弓形虫复合抗原基因P30-ROP2体外扩增、克隆及真核表达重组质粒的构建

目的　构建弓形虫RH株 pcDNA3.1 P30 ROP2 真核表达重组质粒,为进一步表达及 DNA疫苗的研制作准备。　方法　用PCR技术从弓形虫RH分离株的基因组DNA中扩增编码 P30基因片段和棒状体蛋白(ROP2)的基因片段,重组入 pUC18克隆载体,然后将 pUC18 P30 ROP2中的 P30 ROP2 外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体,再经含氨苄青霉素的LB培养基筛选、酶切及PCR鉴定。　结果　从弓形虫RH株基因组中扩增出特异的 P30、ROP2 片段,克隆成功 pUC18 P30 ROP2 重组质粒;经亚克隆、筛选鉴定获得了 pcDNA3. 1 P30 ROP2重组表达质粒。　结论　成功构建了弓形虫 pUC18 P30 ROP2重组克隆质粒,亚克隆成功 pcDNA3.1 P30 ROP2真核表达重组质粒,为下一步DNA疫苗的研究奠定了基础。     

编码弓形虫表面抗原P30、P22复合基因真核表达载体的构建

目的　构建编码弓形虫RH株表面抗原P30、P22复合基因的真核表达重组质粒, 为进一步表达融合蛋白及研制核酸疫苗做准备。　方法　用弓形虫RH株腹腔接种小鼠,收集腹水,酚/氯仿法抽提弓形虫基因组 DNA;用 PCR技术从基因组DNA中扩增编码表面抗原 P30、P22 的基因片段,分别重组入 pMD18 T载体中。将 pMD18 T载体中的P30、P22基因片段分别酶切,定向克隆入 pUC18克隆载体中, pUC18 P30 P22 中的 P30 P22 片段经酶切、纯化后,亚克隆入 pcDNA3.1( )真核表达载体,用酶切、PCR及测序的方法对重组子进行鉴定。　结果　从弓形虫 RH株基因组DNA中扩增出特异的P30及P22片段;大小均与预测值相符;克隆 pUC18 P30 P22 重组质粒的酶切片段分别与 P30、P22基因大小一致;经亚克隆、筛选鉴定获得了 pcDNA3.1 P30 P22重组质粒,所测P30、P22基因序列与文献报道一致。结论　成功构建弓形虫 pUC18 P30 P22重组质粒和 pcDNA3.1 P30 P22 重组质粒,为研制弓形虫 DNA疫苗奠定了基础。     

编码弓形虫表面抗原P30、P22复合基因真核表达载体的构建

目的 构建编码弓形虫RH株表面抗原P30、P22复合基因的真核表达重组质粒，为进一步表达融合蛋白及研制核酸疫苗做准备。方法 用弓形虫RH株腹腔接种小鼠，收集腹水，酚／氯仿法抽提弓形虫基因组DNA；用PCR技术从基因组DNA中扩增编码表而抗原P30、P22的基因片段，分别重组入pMD18T载体中。将pMD18-T载体中的P30、P22基因片段分别酶切，定向克隆入pUC18克隆载体中，pUC18-P30-P22中的P30P22片段经酶切、纯化后，亚克隆入pcDNA3．1(-)真核表达载体，用酶切、PCR及测序的方法对重组子进行鉴定。结果 从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出特异的P30及P22片段；大小均与预测值相符；克隆pUC18-P30P22重组质粒的酶切片段分别与P30、P22基冈大小一敛：经亚克隆、筛选鉴定获得了pcDNA3．1-P30-P22重组质粒，所测P30、P22基因序列与文献报道一致。结论 成功构建弓形虫pUC8-P30P21重组质粒和pcDNA3．1-P30-P22重组质粒，为研制弓形虫DNA疫苗奠定了基础。     

