大鼠胎脑神经干细胞的培养分化及鉴定的实验研究

目的建立大鼠胎脑皮质神经干细胞的培养、扩增、诱导分化及鉴定的方法。方法选取孕14d胎鼠的大脑皮质作为细胞来源,在无血清培养基中添加B27、碱性成纤维细胞因子、表皮生长因子,建立胚胎神经干细胞的体外培养体系,用5%的胎牛血清诱导神经干细胞分化,用免疫荧光染色技术进行对神经干细胞及诱导分化细胞的鉴定。结果原代培养的神经干细胞折光性强,培养第2d开始形成细胞集落,第3d形成大的神经球。3～5代传代的细胞生长稳定。经胎牛血清诱导后第3d开始,神经球开始向周边发出突起,悬浮的细胞开始贴壁生长。原代及传代培养的神经球表达Nestin阳性,分化细胞分别表达NSE、GFAP和GALC阳性。结论应用无血清培养技术可在体外培养、扩增出神经干细胞。5%的胎牛血清可以诱导神经干细胞向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等成熟细胞分化。     

Differentiation of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into neurons in alginate scaffold

Alginate scaffold has been considered as an appropriate biomaterial for promoting the differentiation of embryonic stem cells toward neuronal cell lineage. We hypothesized that alginate scaffold is suitable for culturing Wharton's jelly mesenchymal stem cells(WJMSCs) and can promote the differentiation of WJMSCs into neuron-like cells. In this study, we cultured WJMSCs in a three-dimensional scaffold fabricated by 0.25% alginate and 50 m M Ca Cl2 in the presence of neurogenic medium containing 10 μM retinoic acid and 20 ng/m L basic fibroblast growth factor. These cells were also cultured in conventional two-dimensional culture condition in the presence of neurogenic medium as controls. After 10 days, immunofluorescence staining was performed for detecting β-tubulin(marker for WJMSCs-differentiated neuron) and CD271(motor neuron marker). β-Tubulin and CD271 expression levels were significantly greater in the WJMSCs cultured in the three-dimensional alginate scaffold than in the conventional two-dimensional culture condition. These findings suggest that three-dimensional alginate scaffold cell culture system can induce neuronal differentiation of WJMSCs effectively.     

人小龄胚胎神经干细胞的分离培养、扩增及鉴定

目的 探索人胚胎神经干细胞的体外分离培养条件，从而在体外大量扩增神经干细胞；并观察神经干细胞增殖、分化的特点。方法 从人胚胎脑分离神经干细胞，部分细胞冻存，另一部分细胞进行体外培养。采用无血清培养液，加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激细胞增殖，进行体外扩增、传代培养。采用免疫荧光法鉴定神经干细胞和分化的神经元及胶质细胞。结果 从人胚胎脑分离的细胞在含有EGF和bFGF的无血清培养液中能形成大量的神经干细胞球，这些神经干细胞球可在体外扩增及传代培养。免疫荧光法鉴定神经干细胞球中大部分为神经上皮干细胞蛋白(nestin)表达阳性细胞。贴壁后可以分化出神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达阳性的细胞。经冻存后的胎脑细胞也能培养出具有同样特征的神经干细胞。结论 在含有EGF和bFGF的无血清培养液中，从人胚胎脑能分离培养出神经干细胞，并能在体外大量扩增。这为人类神经干细胞的进一步研究和应用提供了材料。     

体外培养人类神经干细胞神经球中髓鞘的形成

目的：探索人类神经干细胞的体外培养条件和其形成的神经球的超微结构。方法：从胎脑皮质中机械分离细胞，N2培养基培养和扩增人类神经干细胞，应用免疫细胞化学方法对培养的细胞进行鉴定。对形成的神经球应用透射电镜进行超微结构研究。结果：从胎儿的脑皮质中成功分离培养出神经干细胞，形成典型的神经球，大部分细胞表达神经干细胞的标志物波形蛋白，细胞贴壁后可诱导分化 为神经元和胶质。早期培养的神经球中有典型的髓鞘形成。结论：从胎儿的脑皮质中成功地分离、培养出人类的神经干细胞，细胞呈悬浮状态生长，形成神经球。这种早期培养的神经干细胞有形成髓鞘的能力，可作为治疗人类脱髓鞘病变的潜在细胞来源。     

