心肌特异性表达人KCNE4转基因小鼠模型的建立

目的本研究旨在建立心肌特异性表达人KCNE4（hKcNE4）基因小鼠模型,为探索hKCNE4基因对特定类型心房颤动的防治作用奠定基础。方法通过RT—PCR克隆hKCNE4基因,使用核酸内切酶和连接酶构建hKCNE4基因心肌特异性表达载体hKCNE4α—MHC-Clone26,经过酶切鉴定、序列分析证实无误后用BamHI酶切获得转基因表达元件hKCNE4-α—MHC-hGHpA。将hKCNE4-α—MHC-hGHpA显微注入小鼠受精卵雄性原核,并将有活力的受精卵移植到代孕小鼠的输卵管。PCR鉴定出代孕鼠所生小鼠中转基因阳性原代（G0）小鼠,运用RT—PCR-测序技术对阳性G0小鼠与野生型小鼠交配所生的一代（G1）小鼠进行检测以识别出表达转基因的阳性小鼠。结果成功克隆了hKCNE4基因,正确构建了hKCNE4基因心肌特异性表达载体hKCNE4-α—MHC-Clone26。代孕鼠共生产86只仔鼠,9只转基因阳性,2只（分别称其为LineA和LineB）转基因在心脏中高表达。对LineA和LineB的阳性后代进行初步表型分析发现其生长发育良好,繁殖力正常,体表心电图无明显异常。结论成功建立心肌特异性表达hKCNFA转基因小鼠模型,为进一步研究hKCNFA基因对特定类型心房颤动的防治作用提供了一种工具。     

WNK4基因启动子结构初探

目的 鉴定WNK4基因启动子结构,初步探讨WNK4基因表达的调节机制.方法 应用5′ RACE方法确定WNK4基因转录起始点;构建WNK4基因启动子报告基因载体,并应用ELISA法检测启动子活性;应用软件分析预测WNK4基因启动子区顺式作用元件.结果 初步确定了WNK4基因转录起始位点;构建了WNK4基因启动子报告基因载体,并通过ELISA方法确定了转录起始点上游1 275 bp具有高转录活性,并且软件预测该区域内存在多个顺式作用元件,初步证明该区域为WNK4基因的启动子序列.结论 鉴定了WNK4基因的启动子区,并对其功能进行了初步鉴定.     

WNK4基因与原发性高血压的相关性分析

目的 探讨WNK4基因突变与原发性高血压的关系及WNK4基因的表达分析。方法 通过测序在小样本中找到cSNP,然后利用PCR—RFLP方法检测98例原发性高血压患者和95例健康对照者该位点多态。应用RT—PCR方法对WNK4基因进行表达分析。结果 发现了WNK4基因第七外显子G1662A的1个cSNP,且其等位基因频率在原发性高血压组和健康对照组中存在显著性差异。WNK4基因表达分析显示WNK4基因在胎儿肾脏、脑、肺、心、脾、肠等组织中均有表达。结论 WNK4基因与原发性高血压密切相关。     

Dicer 1转基因小鼠模型的建立

目的 建立Dicer1转基因小鼠模型.方法 构建pcDNA3.I-Dicer1转基因构件,经酶切、纯化后通过显微注射方法导人BDF1小鼠受精卵原核并移植到同期受孕的ICR受体母鼠输卵管内.出生后仔鼠用PCR和Southern方法检测鼠尾DNA鉴定基因型,通过免疫组化检测Dicer1基冈表达.结果 显微注射172枚卵,移植119枚卵于3只受体输卵管中,2只怀孕,共产仔15只,经PCR检测获得6只阳性鼠,Southern榆测6只均为阳性.对Southern检测阳性转基因小鼠子代进行RT-PCR检测和免疫组化分析证明Dicer1基因在肝脏、肾脏、肺内均有表达.对腹腔肿胀的转基因阳性1号鼠解剖发现肝脏、脾脏明显增大,胚胎发育异常.结论 成功建立Dicer1基因表达的转基因小鼠模型,该模型为进一步研究DICER1基因功能及miRNA的表达及功能等奠定基础.     