弓形虫棒状体蛋白ROP2基因的克隆与表达

目的从弓形虫RH株总DNA中克隆棒状体蛋白ROP2基因片段，克隆至表达载体pET22b中，导入大肠杆菌中表达。方法采用半巢式PCR扩增法从基因组DNA中扩增编码ROP2基因片段，克隆至质粒pUC119中，经PCR和酶切鉴定后，进行DNA序列测定，并以SacⅠ／HindⅢ双酶切克隆至表达载体pET22b上，重组质粒pET22b—ROP2转化大肠杆菌BL21，CodonPlus（DE3）-RIL菌株中，经IPTG诱导表达。结果从弓形虫RH株总DNA中扩增到1．0kb的ROP2基因片段．构建成功重组质粒pUC119，ROP2，经DNA序列分析与已报道序列基本一致，重组质粒pET22b，ROP2在大肠杆菌中表达，产生一分子量约为45kDa的预期重组蛋白。结论克隆到的弓形虫棒状体蛋白ROP2在大肠杆菌中得到表达，构建成功的重组盾粒pUC119-ROP2可用千下一步多基因融合的市隆操作。     

弓形虫复合抗原基因P30-ROP2体外扩增、克隆及真核表达重组质粒的构建

目的 构建弓形虫RH株pcDNA3．1-P30-ROP2真核表达重组质粒，为进一步表达及DNA疫苗的研制作准备。方法 用PCR技术从弓形虫RH分离株的基因组DNA中扩增编码P30基因片段和棒状体蛋白(ROP2)的基因片段，重组人puC18克隆载体，然后将pUC18-P30-ROP2中的P30-ROP2外源基因片段经酶切、连接等反应，亚克隆入pcDNA3．1真核表达载体，再经含氨苄青霉素的LB培养基筛选、酶切及PCR鉴定。结果 从弓形虫RH株基因组中扩增m特异的P30、ROP2片段，克隆成功pUC18-P30-ROP2重组质粒；经亚克隆、筛选鉴定获得了pcDNA3．1-P30-ROP2重组表达质粒。结论 成功构建了弓形虫puC18P30-ROP2重组克隆质粒，亚克隆成功pcDNA3．1-P30-ROP2直核表达重组质粒，为下一步DNA疫苗的研究奠定了基础。     

弓形虫表面抗原P22编码基因片段的克隆及序列测定

目的克隆弓形虫表面抗原P22编码基因片段并进行序列测定。方法设计合成1对引物,采用PCR法扩增出P22目的基因片段,以低熔点琼脂糖回收纯化,并以限制性内切酶BamHI和KpnI双酶切后,插入质粒载体p5．6的多克隆位点,构建重组体p5．6／P22,并转化大肠杆菌DH5α,快速酸法初筛阳性重组子,并以PCR法与限制性酶切分析对阳性克隆进一步鉴定。被鉴定的重组子以双脱氧链终止法进行序列测定。结果从弓形虫核酸提取物中扩增出约593bpDNA条带,与预期扩增片段大小相符,空白对照无特异性扩增条带;所构建p5．6／P22重组体阳性克隆经双酶切与PCR鉴定与预期结果一致;序列测定的结果确证了插入片段的正确性。结论体外成功扩增、克隆了弓形虫表面抗原P22编码基因片段,并经序列分析所验证,为弓形虫P22表面抗原的表达以及弓形虫疫苗的制备作好铺垫。     

弓形虫ZS2株抗原基因的扩增及克隆

扩增弓形虫ZS2株P30抗原基因,构建PcDNA3—P30真核表达重组质粒。方法本文采用PCR技术,自行设计一对寡核苷酸引物（P1,P2）,从弓形虫ZS2基因组DNA中特异扩增出编码P30抗原的基因片段。扩增的目的片段经纯化后用EcoRI和Hind双酶切后,克隆到真核表达质粒pcDNA3中,转化入大肠杆菌TG1,用氨共青霉素和PCR初筛,将PCR扩增阳性的重组子用EcoRI和Kind双酶切鉴定。结果从弓形虫ZS2株DNA中扩增出1025bP的P30基因,构建重组质粒PcDNA3—P30,酶切产物的大小分别与预期相符。结论成功地对弓形虫ZS2株P30基因进行体外扩增及构建真核表达重组质粒PcDNA3—P30,为重组P30抗原及核酸疫苗研究做好准备。     