人类神经干细胞的长期培养和传代

目的 探讨人类神经干细胞的体外培养条件及其传代的方法。方法 采用机械方法从胎脑中分离神经细胞，应用N2培养基进行培养，bFGF和EGF刺激细胞扩增；传统方法和对神经球切割的方法进行传代培养；应用免疫组织化学染色对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定。结果 从胎脑当中成功培养出人类的神经干细胞，培养条件下呈悬浮状态生长，形成神经球，绝大多数的细胞表达波形蛋白和Musashil两种神经干细胞的标志物；这种细胞可分化为神经元和星型胶质细胞，早期的培养有少量的少突胶质细胞；在这种培养条件下，神经干细胞生长速度较慢，而采用切割神经球的方法保持了细胞间的，神经干细胞可获得较大的扩增速度。结论 在体外的培养条件下，可从胎脑组织中培养出神经干细胞，它可做为中枢神经系统疾病移植治疗的潜在细胞来源。     

新生小鼠端脑组织神经干细胞诱导分化为胆碱能神经元的研究

目的探讨新生小鼠端脑组织神经干细胞是否能够分化成胆碱能神经元。方法取新生小鼠端脑组织．用无血清方法分离培养神经干细胞；用克隆培养的方法检验培养细胞的干细胞特性；用免疫荧光细胞化学的方法检测神经干细胞标志巢蛋白（nestin）及干细胞诱导分化后神经元标志微管相关蛋白2（MAP2）、星形胶质细胞标志胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、胆碱能标志胆碱乙酰转移酶（CHAT）；比较不同的诱导分化条件（5％胎牛血清、5％胎牛血清＋碱性成纤维细胞生长因子）对胆碱能神经元分化的影响。结果从新生小鼠端脑组织分离培养出具有自我更新、扩增能力的神经球；各培养基中神经球均为nestin阳性。诱导分化后均能够产生MAP2阳性神经元、GFAP阳性星形胶质细胞以及ChAT阳性的胆碱能神经元。分化培养中加入碱性成纤维细胞生长因子能够提高胆碱能神经元分化的比例。结论新生小鼠端脑组织神经干细胞能够分化成胆碱能神经元。     

人胚脑与脊髓神经干细胞体外生物学特性的差异

目的:探讨人胚脑源性神经干细胞和脊髓源性神经干细胞的体外培养和分化的差异。方法:从人胚脑组织和脊髓组织中分离培养神经干细胞,分为EGF组、bFGF组、EGF±bFGF组,在连续传代过程中观察并比较神经干细胞体外培养特性的差异:用血清诱导神经干细胞分化,观察其分化状况的不同。结果:从人胚脑组织分离的细胞在bFGF 单独存在时无法形成神经球,在EGF或EGF±bFGF存在时形成大量具有连续增殖能力的神经球;从人胚脊髓组织分离的细胞在EGF单独存在时无法形成神经球,在bFGF单独存在时只形成少量神经球,在EGF±bFGF存在时形成大量具有连续增殖能力的神经球。同样在EGF±bFGF存在的情况下,脑源性于细胞的增殖速度较快。经血清诱导后,脑组织来源的干细胞分化为NSE阳性细胞数明显多于脊髓组织来源的干细胞,二者之间的差异具有显著性(P<0．05)。结论:脑源性和脊髓源性神经干细胞在生长和分化方面有明显差别:脑源性神经干细胞可在bFGF或EGF士bFGF存在的情况下长期传代,而脊髓源性神经干细胞只能在EGF±bFGF存在的情况下长期传代,脑源性干细胞的增殖能力明显高于脊髓源性干细胞;脑源性干细胞较脊髓源性干细胞更易分化为神经元。     