中国东北汉族人群WNK4基因多态性与原发性高血压的关联性

目的探讨东北汉族人群WNK4基因多态性与原发性高血压的关系。方法259例原发性高血压患者和235例健康正常对照人群血样应用PCR-RFLP方法检测A589S多态,结果经测序验证,同时检测所有人群的血糖、血脂等生化指标。结果(1)两组研究对象基因型频率间差别无显著性意义(P>0.05),但等位基因频率间差别有显著性意义(P<0.05);(2)GT和TT基因型与收缩压及舒张压升高密切相关(P=0.041,0.032)。结论WNK4基因A589S多态可能与高血压密切相关。     

抗菌肽转基因小鼠模型的建立

目的:制备抗菌肽转基因小鼠模型.方法:显微注射pcDNA3.1-PCMG到FVB小鼠受精卵雄原核中,注射存活胚胎移植到假孕母鼠输卵管内发育产生子代小鼠.结果:在生出的119只小鼠中经PCR和Southern blot检测到7只阳性.结论:通过显微注射法使外源基因pcDNA3.1-PCMG在FVB小鼠基因组中得到整合,为抗菌肽抗菌谱的研究,抗病毒、抗肿瘤机制的研究提供有价值的抗病动物模型.     

STK15转基因小鼠模型的建立

STK15基因是丝/苏氨酸激酶家族成员之一，其扩增和高表达能引起中心体复制扩增，染色体不稳定性增加，最终导致细胞的恶性转化，从而诱发恶性肿瘤。而且，STK15基因在多种恶性肿瘤组织中都具有高表达。目前，研究者们都是通过取人体不同部位的肿瘤组织来研究STK15基因与恶性肿瘤发生发展的关系，本次实验首次以建立STK15转基因小鼠模型，来进一步研究STK15基因与恶性肿瘤的关系，为今后的基因诊治提供理论基础。实验方法是首先提取人胚肺细胞总RNA作为模版，根据GenBank中STK15基因序列设计一对引物，用RT-PCR技术扩增出1200bp的STK15基因片段，克隆到pTZ57R/T载体，通过测序证实序列的正确性。用BamH1和XbaI双酶切载体pcDNA3.1和pTZ57R/T载体-STK15，然后回收、连接pcDNA3.1-STK15、转化、鉴定，从而成功构建了pcDNA3.1-STK15表达载体。然后对小鼠进行超排获得其原核期胚胎，应用显微注射法进行转基因操作，结果是注射成功率77%（701/907），移植鼠共30只，新生小鼠为106只，PCR检测转基因阳性为3只，经过Southern杂交检测有1只转基因阳性鼠，从而建立了转STK15的转基因小鼠模型。通过建立STK15肿瘤动物模型，找出与人类肿瘤相近的病理生理变化以及控制这些变化的遗传基础，为今后所有的恶性肿瘤的基因诊治提供坚实、有力的理论依据。     

乙肝病毒转基因小鼠品系的建立和饲养管理

采用受精卵原核显微注射的方法，成功获得稳定整合乙肝病毒基因组ＤＮＡ的转基因小鼠。经ＰＣＲ、Ｄｏｔ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ或Ｓｏｕｔｈｅｒｎ－ｂｌｏｔｔｉｎｇ等方法检测确认后的阳性鼠通过近交或回交的方式现已繁育到第７代，有望育成乙肝病毒转基因小鼠品系。     

脑内过表达胰岛素样生长因子结合蛋白-4转基因小鼠的建立

目的构建脑内过表达胰岛素样生长因子结合蛋白-4(insulin-like growth factor binding protein-4,IGFBP-4)的转基因小鼠,以研究IGFBP-4对脑发育的作用。方法构建神经元特异性启动子血小板源性生长因子β链(platelet derived growth factorβchain,PDGF-β)驱动的IGFBP-4表达载体,通过显微注射构建转基因小鼠。用PCR法检测小鼠子代基因组IGFBP-4 c DNA的整合情况,Western blotting法和免疫组织化学法观察IGFBP-4在脑内的表达丰度和分布,比较野生型和转基因小鼠的体质量和脑质量的改变。结果外源IGFBP-4 c DNA稳定整合于转基因小鼠基因组,IGFBP-4蛋白在成年小鼠脑内表达水平升高了267%,脑区IGFBP-4蛋白分布符合PDGF-β启动子驱动的蛋白表达特征,与野生型小鼠IGFBP-4部位相似。转基因小鼠体质量未见明显改变,整脑质量增加了8.4%(P<0.05),其中脑干增加了16.5%(P<0.05),其余脑区改变不明显。结论外源IGFBP-4转基因在小鼠基因组中得到整合并能稳定遗传和表达,并影响了部分脑区的发育,为脑发育研究提供了有价值的动物模型。     