肺炎支原体ORF6区基因的克隆与表达

目的表达肺炎支原体ORF6区基因,探索其作为诊断抗原的可能性。方法采用PCR方法,从肺炎支原体FH株基因组中扩增ORF6区基因,用TA克隆的方法克隆该片断,并以该重组质粒为模板,扩增ORF6区基因,此扩增产物经过双酶切后克隆到表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后采用SDS-PAGE和Western-blotting检测重组质粒目的蛋白的表达结果。结果获得肺炎支原体ORF6区基因长为1003bp的DNA片段,SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量56.8kDa处有阳性表达条带。免疫印迹显示,该蛋白带能与肺炎支原体阳性血清反应。结论ORF6区基因在大肠杆菌中获得高效表达,重组蛋白具有免疫反应性。     

白纹伊蚊乙酰胆碱酯酶基因片段克隆及鉴定

目的　从白纹伊蚊中分离、克隆及鉴定乙酰胆碱酯酶 (ACh E)基因片段。　方法　根据已知的果蝇和斯氏按蚊 ACh E氨基酸序列保守区域设计简并引物 ,对白纹伊蚊 ACh E基因片段进行扩增 ,将凝胶回收的 PCR产物经与 T-载体质粒连接进行 T/ A克隆 ,用α互补筛选法筛选重组质粒克隆 ,用碱裂解法提取重组质粒 DNA并对重组质粒进行酶切鉴定和 PCR鉴定。　结果与结论　获得与设计相符的白纹伊蚊 ACh E基因片段 PCR扩增产物并对其作出鉴定     

苏云金杆菌cryIVD基因的克隆及序列分析

目的 克隆苏云金杆菌（B.t.i)cryIVD基因并测定其序列。方法 根据B.t.i cryIVD已知序列，设计合成了1对引物，应用PCR技术扩增cryIVD基因，克隆入pUC18载体，阳性克隆的重组质粒经酶切，电泳鉴定后进行序列测定。结果 PCR扩增得到特异的2.0kb基因片段。重组质粒经酶切后得到预期大小的基因片段。序列分析证明目的基因被完整且正向克隆。结论 B.t.icryIVD基因被成功克隆。     

弓形虫P30基因MBP融合蛋白的表达

目的　构建弓形虫主要表面抗原Ｐ３０ 基因的原核表达载体并在Ｅ－ｃｏｌｉ 中表达。方法　根据已发表的弓形虫Ｐ３０基因序列,自行设计合成一对引物并在引物５’端分别引入限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ酶切位点,用ＰＣＲ技术从弓形虫ＲＨ 株基因组ＤＮＡ中扩增Ｐ３０ 基因片段,插入ｐＭＡＬＰ２ 质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａα感受态细胞,于氨苄ＬＢ培养平板上筛选阳性克隆,经过酶切及ＰＣＲ扩增鉴定重组子。将阳性重组子经ＩＰＴＧ诱导表达,ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ及免疫印迹分析。结果　从弓形虫ＲＨ 株ＤＮＡ中扩增出９７６ｂｐ 的Ｐ３０ 基因,构建成功ｐＭＡＬＰ２ － Ｐ３０ 重组质粒;ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ电泳及Ｗｅｓｔｅｒｎ － ｂｌｏｔ 显示ＭＢＰ／Ｐ３０ 融合蛋白条带的分子量约为７７－５ｋＤ,减去ＭＢＰ的分子量４３ｋＤ,得出Ｐ３０ 蛋白分子量为３４－５ｋＤ,且能被弓形虫高免鼠血清识别。结论　从弓形虫基因组ＤＮＡ中获取Ｐ３０ 基因,并成功构建ｐＭＡＬＰ２ － Ｐ３０ 重组质粒,诱导表达了Ｐ３０ 的融合蛋白。为进一步Ｐ３０ 蛋白的分离纯化及其对动物的免疫原性研究作好准备。     