人胚脊髓神经干细胞的分离培养和鉴定

目的:探讨人胚脊髓神经干细胞的体外培养和分化的方法,观察其增殖和分化特点。方法:利用无血清培养和单细胞克隆技术从人胚脊髓组织中分离培养出神经干细胞并用血清诱导其分化,应用免疫荧光细胞化学技术对培养细胞及其分化细胞进行鉴定。结果:从人胚脊髓组织分离的细胞在EGF单独存在时无法形成神经球,在bFGF单独存在时只形成少量神经球,在EGF和bFGF共同存在时形成大量具有连续增殖能力的神经球,表达神经干细胞的标志物Nestin,经血清诱导后分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞并表达特异性抗原NSE、GFAP和CNP。结论:在体外培养条件下可从人胚脊髓组织中培养出神经干细胞,它可为神经干细胞的基础研究和临床应用提供材料。     

三维支架中骨髓间充质干细胞及软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞的成软骨效应

背景：软骨修复的关键是种子细胞在三维支架中的定向分化,但细胞放入三维支架中很难有透明软骨表现。 目的：考察3种种子骨髓间充质干细胞,软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞在支架中的成软骨特性。 方法：抽取羊骨髓,胰酶消化后获得原代骨髓间充质干细胞细胞、软骨细胞和脂肪源性成熟基质细胞,单层培养扩增。取P1骨髓间充质干细胞,P3软骨细胞和P3脂肪源性成熟基质细胞种植入不同比例(10%,20%,50%,80%,100%)的胶原/透明质酸支架中, 在无血清培养液中三维培养。2周后,用SO染色和免疫组织化学染色分析,观察硫酸软骨素和Ⅱ型胶原合成情况。 结果与结论：种子细胞在三维支架中特定条件下有成软骨效应,骨髓间充质干细胞在含20%透明质酸的胶原/透明质酸支架扩增少于3代有成软骨效应,软骨细胞传代数更高仍然有成软骨效应,但脂肪源性成熟基质细胞成软骨效应能力较弱。结果提示,在同样条件下骨髓间充质干细胞、软骨细胞较脂肪源性成熟基质细胞有更好的成软骨性能。 关键词：骨髓间充质干细胞;软骨细胞;组织工程;软骨;脂肪干细胞 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.16.004     

星形胶质细胞源性因子对神经干细胞分化的实验研究

目的探讨星形胶质细胞源性因子对神经干细胞分化的影响。方法分离和培养新生大鼠脑组织的神经干细胞;采用差速贴壁法和振荡法分离纯化星形胶质细胞,用免疫细胞化学染色法,胶质纤维酸性蛋白(GFAP)标记星形胶质细胞,进行细胞的纯度鉴定;将星形胶质细胞和神经干细胞在互不接触的情况下进行共培养,免疫荧光法观察神经干细胞分化后神经元特异性烯醇化酶(NSE)、GFAP和酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果纯化的星形胶质细胞GFAP抗体标记阳性,细胞纯度达98%;星形胶质细胞与神经干细胞共培养时,神经干细胞贴壁分化加快,NSE阳性细胞及TH阳性细胞明显多于对照组(P<0·05)。结论星形胶质细胞源性因子可快速诱导神经干细胞向神经元细胞、包括多巴胺神经元细胞分化,提示星形胶质细胞支持神经元发生。     

羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上骨髓间充质干细胞的增殖与分化

摘要 背景：最近胶原蛋白作为细胞体外三维立体支架材料被大量用于组织工程,但胶原蛋白支架材料机械强度低,很难承受较大外力,为此将胶原蛋白与羟基磷灰石制成复合支架材料,探索复合支架的生物相容性和生物活性。 目的：验证大鼠骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上的增殖与分化情况。 方法：贴壁法分离SD大鼠骨髓间充质干细胞,分别在平板、胶原支架、羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上,观察3种条件下细胞的生长状况,四甲基偶氮唑盐法检测其增殖情况。培养14,21 d后,考察细胞碱性磷酸酶活性及胶原蛋白分泌量。 结果与结论：发现骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上铺展良好,其增殖率显著高于纯胶原蛋白支架上培养的细胞,并高于平板培养细胞。骨髓间充质干细胞在羟基磷灰石/胶原蛋白复合支架上的碱性磷酸酶活性及胶原蛋白分泌量明显高于纯胶原蛋白支架,高于平板培养。结果提示,羟基磷灰石/胶原蛋白复合材料能促进骨髓间充质干细胞的增殖和分化,并诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。 关键词：胶原蛋白;羟基磷灰石;骨组织工程;骨髓间充质干细胞;支架 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.47.014     

人胚海马神经干细胞体外培养及分化研究

目的 研究人胚胎海马神经干细胞体外长期培养的条件和其在自主分化条件下的分化能力和分化特点。方法 从人胚胎海马分离神经干细胞。采用无血清培养法，进行体外培养、扩增，形成神经球。使神经球贴壁分化，分化培养基不含有任何细胞有丝分裂促进剂。使用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记分裂增生的细胞，观察细胞的分裂增殖情况。使用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞及其在不加诱导剂下的自主分化能力。结果 从人胚胎海马分离的神经干细胞具有增殖能力，细胞倍增时间为3．2d。BrdU检测有正在分裂、增殖的细胞。细胞贴壁分化后可以出现Nestin、GFAP、Tuj-1表达阳性的细胞。神经干细胞共培养6个月，传代14代。结论 分离培养的海马神经干细胞具有自我更新和增殖能力，可以长期培养。在不加任何诱导剂的自主分化条件下可以向神经元、胶质细胞分化。少突胶质细胞的培养需要不同的培养条件。分离培养的干细胞具有神经干细胞的特征。可用于基础和临床的相关研究。     

成年小鼠嗅球神经干细胞的培养和鉴定

目的 建立完善的成年小鼠嗅球神经千细胞分离培养和鉴定方法,探索新的成年神经干细胞种子来源. 方法 用无血清方法 分离培养成年小鼠嗅球来源的神经干细胞;用克隆培养、5-溴2-脱氧尿嘧啶核昔(BrdU)整合的方法 检验培养细胞的干细胞特性;用免疫荧光细胞化学的方法 检测BrdU、神经干细胞标记物巢蛋白(nestin)和SOX2、分化的细胞标记物Tuj1、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、04的表达. 结果 从成年小鼠嗅球能够分离、培养出具有自我更新、增殖能力的神经球.构成神经球的细胞呈nestin和SOX2阳性,它们分化后产生TuJ1阳性的神经元、GFAP阳性的星形胶质细胞、04阳性的少突胶质细胞. 结论 成年小鼠嗅球存在神经干细胞,其能够在体外进行培养、增殖、分化.是神经干细胞的新的种子来源.     

不同促细胞分裂因子对人神经干细胞定向分化的影响

目的观察不同促细胞分裂因子对人神经干细胞(NSCs)增殖及定向分化的影响。方法对人NSCs用无血清DMEM培养基行原代培养的同时,分别加入表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、神经生长因子(NGF)、维甲酸(RA)等因子,观察其对NSCs定向分化的作用。结果EGF培养的NSCs,克隆球形成慢且较松散,经血清诱导分化后,主要为星形胶质细胞,仅有少数神经元。而bFGF培养的NSCs则生长良好。在加血清诱导分化后,不同浓度bFGF培养的NSCs分化的细胞不同。bFGF与EGF共同培养的NSCs,其生长及神经球形成良好。在加血清诱导分化后,分化的神经细胞比例更接近脑内神经细胞的组分。NGF对神经球的形成无明显影响,但可促使其向神经元分化。RA使神经克隆球形成,可使NSCs直接分化为神经元细胞的比例明显增加。结论不同促细胞分裂因子对人NSCs的增殖及定向分化均有一定影响。     