心脏特异表达NOL3转基因小鼠的建立

目的 建立心脏特异表达NOL3转基因小鼠,用于研究该基因在心肌病发病中的作用.方法 Western blot检测小鼠NOL3表达谱.构建αMHC-NOL3表达载体,显微注射法建立NOL3转基因小鼠.PCR 鉴定转基因鼠的基因型,心脏超声检测转基因及野生型小鼠心脏功能及几何构型.结果 NOL3在1月龄野生型鼠心脏、脑、骨骼肌中的高表达,在心脏中的表达不随年龄而改变.通过转基因小鼠的筛选,得到了3个NOL3转基因品系,其中1个品系心脏NOL3蛋白表达量与野生型鼠相比明显增加.单转NOL3基因的小鼠心脏功能及几何构型与野生型小鼠相比无显著变化.结论 成功建立了心脏特异表达NOL3转基因小鼠,为进一步和心肌病小鼠模型杂交,研究该基因在心肌病发病中的作用提供了工具.     

人胰岛素转基因小鼠模型的建立

目的:建立人胰岛素的转基因小鼠模型.方法:通过原核显微注射法,把外源基因pEF1α-mINS注射入FVB种小鼠受精卵,胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠获得子代小鼠.结果:移植注射胚胎204枚给38只假孕小鼠共出生108只后代鼠,经PCR和Southern blot检测到5只阳性小鼠.结论:通过显微注射法使外源基因pEF1α-mINS在小鼠基因组中得到整合,建立了人胰岛素的转基因小鼠模型.     

土拨鼠肝炎病毒转基因小鼠模型的建立

目的:建立土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck hepatitis virus,WHV)转基因小鼠模型,以用于嗜肝病毒感染的发病机制研究。方法:采用微注射技术将1.3-倍WHV基因[野生型和WHV S抗原(WHV surface antigen,WHsAg)缺陷型]注射入C57BL/6xC3H小鼠的胚胎,然后与C57BL/6小鼠回交,建立WHV转基因小鼠。肝内WHV DNA复制和mRNA表达水平分别采用Southern杂交和real-time RT-PCR检测,血清中WHV病毒载量采用real-time PCR检测,HE染色进行肝组织病理学检测,ELISA检测血清中WHV核心抗体,流式细胞仪检测WHV核心抗原(WHV core antigen,WHcAg)特异性细胞毒性T淋巴细胞。结果:成功建立野生型WHV转基因小鼠和WHsAg缺陷型转基因小鼠。WHsAg缺陷型小鼠肝内WHV复制水平显著高于野生型小鼠,野生型WHV转基因小鼠血清WHV载量104¹08copies/mL。而且雄性小鼠肝内和血清WHV复制水平显著高于雌性小鼠。16周龄以上的WHV转基因小鼠约半数血清可检测出高滴度的WHV核心抗体。而且少数转基因小鼠可以检测到WHcAg特异性细胞毒性T淋巴细胞。结论:这种新建的WHV转基因小鼠肝内可检测到病毒复制和mRNA表达,血清有高水平的WHV病毒载量,可以用于嗜肝病毒感染的发病机制、抗病毒治疗等研究。     

乙型肝炎病毒核心抗原转基因小鼠的建立

目的：建立乙型肝炎病毒核心抗原（ayw亚型）转基因小鼠模型。方法：采用受精卵显微注射的方法制备转基因小鼠，以PCR、免疫组化和H－E染色法分析导入基因在小鼠基因组中的整合，肝脏中的表达及肝组织的病理变化。结果：得到6只基因组中整合了核心抗原基因的首建者（founder）小鼠，其中1只在肝细胞核和胞浆均有HBcAg的表达。将肝脏中表达的小鼠继续传代，F1代10只小鼠中的4只小鼠肝细胞有HBcAg的表达。结论：建立了乙型肝炎病毒核心抗原转基因小鼠，核心抗原基因能够在小鼠肝脏中表达，并且可以遗传。     