间日疟原虫MSP1 C端编码基因的克隆及序列分析

目的 克隆间日疟原虫MSP1C端编码基因,并进行序列测定和分析。方法 根据间日疟原虫MSP1C端编码基因设计1对引物,采用PCR技术从深圳间日疟患者血样(编号为PvSZ1)的核酸提取物中扩增出MSP1C端编码基因,回收纯化后,与T载体连接构建重组子pMD/MSP1,并转化大肠杆菌JM109。阳性克隆以限制性酶切分析与PCR法鉴定后,双脱氧链末端终止法双向测定序列并分析。结果 从间日疟血样提取的DNA中扩增出1119bp的基因片段,所构建的pMD/MSP1阳性克隆重组子经双酶切和PCR鉴定与预期结果一致。所测定的间日疟原虫PvSZ1C端基因序列与国外Sal-1株比较,碱基数相同,未发现碱基缺失,相同的核苷酸占96.7％,序列中第542位碱基变化为同义突变(GTC→GTT,均编码缬氨酸),第375～542区间的碱基变化数占整个序列变化碱基总数的92.9％(34/37)。所推测的氨基酸序列与Sal-1株比较,同源性为92.5％。结论 成功克隆了间日疟原虫PvSZ1株MSP1C端编码基因,该基因在不同间日疟原虫地理株间相对保守,所克隆基因序列的第375～542核苷酸区域为高频变化区。     

抗日本血吸虫膜蛋白单克隆抗体NP11-4轻链可变区基因的分离克隆及测序研究

本文报告了从抗日本血吸虫单抗NP11- 4杂交瘤细胞株的基因组DNA中 ,用PCR技术扩增出抗体轻链可变区基因 ,并克隆至pUC19质粒中进行测序分析。研究表明 :该基因长 336bp ,编码 112个氨基酸 ,经结构分析及与抗体库中一般序列的比较 ,证实该序列为轻链可变区基因 ,属κ轻链SubgroupII亚类 ,由种系基因中的V与Jκ 2基因重排而成。     

弓形虫主要表面抗原基因( P30)大肠杆菌中以融合蛋白形式的初步表达(英文)

根据已发表的弓形虫主要表面抗原（ Ｐ３０）的基因序列,设计合成了一对引物,通过聚合酶链反应,扩增出 Ｐ３０ 基因,将 Ｐ３０ 基因克隆入表达质粒ｐ Ｇ Ｅ Ｍ Ｅ Ｘ１ 中,经酶切鉴定后,阳性重组质粒转化宿主菌 Ｊ Ｍ １０９（ Ｄ Ｅ３ ）,宿主菌经 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导表达后,产物进行 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ和 Ｗ ｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析。结果显示, Ｐ３０ 基因以融合蛋白的形式表达,表达产物具有特异的免疫反应性。     

恶性疟原虫云南株环子孢子蛋白部分基因的克隆和序列分析

目的：测定我国恶性疟原虫环子孢子蛋白部分基因序列，了解我国虫株与其它虫株CS蛋白基因序列的差异。方法：采用PCR方法特异性扩增CS蛋白基因片段，并将该基因片段克隆于M13噬菌体，取3个阳性克隆制备M13－CSP单链DNA，用双脱氧链末端终止法测定该基因片段核苷酸序列。应用PCGENE软件对六个虫株CS蛋白基因序列进行了一系列比较分析。结果：我国恶性疟原虫云南株（PFD－3／YN）与T4、Welcome、NF54、3D7及7G8等虫株CS蛋白基因序列有不同程度的差异，其中一个有意义核苷酸突变发生在P．fTh／Tc抗原表位区。结论：云南株与其它虫株CS蛋白基因存在差异。     