Effect of basic fibroblast growth factor on cultured rat neural stem cell in three-dimensional collagen gel

OBJECTIVES: The effect of growth factors on the three-dimensional culture of neural stem cells has not been reported. We studied the effect of basic fibroblast growth factor (bFGF) on cultured rat neural stem cells in a three-dimensional culture. METHODS: We cultured rat neural stem cells in collagen gel matrix for three-dimensional culture and examined the effect of bFGF under such culture conditions. RESULTS: After 4 days culture, the cell density in the bFGF treatment group was 12 times that of the non-treatment group, reaching a significantly high value. In the bFGF treatment group, microtubule associate protein (MAP)-2-positive cell aggregation occurred, although in the bFGF non-treatment group there was no MAP-2-positive cell aggregation and few of the cells were sparsely distributed. Also, in the bFGF treatment group, MAP-2-positive cell aggregation had a luminal structure similar to neural rosettes. There was elongation of MAP-2-positive neurites from the cell aggregation to the circumference in the bFGF treatment group. DISCUSSION: bFGF is known to induce the proliferation, but not the differentiation of neural stem cells in two-dimensional cultures. However, in the three-dimensional culture, bFGF induced both the proliferation and differentiation of neural stem cells. The three-dimensional culture is, therefore, considered a useful method for predicting the response of neural stem cells to cytokines or biologically active substances in vivo.     

Hepatocyte growth factor promotes neuronal differentiation of neural stem cells derived from embryonic stem cells

We previously reported that hepatocyte growth factor (HGF) promoted proliferation of neurospheres and neuronal differentiation of neural stem cells (NSCs) derived from mouse embryonic brain. In this study, spheres from mouse embryonic stem (ES) cells were generated by floating culture following co-culture on PA6 stromal cells. In contrast to the behavior of the neurospheres derived from embryonic brain, addition of HGF to the growth medium of the floating cultures decreased the number of spheres derived from ES cells. When spheres were stained using a MAP-2 antibody, more MAP-2-positive cells were observed in spheres cultured with HGF. When HGF was added to the growth and/or differentiation medium, more MAP-2-positive cells were also obtained. These results suggest that HGF promotes neuronal differentiation of NSCs derived from ES cells.     

三种底物对体外培养的神经干细胞分化和迁移能力的影响

目的 :探讨不同底物对体外培养的神经干细胞分化和迁移能力的影响。 方法 :采用多聚鸟氨酸、层黏连蛋白、鼠尾胶原等作为底物 ,观察它们对大鼠神经干细胞分化的诱导和对细胞迁移能力的影响。 结果 :三种底物均能诱导神经干细胞的分化 ,诱导分化的能力为层黏连蛋白 >多聚鸟氨酸 >鼠尾胶原 ,多聚鸟氨酸与层黏连蛋白两者联用具有协同叠加效应 ,而且这些底物也具有介导分化后的神经细胞迁移的能力 ,各种底物对细胞迁移影响力的大小与其诱导分化的能力相似。 结论 :多聚鸟氨酸、层黏连蛋白和胶原不同程度上促进神经干细胞分化和迁移。     

