受治疗的肺结核患者的痰标中快速下降,是活菌数量下降的反映,痰标本中mRNA的变化可作为快速评价化疗反应的分子指标。     

套式PCR及测序方法用于痰标本中结核分枝杆菌rpoB耐药基因突变检测

目的应用套式PCR-DNA测序方法直接检测痰标本中结核分枝杆菌相关的rpoB基因突变,以期建立一种直接检测分枝杆菌耐利福平的快速方法,并评价其临床应用价值。方法采用套式PCR-DNA测序方法直接检测112例活动性肺结核患者和20例非结核性肺部疾病患者痰标本中结核分枝杆菌rpoB基因突变情况。同份痰标本同时做涂片抗酸染色,罗氏培养及菌型鉴定。结果112例活动性肺结核患者痰标本套式PCR扩增87例呈阳性,产物DNA测序31例有rpoB基因突变,其中分离出耐利福平株的32例痰中29例发生了基因突变,耐药突变率90.6%(29/32),39例菌阴(涂阴培阴)痰中有2例发生突变。分离出对利福平敏感株的37例痰中未发生突变,20例非结核性肺部疾病患者痰标本套式PCR扩增均为阴性,特异性100%。结论套式PCR-DNA测序可望为直接检测临床痰标本中结核分枝杆菌耐利福平的准确、特异、快速的方法。     

二代测序技术检测临床痰标本中结核分枝杆菌的初步评价CSCD

目的:评价二代测序(NGS)技术对临床痰标本中结核分枝杆菌的检测效能。方法:采用前瞻性研究方法,选取北京市疾病预防控制中心(北京结核病控制研究与防治所)2021年8—10月接诊的49例疑似肺结核患者痰标本,同时进行抗酸杆菌涂片镜检(简称“涂片”)、分枝杆菌培养(包含罗氏培养和MGIT 960液体培养;简称“培养”)、GeneXpert MTB/RIF(简称“Xpert”)和NGS技术检测结核分枝杆菌,比较4种方法检测不同分类患者阳性率差异,并以最终临床诊断为参照标准,评价4种检测方法的检测效能。结果:49例疑似肺结核患者中,最终肺结核诊断者40例(包括病原学确诊患者25例、病原学阴性临床诊断患者15例),非肺结核患者9例(包括肺炎6例,非结核分枝杆菌感染、慢性阻塞性肺疾病和哮喘各1例)。NGS技术检测49例疑似肺结核患者的阳性率[69.4%(34/49)]明显高于涂片[44.9%(22/49)]、培养[51.0%(25/49)]和Xpert[49.0%(24/49)],差异均有统计学意义(χ^(2)=17.614、17.018、20.753,P值均=0.000);检测病原学阴性肺结核患者的阳性检出率为46.7%(7/15)。以临床诊断结果为参照标准,涂片、培养、Xpert、NGS技术对49例疑似患者痰标本的检测敏感度分别为55.0%(22/40)、60.0%(24/40)、60.0%(24/40)、80.0%(32/40),特异度分别为9/9、8/9、9/9、7/9,一致率分别为63.3%(31/49)、65.3%(32/49)、67.3%(33/49)、79.6%(39/49),Kappa值分别为0.310、0.297、0.355、0.459。结论:以临床诊断为参考标准,NGS技术检测的敏感度最高,与临床诊断的一致性也最高,能够快速、高效检测痰标本中的结核分枝杆菌,可早期辅助诊断疑似肺结核患者。