含弓形虫P30基因插入昆虫杆状病毒的研究

目的：将弓形虫ＺＳ１株主要表膜抗原（Ｐ３０）基因插入到昆虫杆状病毒基因组中，为在昆虫细胞或昆虫体内表达及生产Ｐ３０作准备。方法：先将Ｐ３０基因亚克隆到转移载体质粒ｐＳＸ－ＩＶＶＩ＋Ｘ３中，然后用此重组载体质粒ＤＮＡ与亲本株病毒ＤＮＡ共转染培养的草地夜蛾细胞，经空斑纯化筛选出重组病毒株。结果：已得到含Ｐ３０基因的重组杆状病毒ＴｎＮＰＶ－Ｐ３０。结论：本文已将弓形虫ＺＳ１株Ｐ３０基因亚克隆到昆虫杆状病毒ＴｎＮＰＶ中。     

日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因克隆及特性鉴定

[目的 ]探索研制血吸虫病疫苗的新路径 ,对日本血吸虫线粒体相关蛋白进行基因克隆及特性鉴定。[方法 ]分析本室筛选日本血吸虫成虫cDNA文库获得的 1个cDNA片段 (Sj338 2 4)的开读框序列 ,在其上下游分别设计引物A和B ,并以该cDNA片段为模板进行PCR扩增后 ,将该片段重组于pGEM T中并进行DNA测序鉴定及检索。再经酶切后将该基因片段亚克隆入表达载体pGEX 6P 1,并进行蛋白表达、纯化及抗原性鉴定。 [结果 ]该目的基因PCR产物全长共 487bp ,其开读框由 45 9bp组成 ,编码 15 3个氨基酸经残基组成的多肽。DNA序列同源性分析发现Sj338克隆基因与人及褐鼠的线粒体外膜蛋白的部分编码基因较高度同源。重组质粒pPEX 6P 1 Sj338能高效融合表达 ,理论蛋白的分子量为 17kDa。SDS PAGE和Westernblotting检测结果表明 ,重组蛋白rSj338具有良好的抗原性。 [结论 ]Sj338可能为日本血吸虫线粒体相关蛋白的基因 ,重组蛋白有望成为新的疫苗候选分子。     

恶性疟原虫环子孢子蛋白基因在大肠杆菌中的表达

用ＰＣＲ方法特异性扩增恶性疟原虫云南株（ＰＦＤ－３／ＹＮ）环子孢子蛋白基因片段,经基因序列测定后克隆于ｐＷＲ４５０－１融合蛋白表达载体,并转化大肠杆菌ＴＧ１、ＪＭ１０３及ＪＭ１０９。在不同菌体浓度及不同剂量ＩＰＴＧ诱导下检测ＣＳＰ融合蛋白的表达,结果显示仅ｐＷＲ－ＣＳＰ／ＴＧ１工程菌在菌体浓度ＯＤ５９０值达０．７～０．８时,加入终浓度１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ进行诱导,可表达一８８ｋＤａ的融合蛋白。ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析表明ＣＳ蛋白表达产物能被抗ＣＳ蛋白重复区单克隆抗体所识别     

弓形虫P30基因原核表达载体的构建

为获取具有生物学活性的弓形虫 P30蛋白 ,采用定向克隆的方法 ,自行设计引物通过 PCR扩增得到 P30基因片段 ,用 Eco R 和 Sal 双酶切后 ,连接到同样双酶切的原核表达载体 (p BV2 2 0和 p MAL P2 )上 ,转化大肠杆菌 DH5 α,分别得到含重组质粒 p BV2 2 0 - P30和 p MAL P2 - P30的工程菌。扩菌提取质粒经过酶切分析和 PCR扩增鉴定后 ,证实 P30基因的两个原核表达载体构建成功 ,为其在原核系统中的表达作准备