携带神经干细胞肌基膜管组织工程支架中神经干细胞的存活分化

摘要 背景：多项研究已证实神经干细胞能促进脊髓损伤大鼠神经功能的恢复,肌基膜管具有良好的细胞、组织相容性和降解性,那么能否将二者结合起来构建一个新的神经组织工程支架？ 目的：以神经干细胞为种子细胞,以肌基膜管为支架,观察携带神经干细胞的肌基膜管组织工程支架中神经干细胞的存活与分化情况。 方法：体外分离培养大鼠神经干细胞,并进行鉴定。用化学萃取方法制作去细胞骨骼肌基膜管支架,将神经干细胞移植入肌基膜管支架培养7 d后,用免疫组织化学方法检测神经干细胞的存活及分化情况,扫描电镜观察其超微结构。 结果与结论：神经干细胞分离培养第5天,Nestin免疫荧光染色可见大量神经球。加血清诱导神经干细胞分化至7 d,进行抗NF、抗GFAP免疫荧光染色,镜下可见NF、GFAP阳性细胞,证明培养的神经干细胞具有多项分化潜能。苏木精-伊红染色法显示肌基膜管中肌细胞成分已消失,肌基膜管支架内主要是大致平行的管道。携带神经干细胞的肌基膜管组织工程支架免疫荧光染色证明,神经干细胞在支架内仍具有干细胞特性,并可分化为神经元和神经胶质细胞。扫描电镜显示神经干细胞可以稳固地贴附在肌基膜管内,提示制备的神经组织工程支架具有良好的生物相容性,可以进行体内移植治疗脊髓损伤等神经系统疾病。 关键词：肌基膜管;组织工程支架;神经干细胞;移植;脊髓损伤 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.47.003     

Thrombopoietin induced proliferation and differentiation of fetal liver CD34+ cells with phenotype change from hemopoiesis to neurogenesis**★

BACKGROUND： Previous studies have reported a neurotrophin-like motif in the N-terminal receptor binding region of the thrombopoietin （TPO） molecule, and have described localization of TPO and TPO receptor in the brain. Therefore, it is believed that TPO may be involved in regulation of neurogenesis. OBJECTIVE： To validate the effect of TPO on trans-differentiation, or differentiation from hematopoietic stem cells （HSCs） to neural stem cells （NSCs）. DESIGN, TIME AND SETTING： Comparative studies were performed from March 2004 to April 2007 at the Department of Experimental Medicine, Northern Hospital, and the Department of Immunology, Fourth Military Medical University of Chinese PLA. MATERIALS： Human fetal liver （FL） was obtained from fetuses after water-balloon abortion. Gestational age ranged from 16 to 20 weeks. The study was approved by the Institutional Review Board and Ethics Committee of the Northern Hospital. TPO was kindly provided by Genentech Inc （USA）. Iscove＇s Modified Dulbecco＇s Medium （IMDM） and neurobasalTM medium were purchased from Invitrogen （USA）. MACS CD34 multisort kit was purchased from Miltenyi Biotec （Germany）. METHODS： CD34^＋ cells were isolated from human FL mononuclear cells using MACS CD34 multisort kit and cultured at 1 × 10^5/mL in IMDM, containing TPO for 60 days with weekly changes of half of the medium. After culturing for 30 and 60 days, the TPO-induced cells were resuspended in neurobasalTM medium containing 10% fetal brain extracts and plated in an 8-well BIOCOAT poly-D-Lysine Culture Slide and cultured for another 7 days. MAIN OUTCOME MEASURES： Cell number, viability, phenotype and expression of hemopoiesis-related and neurogenesis-related proteins were examined by trypan blue exclusion with hemocytometer, immunoblot, immunocytochemistry and flow cytometry. RESULTS： After 60 days of induction with TPO, the cell number increased by 4.6-fold compared to the initial culture. Although the proportion of the cells expressing the h     

活体取材山羊皮层组织神经干细胞的培养与鉴定

目的通过手术从活体山羊中获取小块皮层脑组织,进行体外神经干细胞（NSC）的培养与鉴定。方法选用健康成年山羊,全麻后通过手术开颅取大小约2cm×2cm×1cm皮层脑组织块,在体外用无血清培养基自然筛选法进行分离、培养得到NSC,并采用免疫荧光细胞染色法进行NSC特异性抗原巢蛋白（nestin）及多向分化潜能的鉴定。结果皮层脑组织块在体外通过无血清培养基自然筛选法培养2w后可以成功地培养得到大量细胞球,经nestin鉴定为NSC球;所得到的NSC球在体外分化后经微管相关蛋白-2（MAP2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）及少突胶质细胞蛋白标志物1（O1）免疫荧光组化染色后确定可分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。结论对活体山羊通过手术获取其少量皮层脑组织,在体外培养后可得到相当数量的NSC,有望用于自体NSC的移植治疗。