慢病毒介导HLA-G转基因小鼠的建立

目的以慢病毒作为载体建立HLA-G转基因小鼠,为研究HLA-G与移植免疫提供模型动物。方法利用FUW载体,构建含有HLA-G编码序列的慢病毒表达载体FUW-HLA-G。用磷酸钙沉淀法将包装质粒psPAX2、PMD2.G与重组慢病毒载体质粒FUW-HLA-G共转染293FT细胞,包装成慢病毒。通过同步转染含有绿色荧光标记基因的慢病毒质粒FUGW为参照,测定FUW-HLA-G病毒液的滴度。用显微注射法将浓缩后的病毒液注射至FVB/N小鼠1-细胞期胚胎透明带下,建立HLA-G转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因整合,用RT-PCR检测转基因在转录水平的表达,用Western blot检测HLA-G蛋白的表达。结果载体BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切结果和测序结果显示重组的慢病毒质粒与所设计的序列一致。浓缩和纯化后的病毒液滴度达到109TU/ml以上,符合用慢病毒制备转基因小鼠的要求。PCR筛选出阳性鼠6只,RT-PCR与Western blot检测结果表明HLA-G基因在F0和F1代转基因小鼠中均有表达。结论通过慢病毒介导的基因转移,成功建立了表达人HLA-G蛋白的转基因小鼠,为研究HLA-G的功能及其在器官或组织移植中的效应提供了动物模型。     

乙型肝炎病毒（ayw型）转基因小鼠的建立

目的：建立遗传上稳定的、带有乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ａｙｗ亚型的转基因小鼠品系。方法：通过对受精卵显微注射进行基因转移的途径制备转基因小鼠，以ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂产、ＥＬＩＳＡ、组织切片免疫组化和透射电镜等方法，分析所导入ＤＮＡ在转基因小鼠体内的功能情况。结果：得到２１只建立者小鼠，在它们的血清中检测到了ＨＢｓＡＧ和ＨＢｅＡｇ的存在，还在肝细胞中观察到了ＨＢＶ样病毒颗粒。结论：ＨＢＶ基因组ＤＮ     

人乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠模型的建立

目的 建立人乙型肝炎病毒ｘ（ＨＢｘ）基因转基因小鼠模型。方法 用显微注射法制备转基因小鼠,用分子杂交法鉴定转基因小鼠ＨＢｘ的整合与表达。结果 建立了人ＨＢｘ的基因转基因小鼠模型。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定得到１７只转基因首建鼠。逢肝脏提取总ＲＮＡ进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交,结果显示１７只首建鼠肝脏中均有ＨＢｘ表达。结论 为从整体水平研究慢性乙肝炎患者诱发肝癌的作用机制及ＨＢｘ的反式激活作用机制提供了     

突变DJ-1转基因小鼠模型的建立

目的 探讨DJ-1~(L166P)突变基因在帕金森病发生中的作用.方法 构建pcDNA3.1-myc-his-DJ-1~(L166P)真核表达载体,利用显微注射方法将DJ-1~(L166P)基因片段(约3.9 kb)导入BDF1小鼠受精卵雄原核并移植到同期受孕的ICR假孕母鼠输卵管中,对产出仔鼠的鼠尾组织DNA进行聚合酶链反应和Southern blot检测,对Southern blot鉴定阳性的转基因小鼠进行逆转录聚合酶链反应和Western blot检测.结果 共产生20只子代小鼠,1号和7号为DJ-1~(L166P)转基因阳性小鼠.1号转基因小鼠大脑、小脑、肝、肺、肾、睾丸有不同程度的DJ-1 mRNA表达,均高于正常对照小鼠,但只有大脑中DJ-1 mRNA的表达水平显著高于正常对照小鼠(P<0.05);7号转基因小鼠只有肝、肺组织中有DJ-1 mRNA表达,也高于正常对照小鼠,但差异无统计学意义.只有1号小鼠大脑有His标签蛋白的表达.结论 成功获得1只DJ-1~(L166P)基因突变转基因小鼠模型,为课题的下一步实验研究打下良好的基础.     

PiggyBac转座酶转基因小鼠模型的建立

目的 建立表达PiggyBac转座酶转基因小鼠模型,为研究PiggyBac转座子介导基因修饰在小鼠中的应用提供工具。方法利用Cytomegalovirus (CMV) 启动子驱动PiggyBac转座酶基因的表达,经显微注射法建立C57BL/6J表达PiggyBac转座酶的转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因型,RT-PCR检测PiggyBac转座酶在小鼠生殖系睾丸中的表达情况。PiggyBac转座酶转基因小鼠活性的检测,是通过与转座子供体转基因小鼠杂交检测供体位置变化来确定的。结果显微注射产生7只转基因小鼠并能传代,经RT-PCR筛选出一株在睾丸中相对高表达PiggyBac转座酶的转基因小鼠。随后与转座子供体转基因小鼠杂交,子代双阳小鼠与野生型小鼠杂交基因型分离,产生的子代转座子供体单阳性小鼠中具有转座子供体片段的转座反应。结论成功建立了表达PiggyBac转座酶转基因小鼠动物模型,该模型为PiggyBac转座子技术在小鼠中的应用提供了有价值的工具动物。